CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / A expressÃo heterÃloga de genes que codificam proteÃnas relacionadas à patogÃnse (PR-proteÃnas) representa uma alternativa promissora para o desenvolvimento de plantas resistentes ao ataque de fungos. Dentre as PR-proteÃnas com grande potencial biotecnolÃgico, estÃo as quitinases, hidrolases que catalisam a degradaÃÃo da quitina, que à um polÃmero constituinte da parede celular de muitas espÃcies de fungos fitopatogÃnicos. AlÃm da funÃÃo relacionada aos mecanismos de defesa, acredita-se que essas enzimas podem desempenhar outros papÃis, como a regulaÃÃo de processos de crescimento e desenvolvimento em plantas. O objetivo deste trabalho foi estudar o papel de uma quitinase de classe I de feijÃo-caupi (VuChiI) na defesa e no desenvolvimento vegetal e para isso duas abordagens foram conduzidas. A primeira consistiu no silenciamento do gene que codifica esta proteÃna em plantas de feijÃo-caupi. Nos experimentos de silenciamento gÃnico foram utilizados meristemas apicais de plÃntulas de feijÃo-caupi, que foram entÃo bombardeados com micropartÃculas portando um vetor de silenciamento (pKANNIBAL), onde foi clonada uma construÃÃo em grampo (intron harpin) do gene de VuChiI. As plantas regeneradas em meio de cultura de Murashige e Skoog (MS) contendo o herbicida imazapyr, como agente de seleÃÃo, foram analisadas por PCR, o que resultou na confirmaÃÃo da transformaÃÃo genÃtica de cinco plantas, a partir de 1.092 meristemas apicais bombardeados. O RNA foi extraÃdo das plantas transformadas e utilizado em anÃlises de Northern blot que possibilitou a detecÃÃo de siRNAs no RNA total extraÃdo das plantas putativamente transgÃnicas. Apenas uma das plantas transformadas produziu uma vagem contendo seis sementes, das quais apenas uma germinou. As plantas transformadas apresentaram ciclo de vida de mais de 365 dias enquanto que o esperado à de 65-70 dias. Com base nos resultados sugere-se que o silenciamento da quitinase de classe I de feijÃo-caupi pode ter promovido alteraÃÃo no desenvolvimento da planta. A segunda estratÃgia de transformaÃÃo genÃtica consistiu no co-cultivo de discos foliares de tabaco com suspensÃo de Agrobacterium tumefaciens LB4404, com o intuito de expressar a proteÃna recombinante no espaÃo extracelular das plantas regeneradas. Essa estratÃgia tem como objetivo fazer com que a proteÃna entre em contato com o fungo antes mesmo que este agente patogÃnico penetre na cÃlula vegetal. Para tanto, o inserto referente à quitinase de feijÃo-caupi foi clonado no vetor binÃrio pCAMBIA1305.2 sob controle do promotor CaMV35S e fundido ao peptÃdeo sinal GRP (glycine-rich protein de Oryza sativa), que permite a secreÃÃo da proteÃna recombinante via apoplasto. Foram produzidas trÃs linhagens de plantas que tiveram a transformaÃÃo genÃtica confirmada por PCR. As sementes obtidas das plantas transformadas, geraÃÃo R1, foram semeadas em meio seletivo para a anÃlise da transmissÃo do transgene. O teste de X2 indicou que o transgene foi transmitido para a progÃnie em proporÃÃes Mendelianas. Os modelos experimentais desenvolvidos neste trabalho poderÃo contribuir para a elucidaÃÃo dos papÃis biolÃgicos da quitinase de classe I de feijÃo-caupi. / Heterologous expression of genes encoding pathogenesis related proteins (PR-proteins) represents a promising alternative for the development of plants resistant to fungi. Among the PR-proteins with great biotechnological potentials are the chitinases, a class of hydrolases which catalyze the degradation of chitin, a polymer constituent of cell wall of several species of pathogenic fungi. Besides their function related to defense mechanisms, it is believed that these enzymes may play other roles, such as regulation of growth and development processes in plants. Using two approaches, this study sought to investigate the role of a class I chitinase of cowpea (VuChiI) in defense and plant development. The first approach consisted of silencing of the gene encoding for VuChiI in cowpea. Apical meristems excised from cowpea seeds were bombarded with microparticles containing a silencing vector (pKANNIBAL), which was cloned with a construct harboring an intron harpin of the gene VuChiI. Plants regenerated in a Murashige and Skoog (MS) media containing imazapyr as a selection agent, were analyzed by PCR, resulting in confirmation of genetic transformation of five plants from the 1092 apical meristems bombarded. Northern blot analysis of total RNA extracted from the putative transgenic plants allowed for the detection of siRNAs. Upon regeneration and germination, only one of the five transformed plants produced a pod containing six seeds. Of these, only one germinated when further planted. The transformed plants exhibited a life cycle of over 365 days, as against the normal cycle of 65-70 