Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Les légumineuses font parties des familles les plus cultivées à la fois pour l'alimentation humaine et pour l'alimentation animale. Une des maladies principales de la luzerne (Medicago sativa), plante fourragère la plus cultivée au monde, est la verticilliose causée par Verticillium alfalfae, un champignon du sol. Sans traitements phytosanitaires efficaces et pratiques pour les maladies causées par des pathogènes du sol, la protection des cultures passe par la sélection de variétés résistantes. Dans cette thèse, la légumineuse modèle Medicago truncatula a été utilisée afin d'identifier des gènes candidats à la résistance quantitative à Verticillium alfalfae V31-2 (Va V31-2). La première étape de ces travaux a révélé des sources de résistance à la souche Va V31-2 au sein de l'espèce M. truncatula. Pour cela, 261 lignées (dont 246 accessions issues du projet MtHapMap) ont été inoculées et le développement de flétrissements foliaires a été suivi pendant quatre semaines, suivi d'un réisolement du pathogène à partir des parties aériennes. Ces analyses ont révélé une grande biodiversité de réponse à la verticilliose au sein de l'espèce Medicago truncatula, avec une variabilité inter et intra-populations. Dans une seconde partie, des QTL pour la résistance partielle à la verticilliose ont été identifiés par génétique d'association (GWAS) permettant la découverte de nouveaux QTL de résistance à Va V31-2 et la confirmation de la présence d'un QTL majeur sur le chromosome 7 précédemment décrit. Selon les phénotypes de maladie utilisés pour l'étude de GWAS, les QTL détectés sont différents, ce qui suggère des contrôles génétiques différents pour l'évolution des symptômes de maladie et la colonisation des parties aériennes par Va V31-2. Une seconde analyse de GWAS menée sur 90 accessions de la population tunisienne Soliman a révélé des gènes candidats différents de ceux identifiés à partir de la collection MtHapmap, suggérant une possible adaptation locale. La validation fonctionnelle de gènes candidats pour la résistance partielle a été entamée, en privilégiant ceux situés sur le chromosome 7, à la convergence de différentes études génétiques. La mise en place d'un système d'inoculation in vitro de racines transgéniques a permis de révéler le rôle du gène Medtr7g070480 codant pour une protéine SEC14 dans la résistance à Va V31-2. L'extinction de l'expression de ce gène par microARN artificiel dans le génotype A17 (résistant) et F83005.5 (sensible) diminue la colonisation des racines par Va V31-2, alors que sa surexpression augmente la colonisation chez A17 : il s'agirait donc d'un gène de sensibilité. L'unique polymorphisme génétique entraînant une substitution non synonyme entre A17 et F83005.5 explique 18,5% de la variation du niveau de résistance observée au sein des 246 accessions MtHapmap. L'étude de l'expression racinaire du gène MtSEC14 24 heures après inoculation par Va V31-2 dans un panel de 14 accessions sensibles et résistantes n'a pas montré de différences significatives entre ces deux types d'accessions. En parallèle, des gènes orthologues aux gènes candidats à la résistance à V. alfalfae ont été identifiés chez d'autres plantes modèles (Lotus japonicus, Arabidopsis thaliana, Nicotiana sp.), puis la pathogénicité de Va V31-2 a été testée chez ces espèces en vue de leur éventuelle utilisation pour valider le rôle de ces gènes. Un unique orthologue à MtSEC14 a également été identifié chez Medicago sativa. Grâce à la synténie entre M. truncatula et M. sativa, nos travaux pourront très probablement être transférés à la luzerne cultivée. A notre connaissance, ces travaux mettent en évidence pour la première fois le rôle d'un gène de sensibilité dans une résistance partielle à un micro-organisme chez les Légumineuses. / Pathogens, animals and weeds are responsible for losses ranging from 20% to 40% of global agricultural yield. Legumes are the second most grown crops after cereals as human and