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Isolamento e caracterização de serinopeptidases de Pseudechis australis / Isolation and characterization of serinopeptidases Pseudechis australisLevindo, Samuel de Brito 16 September 2016 (has links)
Os venenos de serpentes peçonhentas representam uma mistura muito rica em compostos orgânicos e inorgânicos com potencial farmacológico, clínico e médico considerável. (As propriedades de seus componentes vêm sendo pesquisadas e características que antes não eram observáveis passam a ser descobertas influenciando à obtenção de novas drogas e na otimização de terapias já existentes. A maior parte dos compostos presentes nos venenos das serpentes é formada por proteínas que representam de 90 a 95% do peso seco do veneno, dentre elas destacam-se as peptidases (serino e metalopeptidases). As serinopeptidases caracterizam-se por apresentar no sítio ativo uma tríade catalítica idêntica a presente na tripsina, a qual é formada pelo agrupamento dos aminoácidos, His 57, Asp 102 e Ser 195. Constituem um grupo de enzimas que apresentam uma ampla variedade de efeitos biológicos, com massa molecular entre 25 kDa e 35 kDa, promovendo diversos efeitos fisiológicos como, alterações no sistema hemostático, agindo nos componentes da cascata de coagulação e com ação fibrinogenolítica. Ainda que já existam enzimas de veneno de serpentes com aplicação na regulação da cascata da coagulação, vários laboratórios têm buscado novas alternativas que apresentem atividade na hemostasia a fim de obtenção de produtos farmacológicos ainda não investigados. As serpentes australianas da família Elapidae, destacam-se para este fim, por apresentarem proteínas pró-coagulantes e até o momento não há descrição na literatura sobre a presença de serinopeptidases no veneno de Pseudechis australis. Neste trabalho conseguimos isolar e confirmar pela primeira vez a presença de uma serinopeptidase do veneno de Pseudechis australis através de técnicas cromatográficas e bioquímicas. Esta serinopeptidase possui atividade sobre a cadeia beta e alfa do fibrinogênio, não possui atividade gelatinolítica e possui semelhanças com o Fator X (FX) da cascata de coagulação. / Snake venoms represent a very rich mixture of organic and inorganic compounds with potential pharmacological, clinical and medical applications. This potential has not been fully exploited due to our incomplete knowledge of the properties of venoms and their components. Most of the compounds present in snake venoms are proteins that represent 90 to 95% of the dry weight, among which stand out peptidases (serine and metallopeptidases). The serinopeptidases are characterized by having a catalytic triad similar to the one present in trypsin, which is formed by, His 57, Asp 102 and Ser 195.These proteins constitute a group of enzymes that have a variety of activities, molecular mass between 25 kDa to 35 kDa, promoting many physiological effects as changes in the hemostatic system, acting on components of the clotting cascade and fibrinogenolytic action. Several snake venoms isolated peptidases are used for therapeutic purposes, among which serinopeptidases as Batroxobin® and Ancrod® used as anticoagulants in heart surgery. Pseudechis australis (King Brown or Mulga Snake) is a terrestrial species among the most poisonous of Australia and belonging to the family Elapidae which constitutes 57.7% of the snake species described in the Australian continent, Australian Elapidae are among the ten more toxic species in the world. Although there are already venom enzymes snakes with application in coagulopathies, several laboratories have sought alternatives for the treatment of hemostasic disorders in order to obtain new pharmacological products. Australian snakes from the Elapidae family, stand out for this purpose, because they have procoagulant proteins with properties similar to the macromolecular complex found in blood. It is worth noting that so far there is no description in the literature on the presence of serinopeptidases in Pseudechis australis venom and since serinopeptidases are closely linked to the hemostatic system, new serinopeptidases may have great potential in the development of drugs for the therapy of hemostatic disorders. In this work we managed to isolate and confirm the first time a serinopeptidase the Pseudechis australis venom through chromatographic and biochemical techniques. This serinopeptidase have activity on alpha and beta chain of fibrinogen, has no gelatinolytic activity and has similarities to factor X of the clotting cascade.
