Detection of single nucleotide substitutions (SNS) in DNA and RNA has a growing importance in biology and medicine. One traditional approach for recognition of SNS takes advantage of hybridization probes that bind target nucleic acids followed by measuring ?Tm, the difference in melting temperatures of matched and mismatched hybrids. The approach enables SNS differentiation at elevated temperatures (usually 40-65oC) often only in a narrow range of < 10oC and requires high-resolution melting devices. Here we demonstrate that a specially designed DNA probe (X sensor) can broaden ?Tm from ~10oC to ~16oC and distinguish SNS in the interval of ~5-40oC. Therefore, there is no need for heating or measuring Tm for accurate SNS differentiation. Our data indicate that this wide differentiation range is in part due to the non-equilibrium hybridization conditions. Further we explored the idea that it is possible to improve the performance of an X sensor operable in close to equilibrium conditions by shifting its operability to non-equilibrium conditions. One way to achieve this is to introduce as many as possible structured ligands in analyte's dissociated state. Here we show that by introducing the maximum possible conformational constraints in X probe it is possible to shift its operation to non-equilibrium conditions and to improve its selectivity at temperatures < 15oC. Thus, this work points towards a new strategy for the design of highly selective hybridization sensors which operate in non-equilibrium conditions at close to room temperature. The X sensors could be utilized in qPCR, microarrays, as well as RNA analysis in living cells and for ambient temperature point-of-care diagnostics. In the last part of this work, X sensors were used in real time detection of PCR products. The sensors were optimized to operate in PCR buffer with optimal Mg2+ concentration. They were able to detect the target amplicon together with nonspecific products. The results presented here suggest that X sensors might be adopted for real time PCR format.

Inspired by Gould, who claimed life would be arriving at a different outcome each time it were allowed to run from the same beginning, I have attempted to determine the repeatability of the adaptive course of one Pseudomonas fluorescens lineage. In addition, my study aimed to establish whether the likelihood of parallel evolution of the two synonymous single-nucleotide substitutions was contingent upon a prior motility-impairing deletion or a prior increase in fitness. Further, the study was designed to provide empirical data addressing the long-standing question of the effect of starting fitness on the ensuing rate of adaptation. Although no exact replay of the initial evolutionary trajectory was observed, I have demonstrated that gtsB, but not gtsC gene, is likely to be a mutational hotspot under the low glucose with a recovery of two undescribed mutations in gtsB. My data are consistent with a notion that substitutions in gtsB may be contingent upon Δ35kB(fliJ-PFLU4466) motility-impairing deletion, but not the fitness increase associated with it. Finally, the features of the adaptive landscape of P. fluorescens in the minimal glucose provide languid support for Fisher’s hypothesis of a decrease in adaptation rate with the rise in the starting fitness. Taken together, these original results reinforce the non-negligible role of history in shaping the outcomes of biological evolution and call for caution in attempting a formulation of rigid predictive models of evolutionary change. Inspiré par les travaux de Stephen J. Gould qui affirmait que la vie sur terre arriverait à une forme différente si elle repartait à zéro, je présente ici mes travaux où je teste la reproductibilité du cours adaptatif d’une lignée expérimentale de Pseudomonas fluorescens. L’objectif de cette étude était de déterminer si la probabilité que deux mutations synonymes évoluent en parallèle est affectée par la présence d’une délétion affectant la motilité de la bactérie ou de l’augmentation de la valeur sélective de celle-ci. De plus, le design expérimental de cette étude permet de tester si la valeur sélective initiale d’une population affecte le taux d’adaptation de cette même population. Bien d’une reproductibilité exacte du cours adaptatif initial ne fut pas observée, je démontre que le gène gtsB est probablement un « hotspot »mutationnel permettant l’adaptation à de bas niveau de glucose, ayant trouvé deux mutations dans ce site; alors que le gène gtsC ne l’est pas. Mes données sont également conséquentes avec le fait que les mutation dans le gène gtsB dépendent de l’effet de la délétion Δ35kB(fliJ-PFLU4466) affectant la motilité de la bactérie, mais non de l’augmentation de la valeur sélective qui y est associée. Finalement, la forme du plateau adaptative associé à de bas niveaux de glucose chez P. fluorescens supporte l’hypothèse émise par Fisher qui stipule que le taux d’adaptation d’un organisme diminue avec la valeur sélective initiale qui y est associée. L’ensemble de ces résultats supporte le rôle non-négligeable de l’histoire de vie d’une population en ce qui attrait à l’évolution future de cette même population. Aussi, ces résultats appelle à la prudence quand vient le temps de formuler des modèles prédictifs des changements évolutifs d’une population.

Inspired by Gould, who claimed life would be arriving at a different outcome each time it were allowed to run from the same beginning, I have attempted to determine the repeatability of the adaptive course of one Pseudomonas fluorescens lineage. In addition, my study aimed to establish whether the likelihood of parallel evolution of the two synonymous single-nucleotide substitutions was contingent upon a prior motility-impairing deletion or a prior increase in fitness. Further, the study was designed to provide empirical data addressing the long-standing question of the effect of starting fitness on the ensuing rate of adaptation. Although no exact replay of the initial evolutionary trajectory was observed, I have demonstrated that gtsB, but not gtsC gene, is likely to be a mutational hotspot under the low glucose with a recovery of two undescribed mutations in gtsB. My data are consistent with a notion that substitutions in gtsB may be contingent upon Δ35kB(fliJ-PFLU4466) motility-impairing deletion, but not the fitness increase associated with it. Finally, the features of the adaptive landscape of P. fluorescens in the minimal glucose provide languid support for Fisher’s hypothesis of a decrease in adaptation rate with the rise in the starting fitness. Taken together, these original results reinforce the non-negligible role of history in shaping the outcomes of biological evolution and call for caution in attempting a formulation of rigid predictive models of evolutionary change. Inspiré par les travaux de Stephen J. Gould qui affirmait que la vie sur terre arriverait à une forme différente si elle repartait à zéro, je présente ici mes travaux où je teste la reproductibilité du cours adaptatif d’une lignée expérimentale de Pseudomonas fluorescens. L’objectif de cette étude était de déterminer si la probabilité que deux mutations synonymes évoluent en parallèle est affectée par la présence d’une délétion affectant la motilité de la bactérie ou de l’augmentation de la valeur sélective de celle-ci. De plus, le design expérimental de cette étude permet de tester si la valeur sélective initiale d’une population affecte le taux d’adaptation de cette même population. Bien d’une reproductibilité exacte du cours adaptatif initial ne fut pas observée, je démontre que le gène gtsB est probablement un « hotspot »mutationnel permettant l’adaptation à de bas niveau de glucose, ayant trouvé deux mutations dans ce site; alors que le gène gtsC ne l’est pas. Mes données sont également conséquentes avec le fait que les mutation dans le gène gtsB dépendent de l’effet de la délétion Δ35kB(fliJ-PFLU4466) affectant la motilité de la bactérie, mais non de l’augmentation de la valeur sélective qui y est associée. Finalement, la forme du plateau adaptative associé à de bas niveaux de glucose chez P. fluorescens supporte l’hypothèse émise par Fisher qui stipule que le taux d’adaptation d’un organisme diminue avec la valeur sélective initiale qui y est associée. L’ensemble de ces résultats supporte le rôle non-négligeable de l’histoire de vie d’une population en ce qui attrait à l’évolution future de cette même population. Aussi, ces résultats appelle à la prudence quand vient le temps de formuler des modèles prédictifs des changements évolutifs d’une population.