INTRODUÇÃO: A microbiota intestinal tem sido alvo de diversos estudos moleculares, principalmente através da introdução de plataformas de sequenciamento de nova geração, devido à sua importância e amplo relacionamento com o hospedeiro humano. Entretanto, o armazenamento de amostras fecais antes da extração do DNA é crítico ao caracterizar a composição da microbiota intestinal. Com base nesses dados, o presente estudo buscou compreender os efeitos de diferentes métodos de armazenamento de amostras fecais para caracterizar a microbiota intestinal através do sequenciamento da nova geração, bem como estabelecer um método alternativo de conservação do material genético bacteriano nessas amostras, utilizando guanidina. MÉTODO: Foram coletadas amostras de fezes de 10 voluntários saudáveis. Cada amostra foi dividida em cinco alíquotas, uma alíquota extraída imediatamente após a coleta (fresca) e duas alíquotas submetidas ao congelamento, à temperaturas de -20°C e -80°C e extraídas após 48 horas. As outras duas alíquotas restantes foram armazenadas em guanidina à temperatura ambiente e a 4°C e extraídas após 48 horas. Para observar a presença de alterações na microbiota intestinal, durante um período de armazenamento maior das amostras de fezes, três amostras foram armazenadas em guanidina à temperatura ambiente e a 4ºC e extraídas após o período de 60 dias. A região hipervariável v4 do gene 16S rRNA bacteriano foi amplificada por PCR. Os amplicons gerados foram sequenciados utilizando a plataforma Ion PGM Torrent e os dados analisados utilizando o software QIIME. A determinação da significância estatística foi realizada utilizando-se o teste não-paramétrico de Kruskal-Wallis. RESULTADOS: Não foram encontradas diferenças significativas em nenhum dos níveis taxonômicos (filo, classe, família, ordem e gênero) entre amostras frescas analisadas e os métodos de armazenamento testados. As análises de coordenadas principais (PCoA) mostraram que as amostras se agruparam de acordo com os indivíduos analisados, tendo as amostras referentes a cada indivíduo agrupado-se com maior proximidade do que com outras amostras do mesmo grupo de armazenamento. CONCLUSÃO: Nossos dados sugerem que o congelamento e o uso de guanidina para armazenamento de amostras de fezes, para a caracterização da microbiota intestinal, podem efetivamente preservar o material genético bacteriano nessas amostras ao longo de um período de 48 horas para amostras submetidas ao congelamento e durante 60 dias para amostras armazenadas em guanidina / INTRODUCTION: The gut microbiota has been the target of several molecular studies, mainly through the introduction of next generation sequencing platforms, due to its importance and wide relationship with the human host. However, the storage of fecal samples prior to DNA extraction is critical when characterizing the composition of the intestinal microbiota. Based on these facts, the present study aimed to understand the effects of different methods of storage of fecal samples to characterize the intestinal microbiota by next generation sequence, as well as establishing an alternative conservation method of the bacterial genetic material in these samples using guanidine. METHODS: Stool samples from 10 healthy volunteers were collected. Each collected sample was divided into five aliquots, one aliquot extracted immediately after collection (fresh) and two aliquots subjected to freezing at -20°C and -80°C temperatures and extracted after 48 hours. The others two remaining aliquots were stored in guanidine at room temperature and at 4°C and extracted after 48 hours. In order to observe the presence of alterations in the intestinal microbiota, during a longer storage period of the stool samples, three samples were stored in guanidine at room temperature and at 4°C and extracted after 60 day period. The v4 hypervariable region of bacterial and archeal 16S rRNA gene were amplified by PCR. The generated amplicons were sequenced using Ion PGM Torrent platform and the data analyzed using the software QIIME. Determination of statistical significance was performed using non-parametric Kruskal-Wallis test. RESULTS: No significant differences were found in any of the taxonomic levels (phylum, class, family, order and genus) between analyzed fresh samples and the others different storage methods. The principal coordinates analysis (PCoA) unweighted showed that the samples clustered based on the host each sample originated from, rather than by storage group. CONCLUSION: Our data suggest that both freezing and the use of guanidine to store stool samples for gut microbiota characterization can effectively preserve the bacterial genetic material in these samples over a 48 hours period for samples subjected to freezing and for up to 60 days for samples stored in guanidine