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Eficácia do soro antibotrópico produzido no Instituto Butantan: obtenção, caracterização e neutralização de serinopeptidases de interesse do veneno Bothrops jararaca. / Efficacy of the antibothropic serum produced by Butantan Institute: obtaining, characterizing and neutralizing serinopeptidases of interest from the Bothrops jararaca venom.Kuniyoshi, Alexandre Kazuo 10 November 2017 (has links)
O envenenamento ofídico é considerado uma condição tropical negligenciada pela OMS, e no Brasil, o gênero Bothrops está envolvido na maioria dos casos. Primeiramente, estudamos a atividade hidrolítica do veneno de B. jararaca sobre peptídeos biologicamente ativos que podem estar relacionadas com o envenenamento. A hidrólise dos peptídeos que foram substratos para as serinopeptidases não foi eficientemente bloqueada pelo soro antibotrópico produzido pelo Instituto Butantan e, portanto, as causas dessas falhas foram investigadas. Para isso, purificamos quatro serinopeptidases não bloqueadas pelo soro e, por estudos imunoquímicos, observamos que apesar deste não bloquear as atividades destas enzimas, o mesmo é capaz de reconhecê-las. Portanto, decidimos obter soros experimentais contra estas moléculas utilizando camundongos, a fim de compará-los com o soro comercial. Os soros experimentais contra as serinopeptidases mostraram capacidade de reconhecimento e alta afinidade contra elas, e mais importante, capacidade de neutralizar suas atividades in vitro. / Snakebite is considered a neglected tropical condition by WHO, and in Brazil, the Bothrops genus is involved in most of the cases. Initially, we have studied the B. jararaca venom activity over bioactive peptides which could be related with the envenomation. The hydrolysis of the peptides substrate for serinepeptidases were not efficiently blocked by the Butantan Institute bothropic antivenom, therefore, the causes of this flaw were investigated. Thereafter, we purified four serinepeptidases not blocked by the antivenom and, by immunochemistry analysis, we observed that although it could not neutralize the activity, it could well recognize these proteins. Thus, we decided to obtain experimental sera against these serinepeptidases in mice, in order to compare it with the commercial antivenom. The experimental sera against these enzymes demonstrated recognition capability and high affinity, and most important, the ability to neutralize their activity in vitro.
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Eficácia do soro antibotrópico produzido no Instituto Butantan: obtenção, caracterização e neutralização de serinopeptidases de interesse do veneno Bothrops jararaca. / Efficacy of the antibothropic serum produced by Butantan Institute: obtaining, characterizing and neutralizing serinopeptidases of interest from the Bothrops jararaca venom.Alexandre Kazuo Kuniyoshi 10 November 2017 (has links)
O envenenamento ofídico é considerado uma condição tropical negligenciada pela OMS, e no Brasil, o gênero Bothrops está envolvido na maioria dos casos. Primeiramente, estudamos a atividade hidrolítica do veneno de B. jararaca sobre peptídeos biologicamente ativos que podem estar relacionadas com o envenenamento. A hidrólise dos peptídeos que foram substratos para as serinopeptidases não foi eficientemente bloqueada pelo soro antibotrópico produzido pelo Instituto Butantan e, portanto, as causas dessas falhas foram investigadas. Para isso, purificamos quatro serinopeptidases não bloqueadas pelo soro e, por estudos imunoquímicos, observamos que apesar deste não bloquear as atividades destas enzimas, o mesmo é capaz de reconhecê-las. Portanto, decidimos obter soros experimentais contra estas moléculas utilizando camundongos, a fim de compará-los com o soro comercial. Os soros experimentais contra as serinopeptidases mostraram capacidade de reconhecimento e alta afinidade contra elas, e mais importante, capacidade de neutralizar suas atividades in vitro. / Snakebite is considered a neglected tropical condition by WHO, and in Brazil, the Bothrops genus is involved in most of the cases. Initially, we have studied the B. jararaca venom activity over bioactive peptides which could be related with the envenomation. The hydrolysis of the peptides substrate for serinepeptidases were not efficiently blocked by the Butantan Institute bothropic antivenom, therefore, the causes of this flaw were investigated. Thereafter, we purified four serinepeptidases not blocked by the antivenom and, by immunochemistry analysis, we observed that although it could not neutralize the activity, it could well recognize these proteins. Thus, we decided to obtain experimental sera against these serinepeptidases in mice, in order to compare it with the commercial antivenom. The experimental sera against these enzymes demonstrated recognition capability and high affinity, and most important, the ability to neutralize their activity in vitro.
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