days. Based on these results we posit that silencing of class I cowpea chitinase may have led to changes in plant development. The second strategy consisted of co-cultivation of tobacco leaf discs with Agrobacterium tumefaciens strain LB4404 suspension to express recombinant protein in the extracellular space of the regenerated plants in order to expose the protein fungus even before its penetration into the plant cell. To achieve this, a sequence of cowpea chitinase insert was cloned into the binary vector pCAMBIA1305.2 under the control of CaMV35S promoter and signal peptide fused to glycine-rich protein of Oryza sativa (GRP), which allowed the secretion of recombinant protein via apoplast. This led to the generation of three strains as confirmed by PCR. Seeds obtained from transformed R1 generation of the plants were germinated and analyzed for transmission of the transgene using X2 test, which confirmed its transmission to the progeny in a Mendelian fashion. The experimental models developed in this work may serve to further assess the biological roles of class I chitinase from cowpea.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / O H2O2 à tido como molÃcula sinalizadora de vÃrios eventos celulares e seu nÃvel endÃgeno à controlado pelas diferentes isoformas de APX e CAT que estÃo distribuÃdas na cÃlula vegetal. No presente estudo, foram utilizadas diferentes abordagens visando um melhor entendimento do papel das isoformas citosÃlicas de APX, consideradas por muitos autores as isoformas mais importantes dentre as APXs, e sua sincronia com CAT, tendo em vista que estas sÃo as principais removedoras do H2O2 intracelular. Inicialmente, foi observado que plantas de arroz submetido à combinaÃÃo de estresse salino e alta temperatura apresentaram modulaÃÃo positiva da atividade de APX associada com menor acÃmulo de H2O2. Intrigantemente, plantas duplamente silenciadas nas isoformas de APX citosÃlica (APx1/2s) apresentaram desenvolvimento normal em condiÃÃes controle. Em condiÃÃes estressantes, as APx1/2s exibiram um mecanismo antioxidativo compensatÃrio mediado principalmente pelas isoformas de GPX citosÃlica e cloroplÃstica juntamente com antioxidantes nÃo enzimÃticos. AlÃm disso, as APx1/2s submetidas a inibiÃÃo irreversÃvel de CAT apresentaram melhor desempenho fotossintÃtico e menores danos oxidativos que plantas que continham a APX citosÃlica, CAT ou ambas indicando que outros mecanismos compensatÃrios foram ativados para mitigar os possÃveis efeitos negativos do acÃmulo de H2O2. Tomados em conjunto, os dados indicam que as isoformas citosÃlicas de APX nÃo sÃo as enzimas mais importantes no controle dos nÃveis de H2O2, visto que plantas com ausÃncia destas isoformas completam o ciclo de vida e sÃo capazes de enfrentar situaÃÃes de estresse. AlÃm disso, à possÃvel afirmar que a aÃÃo coordenada das isoformas de GPX, juntamente com ascorbato e glutationa reduzidos, podem ser os responsÃveis pela manutenÃÃo do equilÃbrio redox celular em condiÃÃes estressantes em plantas de arroz, diferente do que à noticiado para a planta-modelo Arabdopsis. / Plants in the field are exposed to multiple stresses, such as salinity, drought, high light, heat/cold and others, resulting in different physiological responses. T o evaluate the consequences of some of these stresses to the photosynthetic apparatus and an tioxidative metabolism, 30 day old rice plants , were submitted to the following treatments: control (without NaCl and at 27 ÂC), heat stress (without NaCl and at 42 ÂC), salt stress (with 100 mM NaCl and at 27 ÂC) and combined stress (salt+heat). The contr ol and salt stress treatments lasted 8 days and the heat and combined stress treatments lasted 6 hours. At the end of the experimental period, gas exchange, chlorophyll fluorescence and electrolyte leakage were measured and the leaves were collected for bi ochemical determinations. I solated salt and heat stress es were not sufficient to cause damage in the photochemical apparatus and heat stress only modifie d stomatal aperture. In combined heat and salt stress , the results indicate that photosynthetic process es were affected at the level of CO 2 assimilation and quantum efficiency. E lectrolyte leakage, TBARS and H 2 O 2 content were elevated in sal t +heat treatment, but in isolate d heat stress the TBARS was decreased. Reduced ascorbate and glutathione were similarly decrease d in plants exposed to the combination of salt and heat. A ll enzymes examin ed here were differently modulated in experimental treatment s . Taken together, the data indicates more intense impairment of photosynthesis in rice plants in the c ombination of the salt and heat, however the effective modulation of the antioxidative system was eff ective in establishing a new redox homeostasis and providing tolerance to abiotic stress.