Ph.D. (Botany) / Some biochemical, physiological and ultrastructural changes in senescing rose petals of Rosa hydrida L. cultivar 'Sonia ' were determined. Quantitative determinations of changes in starch content, total free reducing sugar concentration and the total free amino acid concentration were carriedout. Changes in membrane permeability (determined as percentage apparent free space - %AFS) and cell ultrastructure (determined electron microscopically) were also examined in order to compare physiological and cytological events. The respiration climacteric was used as a standard for determining the degree of senescence.

The green alga, Selenastrum capricornutum, was cultured in artificial nutrient medium utilizing five-gallon carboys, each of which contained 16 1. of culture. The algal cells were separated from the nutrient medium by continuous-flow centrifugation at 7500 RPM, and were then lyophilized. The lyophilized cells were extracted by refluxing with ether, acetone, and chloroform:methanol (2:1). Free sterols and sterol esters were separated from the crude extract using preparative thin-layer chromatography. Sterol esters were saponified and both the sterols and the fatty acids were recovered. Individual sterols were separated from the free sterol fraction using argentation thin-layer chromatography. Gas chromatograms, mass spectra, and ultraviolet spectra were obtained for these sterols. The free sterol fraction was found to contain approximately 40% 24-methylcholesta-5,7-dien-3B-ol and 60% 24-ethylcholesta-5,7-dien-3B-ol. The sterol ester fraction also contained these two sterols; however, the composition and amount of esterified sterols varied as a function of culture age. Sterol ester content was higher for older cultures, and in older cultures the composition of the esterified sterols more closely resembled that of the free sterols. The fatty acids obtained from the saponification of the sterol esters were methylated and were analyzed using gas chromatography. Tentative identifications, based upon comparative retention times, were made for several of these acids. Sterols were extracted from the nutrient medium after harvest of the algal cells. Extraction was accomplished by mixing large quantities of nutrient medium with ether for several days, or by shaking small aliquots with ether. 24-methylcholesta-5,7-dien-3B-ol and 24 ethylcholesta-5,7-dien-3B-ol were isolated from the nutrient medium in approximately the same relative amounts as from the algal cells. The concentration of sterols in the nutrient medium was approximately equal to the water-solubility of cholesterol (25-29)t g./l.). Extraction procedures which release sterols from water soluble complexes were carried out on extracted cells and on extracted nutrient medium. These procedures failed to yield measurable quantities of sterols. Treatment of extracted cells with strong base and subsequent extraction showed that all sterols had been extracted without prior cell lysis or pretreatment. An extraction of algal cells was carried out using DMSO:ether as the extraction solvent. This extraction resulted in complete removal of sterols from the cells, and the sterols were accompanied by only small amounts of other lipidsoluble material.

Testes de toxicidade crônica, analisando a inibição de crescimento algáceo após 96 horas, foram realizados a fim de conhecer a sensibilidade de Raphidocelis subcapitata (conhecida como Selenastrum capricornutum), ao sulfato de cobre (CuSO4.5H2O) e do sulfato de zinco (ZnSO4.7H2O). A inibição do crescimento algal seguiu uma tendência exponencial negativa em função do aumento de concentração das duas substâncias, sendo descrita através das seguintes equações: y = 6257208,7. e-5,581.Cu; y = 7003223,1. e- 5,452.Zn; onde y é o número de células de R. subcapitata após 96 horas de exposição a diferentes concentrações de sulfato de cobre e sulfato de zinco, respectivamente. Valores de CE(I)50 demonstraram maior sensibilidade de R. subcapitata ao sulfato de cobre (CE(I)50;96h=0,154 mg.L-1) quando comparada com sulfato de zinco (CE(I)50;96h=0,215 mg.L-1). A densidade algácea foi determinada através de contagem celular e por técnica espectrofotométrica. Foi obtida uma curva de calibração para estimativa de densidade algácea correlacionando valores de absorbância e número de células por contagem, em 684 nm. A curva foi determinada através de um modelo empírico: y = 7,2578.10-8 . x1,0219 (n=130; r2=0,9998); onde y é a medida de absorbância e x é o número de células. A análise de resíduos demonstrou que a equação pode ser utilizada até a densidades de 5.000.000 de células e valores de absorbância até 0,5.