The present study aimed to evaluate bacterial isolates and the microbiome of dairies. The specific aims were: to characterize Staphylococcus spp. isolated from mastitic milk, to evaluate the presence of Lactococcus in mastitic milk as a potential causative agent of mastitis, to evaluate the association between microbiome and milk quality parameters, and to characterize Staphylococcus spp. isolated from production lines of Minas Frescal cheese. The detection of genes encoding virulence factors (enterotoxins (sea, seb, sec, sed, see, seg, seh, sei, selj, selk, sell, selm, seln, selo, selp, seIq, ser, ses, set, selu, selv, and selx), hemolysins (hla, hlb, hld, hlg, and hlgv), exfoliative toxins (eta, etb, and etd), Panton-Valentine leukocidin (pvl), and toxic shock syndrome toxin (tst)), genes encoding antibiotic resistance (resistance to tetracycline (tetK, tetL, and tetM), erythromycin (ermA, ermB, and ermC), methicillin (mecA and mecC), and tobramycin (ant(4\')-Ia)), molecular typing (spa, SCCmec, and agr types), and phenotyping regarding antibiotic resistance were performed in staphylococci isolates from mastitic milk, and from cheese processing plant samples. Staphylococcus aureus was identified in the majority of isolates from both origins. Several virulence factor genes were detected. The distribution of genes encoding staphylococcal enterotoxins (85.0% - 85.7% of isolates were positive for one or more enterotoxin gene) was highlighted and the gene related to H toxin was the most prevalent. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus were identified in isolates from mastitic milk (4.1%) and cheese processing (6.0%); the genotyping and phenotyping of these isolates were described. t605 had the highest frequency in the S. aureus population studied. In mastitic milk, Lactococcus was suggested as the causative agent of an outbreak of mastitis in a dairy farm. Using next generation sequencing, the abundance of Lactococcus was observed in microbiome samples. Bacterial isolation and DNA sequencing confirmed the presence of Lactococcus lactis and Lactococcus garvieae. The microbiome of environmental samples and bulk tank milk from the dairy farm showed the Lactococcus genus among the most common bacterial taxa, suggesting other sources of this genus. Regarding milk quality parameters, the microbiome of bulk tank milk from several dairy farms was associated with somatic cell count and bacterial count. The core microbiome was described and many genera of importance were identified. Among the associations performed between microbiome and milk quality parameters, the identification of Streptococcus in samples classified with high somatic cell count and high bacterial count was highlighted. Several bacterial taxa with relative abundance significantly higher in samples classified as high and low cell count and bacterial count were shown. Real-time polymerase chain reaction was also performed associated with bacterial diversity, bacterial taxa, and bacterial count. These findings highlight the need to control and prevent bacterial contamination in the dairy industry, from herd to consumers. / O presente estudo apresentou como objetivo avaliar isolados bacterianos e microbioma de lácteos. Os objetivos específicos foram: caracterizar Staphylococcus spp. isolados de leite de vacas com mastite, avaliar a presença de Lactococcus em leite de vacas com mastite como um potencial agente causador de mastite, avaliar a associação entre microbioma de leite de tanque e parâmetros da qualidade de leite, e caracterizar Staphylococcus spp. isolados de linhas de processamento de queijo Minas frescal. A detecção de genes codificadores de fatores de virulência (enterotoxinas (sea, seb, sec, sed, see, seg, seh, sei, selj, selk, sell, selm, seln, selo, selp, seIq, ser, ses, set, selu, selv, e selx), hemolisinas (hla, hlb, hld, hlg, e hlgv), toxinas exfoliativas (eta, etb e etd), leucocidina de Panton-Valentine (pvl), toxina da síndrome do choque tóxico (tst)), genes codificadores de resistência a antibióticos (resistência a tetraciclina (tetK, tetL e tetM), eritromicina (ermA, ermB e ermC), meticilina (mecA e mecC) e tobramicina (ant(4\')-Ia)), tipagem molecular (spa, SCCmec e agr types), e fenotipagem quanto à resistência a antibióticos foram realizadas em estafilococos isolados de leite de vacas com mastite e de amostras de planta de processamento de queijo. Staphylococcus aureus foi identificado na maioria dos isolados de ambas as origens. Diversos genes de fatores de virulência foram detectados, com destaque para a distribuição de genes codificadores de enterotoxinas estafilocócicas (85,0%-85,7% dos