animal food, and their yield is also affected by pathogens. Verticillium alfalfae is a soil-borne pathogen causing high yield losses in alfalfa fields (Medicago sativa), the most worldwide legume forage crop grown. To date, there is no chemical control and crop breeding is the best way to protect alfalfa against V. alfalfae. However, Medicago sativa has a complex genome (allogamous and tetraploid), therefore in this work the model legume Medicago truncatula (diploid and self-fertile) was used to investigate genetic mechanisms involved in V. alfalfae V31-2 (Va V31-2) resistance. First, several sources of resistance were identified in M. truncatula biodiversity by assessing disease symptoms development in 261 lines from the Mediterranean basin inoculated by V. alfalfae V31-2. Reisolation of V. alfalfae V31-2 in M. truncatula stems was also led. These analyses revealed a great biodiversity of M. truncatula response towards Va V31-2. A genome wide association study (GWAS) on various disease phenotypes pinpointed several quantitative trait loci (QTL): one of them colocalized with a previous major QTL on chromosome 7 detected on LR4 and LR5 RILs populations. Both phenotypic and genetic analyses thus suggest the occurrence of different resistance mechanisms in M. truncatula populations towards V. alfalfae. Resistant candidate genes towards Va V31-2 were also identified by GWAS using 90 accessions of M. truncatula Soliman Tunisian population. These candidate genes are different from the pinpointed candidate gene of our previous GWAS analysis. These results might underline a local adaptation towards Verticillium. Consistencies between GWAS results with previous QTL and transcriptomic data led us to perform the functional validation with the candidate genes localized on chromosome 7. An original in vitro inoculation system of M. truncatula transgenic roots was used to validate Medtr7g070480 (gene encoding a SEC14 protein) as a key player towards V. alfalfae V31.2 in M. truncatula. Silencing the SEC14 gene using artificial microRNA in A17 (resistant) and F83005.5 (susceptible) lines decreases Va V31-2 colonization rate on transgenic roots whereas overexpressing MtSEC14 increases the colonization rate in A17. This MtSEC14 gene appears as a disease susceptibility gene. Moreover, 18.5% of the disease variation in the studied M. truncatula accessions is explained by the unique non-synonymous polymorphism between A17 and F83005.5 in MtSEC14. Root expression patterns of the SEC14 gene one day after inoculation by Va V31-2 was also analyzed in response to inoculation among a panel of 14 susceptible and resistant M. truncatula accessions of diverse geographic origins. No significant differences were found. At the same time, orthologous resistance candidate genes towards Va V31.2 in several other model species (Lotus japonicus, Arabidopsis thaliana, Nicotiana sp.) were discovered. Pathogenicity of Va V31-2 in these species was monitored to use them as potential model for functional validation. Only one orthologous gene of MtSEC14 has been identified in Medicago sativa. Because of a great synteny between M. truncatula and M. sativa, our work could be useful for alfalfa breeding. In this work and for the first time, a susceptibility gene involved in a quantitative resistance against microorganisms in Legumes was identified.

Les moustiques sont vecteurs de nombreuses maladies humaines et animales. Leur contrôle représente donc un enjeu de santé publique au niveau mondial. Dans la plupart des pays tropicaux, le contrôle efficace des populations de moustiques dépend de l'utilisation d'insecticides chimiques ciblant les adultes ou les larves. Cependant, des phénomènes de résistance aux quatre principales classes d'insecticides chimiques couramment utilisées, menacent aujourd'hui les programmes de lutte anti-vectorielle. Dans ce contexte, il est urgent de trouver des alternatives aux insecticides conventionnellement utilisés.-moustiques. Durant cette thèse, j'ai étudié l'utilisation potentielle du néonicotinoïde imidaclopride dans le contrôle des populations de moustiques. Je me suis plus particulièrement intéressé à l'identification des mécanismes de résistance métabolique, à la mise en évidence de résistances croisées avec d'autres insecticides ainsi qu'à l'étude de l'impact des polluants environnementaux sur la tolérance à l'imidaclopride. Pour ce travail, le moustique Aedes aegypti a été utilisé comme une espèce modèle. La tolérance basale d'Ae. aegypti à l'imidaclopride a d'abord été évalué chez les larves et adultes. L'effet d'une exposition larvaire à une dose sub-létale d'imidaclopride sur une seule génération a ensuite été étudié au niveau toxicologique et moléculaire à l'aide de profils transcriptomiques. Les expositions larvaires à des doses sub-létales ont également été utilisées pour identifier les interactions potentielles entre l'imidaclopride, les insecticides chimiques et des polluants environnementaux. A long terme, la réponse adaptative du moustique Ae. aegypti à l'imidaclopride a été étudiée sur plusieurs générations en sélectionnant au laboratoire une souche sensible aux insecticides (souche Bora-Bora) avec de l'imidaclopride durant le stade larvaire pendant 14 générations. Cette sélection artificielle a permis d'obtenir la souche Imida-R. Cette souche présente une résistance accrue à l'imidaclopride chez les larves alors qu'aucune résistance significative n'a été détectée chez les adultes. Les mécanismes de résistance ont ensuite été étudiés en utilisant diverses approches, y compris l'utilisation d'inhibiteurs d'enzymes de détoxication, la mesure des activités de biotransformation et l'étude des profils transcriptomiques par puces à ADN et séquençage massif des ARNm. Plusieurs familles de protéines potentiellement impliquées dans la résistance ont été identifiées, notamment les enzymes de détoxification et les protéines cuticulaires. Parmi les gènes de détoxication, 8 cytochromes P450 et 1 glutathion S-transférase apparaissent comme des candidats pouvant jouer un rôle dans le métabolisme de l'imidaclopride. Le rôle des cytochromes P450 dans la résistance élevée de la souche Imida-R a été confirmée in vitro par des études comparatives du métabolisme de l'imidaclopride par des fractions microsomales des souches sensibles et Imida-R. Au niveau génique, la modélisation de liaison du substrat a permis de restreindre le panel des cytochromes P450 candidats. De façon concomitante, l'expression hétérologue d'un P450 a été effectuée et sa capacité à métaboliser l'imidaclopride a été confirmée. Des bioessais avec d'autres insecticides ont révélé une résistance croisée aux autres néonicotinoïdes chez la souche Imida-R au stade larvaire, ainsi qu'à un inhibiteur de croissance des insectes et dans une moindre mesure au DDT confirmant le rôle probable des enzymes de détoxication. Le relâchement de la pression de sélection sur la souche Imida-R durant quelques générations a entraîné une diminution rapide de la résistance, suggérant un coût métabolique. L'étude comparative de l'inductibilité des gènes de détoxication par l'imidaclopride dans les souches sensible et résistante a révélé une plus grande induction de ces gènes dans la souche résistante, suggérant à la fois la sélection d'une expression constitutive élevée mais également une plus grande plasticité phénotypique de ces enzymes dans la souche Imida-R. Enfin, le rôle potentiel des protéines cuticulaires dans la résistance a été étudié de manière préliminaire en exposant les larves à un inhibiteur de synthèse de la chitine, avant d'effectuer des bioessais. Dans l'ensemble, bien que ce travail de recherche nécessite d'autres expériences de validation fonctionnelle, les données obtenues fournissent une meilleure compréhension des mécanismes de résistance à l'imidaclopride chez les moustiques et permettent de discuter de son utilisation potentielle comme une alternative aux insecticides conventionnellement utilisés en lutte anti-vectorielle.