Testes de toxicidade crônica, analisando a inibição de crescimento algáceo após 96 horas, foram realizados a fim de conhecer a sensibilidade de Raphidocelis subcapitata (conhecida como Selenastrum capricornutum), ao sulfato de cobre (CuSO4.5H2O) e do sulfato de zinco (ZnSO4.7H2O). A inibição do crescimento algal seguiu uma tendência exponencial negativa em função do aumento de concentração das duas substâncias, sendo descrita através das seguintes equações: y = 6257208,7. e-5,581.Cu; y = 7003223,1. e- 5,452.Zn; onde y é o número de células de R. subcapitata após 96 horas de exposição a diferentes concentrações de sulfato de cobre e sulfato de zinco, respectivamente. Valores de CE(I)50 demonstraram maior sensibilidade de R. subcapitata ao sulfato de cobre (CE(I)50;96h=0,154 mg.L-1) quando comparada com sulfato de zinco (CE(I)50;96h=0,215 mg.L-1). A densidade algácea foi determinada através de contagem celular e por técnica espectrofotométrica. Foi obtida uma curva de calibração para estimativa de densidade algácea correlacionando valores de absorbância e número de células por contagem, em 684 nm. A curva foi determinada através de um modelo empírico: y = 7,2578.10-8 . x1,0219 (n=130; r2=0,9998); onde y é a medida de absorbância e x é o número de células. A análise de resíduos demonstrou que a equação pode ser utilizada até a densidades de 5.000.000 de células e valores de absorbância até 0,5.

Testes de toxicidade crônica, analisando a inibição de crescimento algáceo após 96 horas, foram realizados a fim de conhecer a sensibilidade de Raphidocelis subcapitata (conhecida como Selenastrum capricornutum), ao sulfato de cobre (CuSO4.5H2O) e do sulfato de zinco (ZnSO4.7H2O). A inibição do crescimento algal seguiu uma tendência exponencial negativa em função do aumento de concentração das duas substâncias, sendo descrita através das seguintes equações: y = 6257208,7. e-5,581.Cu; y = 7003223,1. e- 5,452.Zn; onde y é o número de células de R. subcapitata após 96 horas de exposição a diferentes concentrações de sulfato de cobre e sulfato de zinco, respectivamente. Valores de CE(I)50 demonstraram maior sensibilidade de R. subcapitata ao sulfato de cobre (CE(I)50;96h=0,154 mg.L-1) quando comparada com sulfato de zinco (CE(I)50;96h=0,215 mg.L-1). A densidade algácea foi determinada através de contagem celular e por técnica espectrofotométrica. Foi obtida uma curva de calibração para estimativa de densidade algácea correlacionando valores de absorbância e número de células por contagem, em 684 nm. A curva foi determinada através de um modelo empírico: y = 7,2578.10-8 . x1,0219 (n=130; r2=0,9998); onde y é a medida de absorbância e x é o número de células. A análise de resíduos demonstrou que a equação pode ser utilizada até a densidades de 5.000.000 de células e valores de absorbância até 0,5.

Copper toxicity was investigated using the green alga, Selenastrum capricornutum. Two major areas were investigated: the forms of copper which are toxic to growth of the alga and factors that can change the concentration of free copper, Cu2+ (aq), in the growth medium during the logarithmic growth of the organism. This research has shown that S. capricornutum is sensitive to the free Copper ion, Cu 2+ (aq), irrespective of the total copper concentration.

This study determines the effects of variations in suspended biomass, organic carbon, and pH on the time course of 2,2$ sp prime$,4,4$ sp prime$,5,5$ sp prime$-hexachlorobiphenyl uptake by laboratory cultures of Selenastrum capricornutum. Variations in pH had no effect, but uptake was enhanced by higher levels of biomass and depressed by higher levels of organic carbon. The coefficients for these measured effects on hexachlorobiphenyl were combined with existing relations based on molecular connectivity (X) or capacity ratio (K$ sp prime$) to yield semi-empirical equations to predict the instantaneous rate of uptake and bioconcentration factor (BCF) of organic contaminants as: eqalign{& rm Log rate = {-}3.30 + 0.32 X + 1.1 Log biomass {-}0.42 Log Abs cr& rm Log BCF = 4.11 + 0.86 Log K sp prime {-}0.87 Log biomass {-}0.22 Log Abs cr} / The utility of these equations was assessed by comparing time courses of hexachlorobiphenyl uptake predicted from them with time courses observed in water from eleven Quebec lakes.

The green alga, Selenastrum capricornutum Printz, was used in an algal bioassay to determine the toxic properties of copper in various natural lake waters of Oregon. Lake water was collected and brought back to the laboratory where it was treated with various copper concentrations and inoculated with a cell suspension of the test alga. Growth of the alga was determined by direct cell counts. The copper ion activity, pH, and absorbance of the test cultures were also determined. The growth of the alga was ·found to depend upon the water tested and also upon the copper concentration used.