isolados foram positivos para um ou mais genes codificadores de enterotoxinas), sendo o gene relacionado com a toxina H o mais frequente. Staphylococcus aureus meticilina resistente foram identificados em isolados de leite de vacas com mastite (4.1%) e em processamento de queijo (6.0%); o perfil genotípico e fenotípico destes isolados foram descritos. t605 foi o mais freqüente na população de S. aureus estudada. Em leite de vacas com mastite, Lactococcus foi sugerido como o agente causador de um surto de mastite numa fazenda leiteira. Usando sequenciamento de nova geração, a abundância de Lactococcus foi observada no microbioma das amostras. O isolamento e sequenciamento de DNA confirmaram a presença de Lactococcus lactis e Lactococcus garvieae. O microbioma de amostras ambientais e de leite de tanque da fazenda mostrou o gênero Lactococcus entre os mais comuns, sugerindo outras fontes deste gênero. Contemplando parâmetros da qualidade de leite, o microbioma de leite de tanque de várias fazendas leiteiras foi relacionado com contagem de células somáticas e contagem bacteriana. O core microbiome foi descrito e muitos gêneros bacterianos de importância foram identificados. Dentre as análises realizadas associando microbioma com parâmetros da qualidade de leite, foi destacada a identificação de Streptococcus em amostras classificadas com alta contagem de células somáticas e alta contagem bacteriana. Diversos táxons bacterianos com abundância relativa significativamente maior em amostras classificadas com alta e baixa contagem de células somáticas e contagem bacteriana foram mostrados. Reação em cadeia da polimerase em tempo real também foi realizada e associada com diversidade bacteriana, táxons bacterianos e contagem bacteriana. Estes levantamentos confirmam a necessidade de controlar e prevenir a contaminação bacteriana na indústria de lácteos, do rebanho leiteiro até os consumidores.

Introdução: A variação genética em genes que codificam a absorção, distribuição, metabolismo e excreção (ADME) de medicamentos frequentemente afeta a farmacocinética da droga e resulta na variabilidade da eficácia e segurança do medicamento. No entanto, a frequência da variação genética nos genes ADME diferem entre as populações. O objetivo deste estudo foi analisar as variações genéticas nos genes ADME nos pacientes brasileiros portadores do vírus da hepatite C e comparar com outros bancos de dados (1000 Genomes Project e Exome Aggregation Consortium). Métodos: Um total de 147 genes ADME foram genotipados em 100 amostras por sequenciamento de DNA genômico usando SureSelectXT (Agilent) e MiSeq, NextSeq (Illumina). Resultados: Um total de 2004 SNPs em 147 genes foram analisados, incluindo enzimas de fase I (n=50), enzimas de fase II (n=37) e transportadores (n=60). Uma coleção de variantes genéticas indica que há pelo menos 2 vezes mais variações do que semelhanças entre os pacientes com hepatite C e os principais grupos continentais. Estas diferenças foram observadas em vários genes relevantes, incluindo CYP1A2, CYP3A4, NAT2, ABCB1 e SLCO1B1. Além disso, pacientes auto declarados como branco, pardo, negro e asiático também apresentaram diferenças de frequência alélica quando comparados à europeus, americanos mixos, africanos e asiáticos nos polimorfismos dos genes CYP1A1, CYP2B6, GSTP1 e ABCG2, respectivamente. Conclusão: Concluímos que os pacientes com hepatite C tem uma frequência alélica de genes ADME diferente dos outros bancos de dados. Embora a personalização do tratamento medicamentoso com base no genótipo individual, e não na etnia, possa ser a mais apropriada, as diferenças nas frequências alélicas entre os continentes devem ser consideradas ao projetar ensaios clínicos de novos medicamentos / Background: Genetic variation in genes encoding drug absorption, distribution, metabolism, and excretion (ADME) proteins often affects the drug pharmacokinetics and results in variability in drug efficacy and safety. However, the frequency of genetic variation in the ADME genes differ among populations. The aim of this study was to analyze the genetic variations in the ADME genes in Brazilian patients with hepatitis C and to compare to other databases (1000 Genomes Project e Exome Aggregation Consortium). Methods: A total of 147 ADME were genotyped in 100 samples from Brazil by targeted genomic DNA sequencing using SureSelectXT (Agilent) and MiSeq, NextSeq (Illumina). Results: A total of 2004 SNPs in 147 genes that were analyzed, including phase I enzymes (n=50), phase II enzymes (n=37), drug transporters (n=60). We provide a collection of genetic variants that indicate that there are at least 2-times more variation than similarities between patients with hepatitis C and major