Résumé trop long / Mosquitoes transmit several human and animal diseases and their control represents a public health challenge worldwide. In most tropical countries, efficient control of mosquitoes relies on the use of chemical insecticides targeting adults or larvae. However, resistance to the four main classes of chemical insecticides has been reported worldwide and threatens vector control programs. In this context, there is an urgent need to find alternatives to conventional insecticides used in vector control. In this thesis, I explored the potential use of the neonicotinoid insecticide imidacloprid for mosquito control, focusing on the identification of metabolic resistance mechanisms, cross-resistance with other insecticides and the impact of environmental pollutants on imidacloprid tolerance. The mosquito Aedes aegypti was used as a model species for this research work. Basal tolerance of Ae. aegypti to imidacloprid was first evaluated at the larval and adult stages. Effects of a larval exposure across a single generation to a sub-lethal dose of imidacloprid were then investigated at the toxicological and molecular levels using transcriptome profiling. Short sub-lethal exposures were also used to identify potential cross-responses between imidacloprid, other chemical insecticides and anthropogenic pollutants. Long-term adaptive response of Ae. aegypti to imidacloprid was then investigated across several generations by selecting an insecticide-susceptible strain (Bora-Bora strain) with imidacloprid at the larval stage for 14 generations in the laboratory. Such artificial selection allowed obtaining the Imida-R strain. This strain showed an increased resistance to imidacloprid in larvae while no significant resistance was measured in adults. Resistance mechanisms were then investigated using various approaches including the use of detoxification enzyme inhibitors, biochemical assays and transcriptome profiling with DNA microarray and massive mRNA sequencing. Several protein families potentially involved in resistance were identified including detoxifications enzymes and cuticle proteins. Among the formers, 8 cytochrome P450s and 1 glutathione S-transferase appears as good candidates for a role in imidacloprid metabolism. The role of P450s in the elevated resistance of the Imida-R strain was confirmed by comparative P450-dependent in vitro metabolism assays conducted on microsomal fractions of the susceptible and Imida-R strains. At the gene level, substrate binding modeling allowed restricting the panel of P450 candidates. Meantime, heterologous expression of one P450 was performed and its ability to metabolize imidacloprid confirmed. Bioassay with other insecticides revealed potential cross-resistance of the Imida-R at the larval stage to other neonicotinoids but also to an insect growth inhibitor and in a lesser extent to DDT, confirming the probable role of detoxification enzymes. Relaxing the selection pressure of the Imida-R strain for few generations led to a rapid decrease of resistance, suggesting a cost of resistance mechanisms. Comparing the inducibility of candidate detoxification genes by imidacloprid in susceptible and resistant strains revealed a higher induction of these genes in the resistant strain, suggesting the selection of both a higher constitutive expression but also a greater phenotypic plasticity of these enzymes in the Imida-R strain. Finally, the potential role of cuticle protein in resistance was preliminary investigated by exposing larvae to a chitin synthesis inhibitor before bioassays. Overall, although this research work requires additional functional validation experiments, these data provide a better understanding of imidacloprid resistance mechanisms in mosquitoes and its potential use as an alternative to conventional insecticides in vector control.

Les interactions plante-virus diffèrent des autres interactions plante-pathogènes du fait de la nature des virus qui sont des parasites intracellulaires obligatoires. Plus spécifiquement, l’interaction haricot commun (Phaseolus vulgaris L.)-Bean pod mottle virus (BPMV) a été étudiée en mettant l’accent à la fois sur la résistance de la plante mais aussi sur la virulence du virus dans l’objectif de mieux comprendre et d’identifier les facteurs intervenant dans le dialogue moléculaire entre plante et virus. Ces deux partenaires interagissent selon le modèle «gène-à-gène» de Flor. 1) Côté plante, nous avons identifié un gène de résistance dominant vis-à-vis du BPMV chez BAT93, le gène R-BPMV. Ce gène est localisé à l’extrémité du chromosome Pv02, dans la région du locus I, un locus de résistance multi-parasitaire vis-à-vis de différents virus, bactérie et champignon. La cartographie fine du gène R-BPMV suivie du séquençage de la région à partir d’un contig de clones BACs chez BAT93 a permis d’identifier des séquences codant pour des protéines NB-LRR qui pourraient correspondre au gène R-BPMV. Des études de microsynténie et de phylogénie ont été réalisées afin de mieux comprendre l’évolution des gènes présents dans cette région. L’étude au niveau cellulaire du phénotype associé à la résistance a permis de montrer que le gène R-BPMV bloque le mouvement de cellule à cellule du virus et que le phénotype associé est température-dépendant. 2) Côté virus, le clonage de toutes les ORFs du BPMV associé à des expériences d’agroinfiltration sur P. vulgaris et Nicotiana benthamiana ont permis d’identifier deux facteurs viraux importants dans le dialogue moléculaire plante-virus : la protéine VPg du BPMV correspond à la protéine d’avirulence agissant en interaction avec le produit du gène R-BPMV dans le cadre du modèle «gène-à-gène», et l’ARN polymérase ARN-dépendante virale correspond à un suppresseur de silencing à effet faible. 3) A ce jour, la transformation génétique stable n’est pas applicable en routine chez les légumineuses. Un objectif de la thèse est de développer des outils de validation fonctionnelle pouvant s’appliquer à des gènes d’intérêt agronomique, dont des gènes de résistance aux maladies. L’approche VIGS basée sur un vecteur viral dérivé du BPMV, déjà utilisée chez le soja, a ainsi été adaptée sur haricot et pois (Pisum sativum), une légumineuse économiquement importante en Europe. / Plant-virus interactions differ from other plant-pathogen interactions because viruses are obligate intracellular parasites. More specifically, common bean (Phaseolus vulgaris L.)-Bean pod mottle virus (BPMV) interaction was studied by focusing both on the plant resistance and on the virus virulence in order to highlight and identify factors involved in the molecular dialog between plant and virus. These two partners interact according to the “gene-for-gene” model described by Flor. 1) On the plant side, we identified a dominant resistance gene against BPMV in cv. BAT93, the R-BPMV gene. This gene is located at one end of chromosome Pv02 in the I locus region, a multi-parasitic resistance locus involved in resistance to different viruses, bacteria and fungi. Fine mapping of R-BPMV followed by sequencing of the region from a BACs contig in BAT93 allowed us to identify sequences encoding NB-LRR proteins that could correspond to R-BPMV. Microsynteny and phylogeny studies were performed to understand the evolution of genes present in this region. When resistance phenotype was studied at the cellular level, we found that R-BPMV blocks BPMV cell-to-cell movement and that resistance phenotype is temperature-dependent. 2) On the virus side, cloning of all BPMV ORFs in association with agroinfiltration assays in P. vulgaris and Nicotiana benthamiana allowed us to identify two important factors involved in plant-virus molecular dialog: the BPMV VPg acting as an avirulence factor in interaction with the product of R-BPMV in the “gene-for-gene” model, and the viral RNA-dependent RNA polymerase that corresponds to a weak RNA silencing suppressor. 3) To date, stable genetic transformation is not routinely feasible in legumes. One objective of this thesis was to develop news tools for functional validation studies for genes of agronomic interest, including disease resistance genes. The VIGS approach based on the viral BPMV vector, first used in soybean, was adapted to common bean and pea (Pisum sativum), a legume species of high economic importance in Europe.

Les travaux présentés dans ce mémoire de thèse s'intéressent à la validation fonctionnelle de contrôleurs logiques par des techniques de test de conformité et de validation en boucle fermée. Le modèle de spécification est décrit dans le langage industriel Grafcet et le contrôleur logique est supposé être un automate programmable industriel (API) mono-tâche. Afin de contribuer à ces techniques de validation fonctionnelle, ces travaux présentent : - Une extension d'une méthode de formalisation du Grafcet par traduction sous la forme d'une machine de Mealy. Cette extension permet de produire un modèle formel de la spécification lorsque le Grafcet est implanté selon un mode d'interprétation sans recherche de stabilité, qui n'est pas préconisé dans la norme IEC 60848 mais largement utilisé dans les applications industrielles. - Une contribution au test de conformité par la définition d'un ensemble de relations de conformité basées sur l'observation de plusieurs cycles d'exécution pour chaque pas de test. - Une contribution à la validation en boucle fermée par la définition d'un critère de fin d'observation et par une technique d'identification en boite grise pour la construction et l'analyse du système en boucle fermée. / The results presented in this PhD thesis deal with functional validation of logic controllers using conformance test and closed-loop validation techniques. The specification model is written in the Grafcet language and the logic controller is assumed to be a Programmable Logic Controller (PLC). In order to contribute to these validation techniques, this thesis presents: - An axtension to a fomalization methods for Grafcet languages by translation to a Mealy machine. This extension generates a formal model of a Grafcet specification that is interpreted without search of stability. This mode of interpretation is not recommended by the standard IEC 60848 but is widely used in industrial applications. - A contribution to conformance test by a definition of a set of conformance relation based on the observation of several execution cycles for each test step. - A contribution to closed-loop validation by the definition of a termination criterion and by a new gray-box identification technique that is used for construction and analysis of the closed-loop system.

L’instabilité des séquences répétées microsatellites du génome (courtes répétitions en tandem d’un à cinq nucléotides) est une conséquence de l’inactivation du système MMR (MisMatch Repair), en charge de la réparation des erreurs produites au cours de la réplication de l’ADN. Cette instabilité est associée à un processus de transformation cellulaire original, observé chez l’homme dans des pathologies tumorales fréquentes, nommées MSI (pour Microsatellite Instability). Les localisations primaires les plus fréquentes de ces tumeurs sont le côlon, l’endomètre et l’estomac. Elles peuvent avoir une origine héréditaire (prédisposition familiale ; syndrome de Lynch et apparentés), mais sont dans la majorité des cas de survenue sporadique. La transformation des cellules MMR-déficientes s’observe dans le contexte de l’accumulation de nombreuses mutations somatiques dans l’ADN tumoral. Certaines ont un caractère oncogénique en favorisant la troncature et la perte de fonction de gènes suppresseurs de tumeur ou apparentés, impliqués dans des voies de signalisations diverses et qui contiennent des microsatellites codants (mutations indels d’une à deux paires de base, décalant le cadre de lecture, fréquemment rapportées dans ces tumeurs). Les travaux présentés dans le cadre de mon doctorat visent à mieux comprendre le rôle de l’instabilité microsatellitaire dans la tumorigenèse MSI. Ils s’inscrivent dans le contexte du décryptage et de l’analyse des données de séquençage d’exome de 47 cancers colorectaux primitifs MSI. Dans le contexte d’un niveau élevé d’instabilité génomique caractérisant ces tumeurs, la mise au point par mon laboratoire d’accueil de modèles probabilistes a permis de dresser une liste restreinte de gènes, remarquables par le fait qu’ils sont affectés par des mutations somatiques dont les fréquences sont exceptionnellement élevées ou basses dans l’ADN tumoral. Sous l’hypothèse que de tels évènements somatiques affectent des gènes clés de la tumorigenèse MSI colique, j’ai focalisé mes recherches sur les gènes dont les altérations sont peu fréquentes. Brièvement, j’ai pu démontrer le caractère délétère d’un petit nombre d’altérations microsatellitaires codantes dont la survenue semble soumise à une pression de sélection négative (N=13). Mes résultats indiquent que ces mutations semblent fragiliser le phénotype tumoral des cellules dans lesquelles elles surviennent, la perte de fonction des gènes qu’elles affectent conduisant à diverses conséquences délétères en fonction du gène candidat (e.g. sensibilisation à la mort cellulaire, perte des capacités proliférative et migratoire, ralentissement de la croissance tumorale). Ces résultats rapportent pour la première fois et à grande échelle, la sélection négative de mutations dans des tumeurs à forte instabilité génomique MSI. Ils ouvrent de nouvelles voies pour la compréhension de ce mode particulier de transformation cellulaire, et sont potentiellement d’intérêt pour la mise au point de thérapies personnalisées pour les patients. / Since the discovery of a link between mismatch repair (MMR) deficiency and cancer, microsatellite instability (MSI) is thought as a process underlying cell transformation and tumour progression and invasion. MSI tumours are a subset of frequent human neoplasms, both inherited and sporadic, associated with several primary locations (colon, stomach, endometrium…). In MMR-deficient cells, MSI generates hundreds of frameshift mutations in genes (MSI Target Genes, MSI-TGs) containing coding microsatellite sequences (e.g. -1/+1 bp, insertions/deletions, i.e. indels). Some of these mutations affect genes with a role in human carcinogenesis and are thus expected to promote the MSI-driven tumorigenic process. During my PhD, I aimed to decipher the role of MSI in colon tumorigenesis. I exploited exome-sequencing data available in my lab that were generated from the analysis of a series of 47 human MSI primary colorectal cancer (CRC). Through biostatistics analysis and mathematical models that we designed to interpret mutation rates in the context of the high background for instability characterizing MSI in CRC, we identified a few microsatellites containing genes coding mutations that were negatively selected in MSI colon tumours (N=13). Under the hypothesis that these events may have a negative impact in colon tumorigenesis, I demonstrated that the silencing of these MSI target genes (siRNA/shRNA) was deleterious for MSI cancer cells using in vitro and in vivo models (impairment of proliferation and/or migration and/or response to chemotherapy and/or tumour growth) (Jonchère*, Marisa*, Greene* et al., submitted).

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