No description available.

Orientador: Hiroshi Aoyama / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-04T22:35:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Jonsson_ClaudioMartin_D.pdf: 891938 bytes, checksum: c636143a4bde0645fb4a629221db8dd0 (MD5) Previous issue date: 2005 / Resumo: Selenastrum capricornutum é uma alga clorofícea unicelular mundialmente distribuída em corpos de água doce e solos. Devido a sua natureza cosmopolita, o seu uso em estudos de ecotoxicidade é recomendado por protocolos nacionais e internacionais. A fosfatase ácida de algas desempenha importantes funções metabólicas tais como decomposição de fosfato orgânico em fosfato inorgânico, processos autofágicos, reciclagem de material celular e formação do zigoto durante a reprodução. Agentes químicos introduzidos em compartimentos ambientais em decorrência da atividade agrícola, tais como agrotóxicos e contaminantes de lodo usado como fertilizante, podem alterar a atividade da enzima nesses produtores primários. No presente trabalho foram estudados a extração, estabilidade, especificidade por substratos, efeito de inibidores e cinética da fosfatase ácida do extrato bruto de Selenastrum capricornutum. Foi também avaliado o efeito in vitro de 30 poluentes de origem agrícola (24 orgânicos e 6 metais pesados), sendo que experimentos mais detalhados in vitro e estudos in vivo, foram realizados com os agentes que promoveram maior efeito inibidor ou ativador. Os resultados demonstraram que a extração foi aumentada pelo congelamento/descongelamento entre os ciclos de sonicação. A enzima apresentou atividade ótima em pH 5,0 , um valor de Km = 0,27 mM para o substrato p-NPP e mostrou-se estável após o armazenamento em freezer durante aproximadamente 6 meses. A enzima foi inibida pelo tartarato (35%), fluoreto (75%) e Pi (45%) e p-CMB (48%). Substratos orgânicos naturais como FMN, frutose 1,6 difosfato e a-glicero fosfato são clivados em um grau similar ao do substrato sintético p-NPP, sugerindo-se o possível envolvimento da enzima no metabolismo desses intermediários. Os resultados demonstraram que somente o surfactante alquil benzeno linear sulfonado (LAS) e os metais pesados Hg2+, Al3+ e Cu2+ produziram uma alteração marcante (>50%) da atividade enzimática. A ordem de inibição da atividade na maior concentração testada foi LAS> Hg2+= Al3+> Se3+=Pb2+>Cd2+. Os valores de concentração de inibição média (CI50) para Hg2+ e LAS foram, respectivamente, 0,085 e 0,289 mM. Um mecanismo de inibição não-competitiva foi atribuído para o primeiro (Ki = 0,0365 mM), enquanto que o LAS comportou-se como um inibidor competitivo (Ki = 0,010 mM). Os estudos in vivo com culturas de algas tratadas durante 24 horas mostraram que a atividade enzimática e teor de proteína diminuíram nos tratamentos com Hg2+, enquanto que aumentaram em exposições ao LAS. Diferentemente dos experimentos a curto prazo, a inibição da atividade específica foi observada nos organismos expostos durante 7 dias, sendo atribuído um valor de concentração efetiva média (CE50) equivalente a 12,63 µM de Hg2+ e uma redução de 39% para LAS 2 mM. Os resultados de experimentos in vitro com Cu2+, como um ativador da fosfatase ácida, demonstraram uma EC50 e uma KdCu2+ (constante de dissociação para Cu2+) equivalente a 1,80 e 1,64 µM, respectivamente. Quando a enzima foi pré-incubada na presença de Cu2+ 0,2 mM, a Km e a Ea (energia de ativação) diminuíram enquanto que a Vmax praticamente não alterou. De acordo com dados de estabilidade em função do tempo e de experimentação em condições de pré-incubação, sugere-se que o efeito ativador do cobre seja devido ao aumento da estabilidade térmica da enzima. Nas exposições in vivo das culturas de S. capricornutum ao Cu2+, nas concentrações de 1 e 10 mM, foram obtidas diminuições significativas da atividade da fosfatase ácida e da concentração de proteína, entretanto estes efeitos não foram observados na concentração 0,1 mM. O íon metálico não alterou a atividade específica da enzima nas condições de exposição testadas. Os estudos sobre a ação conjunta inibitória indicaram que o Hg2+ possui menor valor de CI50 que o Al3+ ou LAS; e que as misturas Hg2++Al3+ e Hg2++LAS possuíam , respectivamente, efeito aditivo e levemente antagônico. O Cu2+, que demonstrou ter efeito ativador quando pré-incubado com a enzima, comportou-se como um leve antagonista contra o efeito inibidor do Hg2+. Espera-se que os resultados do presente trabalho auxiliem no delineamento experimental e