continental groups. These differences were observed in several relevant genes including CYP1A2, CYP3A4, NAT2, ABCB1 and SLCO1B1. Moreover, white, brown, black and Asian self-reported patients also showed allele frequency differences when compared to European, mixed American, African and Asian for polymorphisms of the genes CYP1A1, CYP2B6, GSTP1 and ABCG2. respectively. Conclusion: We conclude that the hepatitis C patients has an allele frequency of ADME genes different from other data bases. While personalization of drug treatment based on individual genotype rather than ethnicity may be more appropriate, differences in allelic frequencies across continents should be considered when designing clinical trials of new drugs

A cardiomiopatia hipertrófica (CMH) é uma doença geneticamente determinada, caracterizada por hipertrofia ventricular primária, com prevalência estimada de 0.2% na população geral. Qualquer portador tem 50% de chance de transmitir esta doença para seus filhos, o que torna cada vez mais relevante a importância do estudo genético dos indivíduos acometidos e de seus familiares. Já foram descritas diversas mutações genéticas causadoras de CMH, a maioria em genes que codificam proteínas do sarcômero, e algumas mutações mais raras em genes não sarcoméricos. O objetivo desse estudo é sequenciar as regiões exônicas de genes candidatos, incluindo os principais envolvidos na hipertrofia miocárdica, utilizando o sequenciamento de nova geração (Generation Sequencing); testar a aplicabilidade e viabilidade deste sistema para identificar mutações já confirmadas e propor as prováveis novas mutações causadoras de CMH. Métodos e resultados: 66 pacientes não aparentados portadores de CMH foram estudados e submetidos à coleta de sangue para obtenção do DNA para analisar as regiões exômicas de 82 genes candidatos, utilizando a plataforma MiSeq (Illumina). Identificou-se 99 mutações provavelmente patogênicas em 54 pacientes incluídos no estudo (81,8%) relacionadas ou não a CMH, e distribuídas em 42 genes diferentes. Destas mutações 27 já haviam sido publicadas, sendo que 17 delas descritas como causadoras de CMH. Em 28 pacientes (42,4%) identificou-se mutação nos três principais genes sarcoméricos relacionados à CMH (MYH7, MYBPC3, TNNT2). Encontrou-se também um grande número de variantes não sonôminas de efeito clínico incerto e algumas mutações relacionadas a outras enfermidades. Conclusão: a análise da sequencia dos exônos de genes candidatos, demonstrou ser uma técnica promissora para o diagnóstico genético de CMH de forma mais rápida e sensível. A quantidade de dados gerados é o um fator limitante até o momento, principalmente em doenças geneticamente complexas com envolvimento de diversos genes e com sistema de bioinformática limitado. / Hypertrophic Cardiomyopathy (HCM) is a genetically determined disease, estimated prevalence of 0.2% in the general population. Any of its carriers has 50% likelihood to pass it on to their children, and that makes the genetic study of these individuals and their relatives even more relevant. There have been several studies describing genetic mutations that cause HCM - the vast majority in genes responsible for sarcomere protein coding - and other rarer mutations in non-sarcomeric genes. The aim of this research is study exonic areas of specific genes, including the most important ones related to myocardial hypertrophy, identifying the genetic mutations that have already been documented, and possible new pathogenic mutations, using the high throughput DNA sequencing (NGS); testing the pplicability and viability to identify HCM-causing mutations. Methods and results: 66 unrelated patients with CM were studied and subject to blood sample in order to extract their genomic DNA to analyze exomic regions of 82 candidates genes, using the high throughput sequencing technology on MiSeg (Illumina) platform. In this study we identified 99 possible damaging mutations in 54 patients (81.8%) that could be related or not to HCM, and distributed in 42 different genes. 27 of this variants have already been published, and 17 of them have been described as HCM causes. 42,4% of the patients (28 individuals) have genetic mutations in the three main sarcomeric genes related to HCM (MYH7, MYBPC3, TNNT2). We also identified a large number of non-synonymous variants of uncertain clinical significance and some mutations related to other diseases. Conclusion: The exome analysis in candidates genes using NGS has demonstrated to be promising for the genetic diagnosis of HCM, in a short time with sensivity. The amount of data obtained in a short period of time is the main limiting factor, especially for genetically complex diseases that involve multiple genes.

Introdução: A variação genética em genes que codificam a absorção, distribuição, metabolismo e excreção (ADME) de medicamentos frequentemente afeta a farmacocinética da droga e resulta na variabilidade da eficácia e segurança do medicamento. No entanto, a frequência da variação genética nos genes ADME diferem entre as populações. O objetivo deste estudo foi analisar as variações genéticas nos genes ADME nos pacientes brasileiros portadores do vírus da hepatite C e comparar com outros bancos de dados (1000 Genomes Project e Exome Aggregation Consortium). Métodos: Um total de 147 genes ADME foram genotipados em 100 amostras por sequenciamento de DNA genômico usando SureSelectXT (Agilent) e MiSeq, NextSeq (Illumina). Resultados: Um total de 2004 SNPs em 147 genes foram analisados, incluindo enzimas de fase I (n=50), enzimas de fase II (n=37) e transportadores (n=60). Uma coleção de variantes genéticas indica que há pelo menos 2 vezes mais variações do que semelhanças entre os pacientes com hepatite C e os principais grupos continentais. Estas diferenças foram observadas em vários genes relevantes, incluindo CYP1A2, CYP3A4, NAT2, ABCB1 e SLCO1B1. Além disso, pacientes auto declarados como branco, pardo, negro e asiático também apresentaram diferenças de frequência alélica quando comparados à europeus, americanos mixos, africanos e asiáticos nos polimorfismos dos genes CYP1A1, CYP2B6, GSTP1 e ABCG2, respectivamente. Conclusão: Concluímos que os pacientes com hepatite C tem uma frequência alélica de genes ADME diferente dos outros bancos de dados. Embora a personalização do tratamento medicamentoso com base no genótipo individual, e não na etnia, possa ser a mais apropriada, as diferenças nas frequências alélicas entre os continentes devem ser consideradas ao projetar ensaios clínicos de novos medicamentos / Background: Genetic variation in genes encoding drug absorption, distribution, metabolism, and excretion (ADME) proteins often affects the drug pharmacokinetics and results in variability in drug efficacy and safety. However, the frequency of genetic variation in the ADME genes differ among populations. The aim of this study was to analyze the genetic variations in the ADME genes in Brazilian patients with hepatitis C and to compare to other databases (1000 Genomes Project e Exome Aggregation Consortium). Methods: A total of 147 ADME were genotyped in 100 samples from Brazil by targeted genomic DNA sequencing using SureSelectXT (Agilent) and MiSeq, NextSeq (Illumina). Results: A total of 2004 SNPs in 147 genes that were analyzed, including phase I enzymes (n=50), phase II enzymes (n=37), drug transporters (n=60). We provide a collection of genetic variants that indicate that there are at least 2-times more variation than similarities between patients with hepatitis C and major continental groups. These differences were observed in several relevant genes including CYP1A2, CYP3A4, NAT2, ABCB1 and SLCO1B1. Moreover, white, brown, black and Asian self-reported patients also showed allele frequency differences when compared to European, mixed American, African and Asian for polymorphisms of the genes CYP1A1, CYP2B6, GSTP1 and ABCG2. respectively. Conclusion: We conclude that the hepatitis C patients has an allele frequency of ADME genes different from other data bases. While personalization of drug treatment based on individual genotype rather than ethnicity may be more appropriate, differences in allelic frequencies across continents should be considered when designing clinical trials of new drugs

INTRODUÇÃO: A microbiota intestinal tem sido alvo de diversos estudos moleculares, principalmente através da introdução de plataformas de sequenciamento de nova geração, devido à sua importância e amplo relacionamento com o hospedeiro humano. Entretanto, o armazenamento de amostras fecais antes da extração do DNA é crítico ao caracterizar a composição da microbiota intestinal. Com base nesses dados, o presente estudo buscou compreender os efeitos de diferentes métodos de armazenamento de amostras fecais para caracterizar a microbiota intestinal através do sequenciamento da nova geração, bem como estabelecer um método alternativo de conservação do material genético bacteriano nessas amostras, utilizando guanidina. MÉTODO: Foram coletadas amostras de fezes de 10 voluntários saudáveis. Cada amostra foi dividida em cinco alíquotas, uma alíquota extraída imediatamente após a coleta (fresca) e duas alíquotas submetidas ao congelamento, à temperaturas de -20°C e -80°C e extraídas após 48 horas. As outras duas alíquotas restantes foram armazenadas em guanidina à temperatura ambiente e a 4°C e extraídas após 48 horas. Para observar a presença de alterações na microbiota intestinal, durante um período de armazenamento maior das amostras de fezes, três amostras foram armazenadas em guanidina à temperatura ambiente e a 4ºC e extraídas após o período de 60 dias. A região hipervariável v4 do gene 16S rRNA bacteriano foi amplificada por PCR. Os amplicons gerados foram sequenciados utilizando a plataforma Ion PGM Torrent e os dados analisados utilizando o software QIIME. A determinação da significância estatística foi realizada utilizando-se o teste não-paramétrico de Kruskal-Wallis. RESULTADOS: Não foram encontradas diferenças significativas em nenhum dos níveis taxonômicos (filo, classe, família, ordem e gênero) entre amostras frescas analisadas e os métodos de armazenamento testados. As análises de coordenadas principais (PCoA) mostraram que as amostras se agruparam de acordo com os indivíduos analisados, tendo as amostras referentes a cada indivíduo agrupado-se com maior proximidade do que com outras amostras do mesmo grupo de armazenamento. CONCLUSÃO: Nossos dados sugerem que o congelamento e o uso de guanidina para armazenamento de amostras de fezes, para a caracterização da microbiota intestinal, podem efetivamente preservar o material genético bacteriano nessas amostras ao longo de um período de 48 horas para amostras submetidas ao congelamento e durante 60 dias para amostras armazenadas em guanidina / INTRODUCTION: The gut microbiota has been the target of several molecular studies, mainly through the introduction of next generation sequencing platforms, due to its importance and wide relationship with the human host. However, the storage of fecal samples prior to DNA extraction is critical when characterizing the composition of the intestinal microbiota. Based on these facts, the present study aimed to understand the effects of different methods of storage of fecal samples to characterize the intestinal microbiota by next generation sequence, as well as establishing an alternative conservation method of the bacterial genetic material in these samples using guanidine. METHODS: Stool samples from 10 healthy volunteers were collected. Each collected sample was divided into five aliquots, one aliquot extracted immediately after collection (fresh) and two aliquots subjected to freezing at -20°C and -80°C temperatures and extracted after 48 hours. The others two remaining aliquots were stored in guanidine at room temperature and at 4°C and extracted after 48 hours. In order to observe the presence of alterations in the intestinal microbiota, during a longer storage period of the stool samples, three samples were stored in guanidine at room temperature and at 4°C and extracted after 60 day period. The v4 hypervariable region of bacterial and archeal 16S rRNA gene were amplified by PCR. The generated amplicons were sequenced using Ion PGM Torrent platform and the data analyzed using the software QIIME. Determination of statistical significance was performed using non-parametric Kruskal-Wallis test. RESULTS: No significant differences were found in any of the taxonomic levels (phylum, class, family, order and genus) between analyzed fresh samples and the others different storage methods. The principal coordinates analysis (PCoA) unweighted showed that the samples clustered based on the host each sample originated from, rather than by storage group. CONCLUSION: Our data suggest that both freezing and the use of guanidine to store stool samples for gut microbiota characterization can effectively preserve the bacterial genetic material in these samples over a 48 hours period for samples subjected to freezing and for up to 60 days for samples stored in guanidine

The present study aimed to evaluate bacterial isolates and the microbiome of dairies. The specific aims were: to characterize Staphylococcus spp. isolated from mastitic milk, to evaluate the presence of Lactococcus in mastitic milk as a potential causative agent of mastitis, to evaluate the association between microbiome and milk quality parameters, and to characterize Staphylococcus spp. isolated from production lines of Minas Frescal cheese. The detection of genes encoding virulence factors (enterotoxins (sea, seb, sec, sed, see, seg, seh, sei, selj, selk, sell, selm, seln, selo, selp, seIq, ser, ses, set, selu, selv, and selx), hemolysins (hla, hlb, hld, hlg, and hlgv), exfoliative toxins (eta, etb, and etd), Panton-Valentine leukocidin (pvl), and toxic shock syndrome toxin (tst)), genes encoding antibiotic resistance (resistance to tetracycline (tetK, tetL, and tetM), erythromycin (ermA, ermB, and ermC), methicillin (mecA and mecC), and tobramycin (ant(4\')-Ia)), molecular typing (spa, SCCmec, and agr types), and phenotyping regarding antibiotic resistance were performed in staphylococci isolates from mastitic milk, and from cheese processing plant samples. Staphylococcus aureus was identified in the majority of isolates from both origins. Several virulence factor genes were detected. The distribution of genes encoding staphylococcal enterotoxins (85.0% - 85.7% of isolates were positive for one or more enterotoxin gene) was highlighted and the gene related to H toxin was the most prevalent. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus were identified in isolates from mastitic milk (4.1%) and cheese processing (6.0%); the genotyping and phenotyping of these isolates were described. t605 had the highest frequency in the S. aureus population studied. In mastitic milk, Lactococcus was suggested as the causative agent of an outbreak of mastitis in a dairy farm. Using next generation sequencing, the abundance of Lactococcus was observed in microbiome samples. Bacterial isolation and DNA sequencing confirmed the presence of Lactococcus lactis and Lactococcus garvieae. The microbiome of environmental samples and bulk tank milk from the dairy farm showed the Lactococcus genus among the most common bacterial taxa, suggesting other sources of this genus. Regarding milk quality parameters, the microbiome of bulk tank milk from several dairy farms was associated with somatic cell count and bacterial count. The core microbiome was described and many genera of importance were identified. Among the associations performed between microbiome and milk quality parameters, the identification of Streptococcus in samples classified with high somatic cell count and high bacterial count was highlighted. Several bacterial taxa with relative abundance significantly higher in samples classified as high and low cell count and bacterial count were shown. Real-time polymerase chain reaction was also performed associated with bacterial diversity, bacterial taxa, and bacterial count. These findings highlight the need to control and prevent bacterial contamination in the dairy industry, from herd to consumers. / O presente estudo apresentou como objetivo avaliar isolados bacterianos e microbioma de lácteos. Os objetivos específicos foram: caracterizar Staphylococcus spp. isolados de leite de vacas com mastite, avaliar a presença de Lactococcus em leite de vacas com mastite como um potencial agente causador de mastite, avaliar a associação entre microbioma de leite de tanque e parâmetros da qualidade de leite, e caracterizar Staphylococcus spp. isolados de linhas de processamento de queijo Minas frescal. A detecção de genes codificadores de fatores de virulência (enterotoxinas (sea, seb, sec, sed, see, seg, seh, sei, selj, selk, sell, selm, seln, selo, selp, seIq, ser, ses, set, selu, selv, e selx), hemolisinas (hla, hlb, hld, hlg, e hlgv), toxinas exfoliativas (eta, etb e etd), leucocidina de Panton-Valentine (pvl), toxina da síndrome do choque tóxico (tst)), genes codificadores de resistência a antibióticos (resistência a tetraciclina (tetK, tetL e tetM), eritromicina (ermA, ermB e ermC), meticilina (mecA e mecC) e tobramicina (ant(4\')-Ia)), tipagem molecular (spa, SCCmec e agr types), e fenotipagem quanto à resistência a antibióticos foram realizadas em estafilococos isolados de leite de vacas com mastite e de amostras de planta de processamento de queijo. Staphylococcus aureus foi identificado na maioria dos isolados de ambas as origens. Diversos genes de fatores de virulência foram detectados, com destaque para a distribuição de genes codificadores de enterotoxinas estafilocócicas (85,0%-85,7% dos isolados foram positivos para um ou mais genes codificadores de enterotoxinas), sendo o gene relacionado com a toxina H o mais frequente. Staphylococcus aureus meticilina resistente foram identificados em isolados de leite de vacas com mastite (4.1%) e em processamento de queijo (6.0%); o perfil genotípico e fenotípico destes isolados foram descritos. t605 foi o mais freqüente na população de S. aureus estudada. Em leite de vacas com mastite, Lactococcus foi sugerido como o agente causador de um surto de mastite numa fazenda leiteira. Usando sequenciamento de nova geração, a abundância de Lactococcus foi observada no microbioma das amostras. O isolamento e sequenciamento de DNA confirmaram a presença de Lactococcus lactis e Lactococcus garvieae. O microbioma de amostras ambientais e de leite de tanque da fazenda mostrou o gênero Lactococcus entre os mais comuns, sugerindo outras fontes deste gênero. Contemplando parâmetros da qualidade de leite, o microbioma de leite de tanque de várias fazendas leiteiras foi relacionado com contagem de células somáticas e contagem bacteriana. O core microbiome foi descrito e muitos gêneros bacterianos de importância foram identificados. Dentre as análises realizadas associando microbioma com parâmetros da qualidade de leite, foi destacada a identificação de Streptococcus em amostras classificadas com alta contagem de células somáticas e alta contagem bacteriana. Diversos táxons bacterianos com abundância relativa significativamente maior em amostras classificadas com alta e baixa contagem de células somáticas e contagem bacteriana foram mostrados. Reação em cadeia da polimerase em tempo real também foi realizada e associada com diversidade bacteriana, táxons bacterianos e contagem bacteriana. Estes levantamentos confirmam a necessidade de controlar e prevenir a contaminação bacteriana na indústria de lácteos, do rebanho leiteiro até os consumidores.

A cardiomiopatia hipertrófica (CMH) é uma doença geneticamente determinada, caracterizada por hipertrofia ventricular primária, com prevalência estimada de 0.2% na população geral. Qualquer portador tem 50% de chance de transmitir esta doença para seus filhos, o que torna cada vez mais relevante a importância do estudo genético dos indivíduos acometidos e de seus familiares. Já foram descritas diversas mutações genéticas causadoras de CMH, a maioria em genes que codificam proteínas do sarcômero, e algumas mutações mais raras em genes não sarcoméricos. O objetivo desse estudo é sequenciar as regiões exônicas de genes candidatos, incluindo os principais envolvidos na hipertrofia miocárdica, utilizando o sequenciamento de nova geração (Generation Sequencing); testar a aplicabilidade e viabilidade deste sistema para identificar mutações já confirmadas e propor as prováveis novas mutações causadoras de CMH. Métodos e resultados: 66 pacientes não aparentados portadores de CMH foram estudados e submetidos à coleta de sangue para obtenção do DNA para analisar as regiões exômicas de 82 genes candidatos, utilizando a plataforma MiSeq (Illumina). Identificou-se 99 mutações provavelmente patogênicas em 54 pacientes incluídos no estudo (81,8%) relacionadas ou não a CMH, e distribuídas em 42 genes diferentes. Destas mutações 27 já haviam sido publicadas, sendo que 17 delas descritas como causadoras de CMH. Em 28 pacientes (42,4%) identificou-se mutação nos três principais genes sarcoméricos relacionados à CMH (MYH7, MYBPC3, TNNT2). Encontrou-se também um grande número de variantes não sonôminas de efeito clínico incerto e algumas mutações relacionadas a outras enfermidades. Conclusão: a análise da sequencia dos exônos de genes candidatos, demonstrou ser uma técnica promissora para o diagnóstico genético de CMH de forma mais rápida e sensível. A quantidade de dados gerados é o um fator limitante até o momento, principalmente em doenças geneticamente complexas com envolvimento de diversos genes e com sistema de bioinformática limitado. / Hypertrophic Cardiomyopathy (HCM) is a genetically determined disease, estimated prevalence of 0.2% in the general population. Any of its carriers has 50% likelihood to pass it on to their children, and that makes the genetic study of these individuals and their relatives even more relevant. There have been several studies describing genetic mutations that cause HCM - the vast majority in genes responsible for sarcomere protein coding - and other rarer mutations in non-sarcomeric genes. The aim of this research is study exonic areas of specific genes, including the most important ones related to myocardial hypertrophy, identifying the genetic mutations that have already been documented, and possible new pathogenic mutations, using the high throughput DNA sequencing (NGS); testing the pplicability and viability to identify HCM-causing mutations. Methods and results: 66 unrelated patients with CM were studied and subject to blood sample in order to extract their genomic DNA to analyze exomic regions of 82 candidates genes, using the high throughput sequencing technology on MiSeg (Illumina) platform. In this study we identified 99 possible damaging mutations in 54 patients (81.8%) that could be related or not to HCM, and distributed in 42 different genes. 27 of this variants have already been published, and 17 of them have been described as HCM causes. 42,4% of the patients (28 individuals) have genetic mutations in the three main sarcomeric genes related to HCM (MYH7, MYBPC3, TNNT2). We also identified a large number of non-synonymous variants of uncertain clinical significance and some mutations related to other diseases. Conclusion: The exome analysis in candidates genes using NGS has demonstrated to be promising for the genetic diagnosis of HCM, in a short time with sensivity. The amount of data obtained in a short period of time is the main limiting factor, especially for genetically complex diseases that involve multiple genes.