discussão de resultados em estudos com enzimas de algas ou outros organismos, no que se refere a sua extração, caracterização e efeitos de agentes químicos. Espera-se ainda que os resultados melhorem o entendimento dos eventos básicos sobre o impacto de poluentes de origem agrícola em níveis bioquímicos de produtores primários / Abstract: Selenastrum capricornutum is an unicellular green algae widely distributed in freshwater and soils among the world. Because this cosmopolitan characteristic its use is recommended by national and international protocols in ecotoxicity studies. Algae acid phosphatase plays important roles in the metabolism such as decomposing organic phosphates into free phosphates and organic compounds; autophagic digestive process recycling cellular materials, and zygote formation during reproduction. Chemicals released into the environment from agriculture activities like pesticides and sewage sludge contaminants may impair algae phosphatase activity. In this work it was studied the extraction, stability, substrates specificity, effect of inhibitors and kinetics of acid phosphatase in the Selenastrum capricornutum crude extract. It was also evaluated the in vitro effect of thirty agriculture pollutants (24 organic and 6 heavy metals) and performed more detailed in vitro studies and in vivo experiments with the more potent inhibitors or activators. The results showed that the extraction increased by freezing/thawing between cycles of probe sonication. The enzyme showed an optimum pH of 5, a Km value of 0.27 mM for p-NPP and stability by freezing storage during approximately 6 months. The enzyme was inhibited by tartrate (35%), fluoride (75%), Pi (45%) and p-CMB (48%). Natural organic substrates like FMN, fructose 1,6 diphosphate and a-glycero-phosphate were cleaved in a similar extent as the synthetic p-NPP, suggesting the possibility of the enzyme involvement in the cellular metabolism of such intermediates. The results demonstrated that only the surfactant linear alkyl benzenesulphonate (LAS) and the heavy metals Hg2+, Al3+ and Cu2+ altered markedly (>50%) the enzyme activity. The order of inhibition at the highest concentration tested was LAS> Hg2+= Al3+> Se3+=Pb2+>Cd2+. Calculated median inhibition concentration (IC50) values for Hg2+ and LAS were 0.085 and 0.289 mM, respectively. A non-competitive inhibition mechanism was attributed for the former (Ki = 0.0365 mM) while LAS behaved as a competitive inhibitor (Ki = 0.010 mM). In vivo studies with treated algae cultures for 24 hours showed that enzyme activity and protein content diminished in Hg2+ treatments whereas increased in LAS exposures. In contrast with short term treatments, the inhibition of specific activity was observed in exposed algae during 7 days with estimated median effect concentration (EC50) value of 12.63 µM for Hg2+and 39% reduction for LAS 2 mM. The results of in vitro experiments with Cu2+ as an activator demonstrated a EC50 and a KdCu2+ (dissociation constant for Cu2+) equivalent to 1.80 and 1.64 µM, respectively. When the enzyme was preincubated in the presence of Cu2+ 0.2mM, Km and Ea (activaction energy) decreased whereas Vmax practically did not changed. According to the data of stability as a function of time and the preincubation conditions during some experiments, it was suggested that the activator effect of copper might be explained by the increase on the thermal stability of the enzyme. In vivo experiments showed significantly diminution of the enzyme activity together with protein content at 1 and 10 mM Cu2+ but not at 0.1 mM. This metal did not specifically affect the activity of the enzyme in exposed algae at the experimental conditions. Join action inhibition studies indicated that Hg2+ has a lower IC50 value than Al3+ or LAS , and that the Hg2++Al3+ and Hg3++LAS mixtures have respectively, additive and slight antagonism effects. Copper, which demonstrated an activator effect when was preincubated with the enzyme, behaved as a slight antagonist for the inhibitor effect of Hg2+. It can be expected that the results of this work will help in the experimental design and discussion of results in algae enzyme studies regarding the extraction, characterization and effect of chemicals. We hope that the results presented in this work can improve the understanding of the basic events of the impact of agriculture pollutants at biochemical levels in primary producers organisms / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular