In den letzten Jahren ergaben sich vermehrt Hinweise, dass dendritische Zellen (DCs) zu einer Stimulation von Natürlichen „Killer“ (NK)-Zellen in der Lage sind, die als zytotoxische Effektorzellen des angeborenen Immunsystems Tumorzellen eliminieren. Aus diesem Grund bestand ein wesentliches Ziel dieser Arbeit in der Analyse der Wechselwirkungen zwischen nativen DCs und NK-Zellen. Dazu wurden slanDCs verwendet, welche die größte DC-Subpopulation des Blutes repräsentieren. Zunächst wurde evaluiert, ob slanDCs eine effiziente Aktivierung von NK-Zellen bewirken. Als ein Ergebnis zeigte sich, dass Lipopolysaccharid (LPS)-stimulierte slanDCs sowohl zu einer verstärkten Expression des Aktivierungsmarkers CD69 auf der Oberfläche von NK-Zellen als auch zur Induktion der NK-Zell-Proliferation führen. Darüber hinaus wurde erstmals die slanDC-abhängige Erhöhung der Expression von aktivierenden Rezeptoren (NKp46, NKp44, NKp30) und Korezeptoren (2B4, DNAM-1) auf NK-Zellen demonstriert, welche essentiell für die NK-Zell-vermittelte Erkennung und Lyse von Tumorzellen sind. In weiteren Untersuchungen induzierten LPS-aktivierte slanDCs eine erhebliche Produktion von Interferon (IFN)-gamma in NK-Zellen, welches proliferationshemmend auf Tumorzellen und aktivierend auf T-Lymphozyten wirkt. Funktionelle Analysen ergaben, dass aktivierte slanDCs das zytotoxische Potential von NK-Zellen gegenüber der Tumorzelllinie K-562 deutlich verstärken. Untersuchungen der zugrunde liegenden Mechanismen zeigten die herausragende Bedeutung von IL-12, das sowohl die Steigerung der IFN-gamma-Sekretion als auch die Zunahme der zytolytischen Aktivität von NK-Zellen induzierte. Darüber hinaus konnte erstmals gezeigt werden, dass LPS-aktivierte slanDCs eine Zytotoxizität von NK-Zellen gegenüber frisch etablierten Blasten von Patienten mit akuter myeloischer Leukämie induzieren. In weiteren Untersuchungen wurde evaluiert, ob NK-Zellen ihrerseits die immunstimulatorischen Eigenschaften von slanDCs beeinflussen. Die Analysen zeigten erstmals, dass unstimulierte NK-Zellen die Expression von MHC-Klasse II-Molekülen, kostimulatorischen Molekülen und Adhäsionsmolekülen auf slanDCs deutlich erhöhen und somit ihre Fähigkeit zur Aktivierung von CD8+ T-Lymphozyten sowie CD4+ T-Helferzellen fördern. NK-Zellen führen ebenfalls zu einer deutlichen Verstärkung der Produktion von IL-12 durch LPS-stimulierte slanDCs. Darüber hinaus zeigte sich, dass NK-Zellen die Sekretion des immunsuppressiven Zytokins IL-10 durch LPS-stimulierte slanDCs reduzieren. In weiteren Analysen wurde demonstriert, dass die Interaktionen mit NK Zellen die Fähigkeit von LPS-aktivierten slanDCs zur Programmierung naiver CD4+ T-Lymphozyten in IFN-gamma-produzierende T-Helfer-1-Zellen deutlich verstärken. Diese Ergebnisse zeigten deutlich, dass stimulierte slanDCs und NK-Zellen in der Lage sind, sich wechselseitig zu aktivieren. NKT-Zellen repräsentieren eine weitere bedeutende Effektorzellpopulation der frühen antitumoralen Immunabwehr, die durch Sekretion von Zytokinen und ein ausgeprägtes zytolytisches Potential zur Elimination von Tumorzellen beiträgt. Deshalb wurden im Rahmen dieser Arbeit erstmals die Wechselwirkungen zwischen slanDCs und NKT-Zellen analysiert. Dabei verstärkten LPS-stimulierte slanDCs die Expression des Aktivierungsmarkers CD69 auf NKT-Zellen. Darüber hinaus induzierten LPS-aktivierte slanDCs eine deutliche IFN-gamma-Produktion in NKT-Zellen, wobei erneut die zentrale Rolle von IL-12 gezeigt wurde. Diese Ergebnisse demonstrierten, dass stimulierte slanDCs zu einer effektiven Aktivierung von NKT Zellen in der Lage sind. In abschließenden Untersuchungen wurde die Wirkung von NKT-Zellen auf slanDCs evaluiert. Dabei verstärkten NKT-Zellen die Maturierung von slanDCs erheblich und führten zu einer signifikanten Steigerung der IL-12-Produktion sowie zu einer Reduktion der IL-10-Freisetzung in Abhängigkeit von IFN-gamma. Die gewonnenen Daten demonstrierten, dass NKT-Zellen und slanDCs zu einer gegenseitigen Aktivierung befähigt sind. Die im Rahmen dieser Dissertation gewonnenen Erkenntnisse zu den Interaktionen von slanDCs und NK- bzw. NKT-Zellen können einen wesentlichen Beitrag zum Verständnis der Immunabwehr von Tumoren leisten und die Konzeption neuer antitumoraler Therapiestrategien unterstützen.

In den letzten Jahren ergaben sich vermehrt Hinweise, dass dendritische Zellen (DCs) zu einer Stimulation von Natürlichen „Killer“ (NK)-Zellen in der Lage sind, die als zytotoxische Effektorzellen des angeborenen Immunsystems Tumorzellen eliminieren. Aus diesem Grund bestand ein wesentliches Ziel dieser Arbeit in der Analyse der Wechselwirkungen zwischen nativen DCs und NK-Zellen. Dazu wurden slanDCs verwendet, welche die größte DC-Subpopulation des Blutes repräsentieren. Zunächst wurde evaluiert, ob slanDCs eine effiziente Aktivierung von NK-Zellen bewirken. Als ein Ergebnis zeigte sich, dass Lipopolysaccharid (LPS)-stimulierte slanDCs sowohl zu einer verstärkten Expression des Aktivierungsmarkers CD69 auf der Oberfläche von NK-Zellen als auch zur Induktion der NK-Zell-Proliferation führen. Darüber hinaus wurde erstmals die slanDC-abhängige Erhöhung der Expression von aktivierenden Rezeptoren (NKp46, NKp44, NKp30) und Korezeptoren (2B4, DNAM-1) auf NK-Zellen demonstriert, welche essentiell für die NK-Zell-vermittelte Erkennung und Lyse von Tumorzellen sind. In weiteren Untersuchungen induzierten LPS-aktivierte slanDCs eine erhebliche Produktion von Interferon (IFN)-gamma in NK-Zellen, welches proliferationshemmend auf Tumorzellen und aktivierend auf T-Lymphozyten wirkt. Funktionelle Analysen ergaben, dass aktivierte slanDCs das zytotoxische Potential von NK-Zellen gegenüber der Tumorzelllinie K-562 deutlich verstärken. Untersuchungen der zugrunde liegenden Mechanismen zeigten die herausragende Bedeutung von IL-12, das sowohl die Steigerung der IFN-gamma-Sekretion als auch die Zunahme der zytolytischen Aktivität von NK-Zellen induzierte. Darüber hinaus konnte erstmals gezeigt werden, dass LPS-aktivierte slanDCs eine Zytotoxizität von NK-Zellen gegenüber frisch etablierten Blasten von Patienten mit akuter myeloischer Leukämie induzieren. In weiteren Untersuchungen wurde evaluiert, ob NK-Zellen ihrerseits die immunstimulatorischen Eigenschaften von slanDCs beeinflussen. Die Analysen zeigten erstmals, dass unstimulierte NK-Zellen die Expression von MHC-Klasse II-Molekülen, kostimulatorischen Molekülen und Adhäsionsmolekülen auf slanDCs deutlich erhöhen und somit ihre Fähigkeit zur Aktivierung von CD8+ T-Lymphozyten sowie CD4+ T-Helferzellen fördern. NK-Zellen führen ebenfalls zu einer deutlichen Verstärkung der Produktion von IL-12 durch LPS-stimulierte slanDCs. Darüber hinaus zeigte sich, dass NK-Zellen die Sekretion des immunsuppressiven Zytokins IL-10 durch LPS-stimulierte slanDCs reduzieren. In weiteren Analysen wurde demonstriert, dass die Interaktionen mit NK Zellen die Fähigkeit von LPS-aktivierten slanDCs zur Programmierung naiver CD4+ T-Lymphozyten in IFN-gamma-produzierende T-Helfer-1-Zellen deutlich verstärken. Diese Ergebnisse zeigten deutlich, dass stimulierte slanDCs und NK-Zellen in der Lage sind, sich wechselseitig zu aktivieren. NKT-Zellen repräsentieren eine weitere bedeutende Effektorzellpopulation der frühen antitumoralen Immunabwehr, die durch Sekretion von Zytokinen und ein ausgeprägtes zytolytisches Potential zur Elimination von Tumorzellen beiträgt. Deshalb wurden im Rahmen dieser Arbeit erstmals die Wechselwirkungen zwischen slanDCs und NKT-Zellen analysiert. Dabei verstärkten LPS-stimulierte slanDCs die Expression des Aktivierungsmarkers CD69 auf NKT-Zellen. Darüber hinaus induzierten LPS-aktivierte slanDCs eine deutliche IFN-gamma-Produktion in NKT-Zellen, wobei erneut die zentrale Rolle von IL-12 gezeigt wurde. Diese Ergebnisse demonstrierten, dass stimulierte slanDCs zu einer effektiven Aktivierung von NKT Zellen in der Lage sind. In abschließenden Untersuchungen wurde die Wirkung von NKT-Zellen auf slanDCs evaluiert. Dabei verstärkten NKT-Zellen die Maturierung von slanDCs erheblich und führten zu einer signifikanten Steigerung der IL-12-Produktion sowie zu einer Reduktion der IL-10-Freisetzung in Abhängigkeit von IFN-gamma. Die gewonnenen Daten demonstrierten, dass NKT-Zellen und slanDCs zu einer gegenseitigen Aktivierung befähigt sind. Die im Rahmen dieser Dissertation gewonnenen Erkenntnisse zu den Interaktionen von slanDCs und NK- bzw. NKT-Zellen können einen wesentlichen Beitrag zum Verständnis der Immunabwehr von Tumoren leisten und die Konzeption neuer antitumoraler Therapiestrategien unterstützen.

Das kolorektale Karzinom (KRK) zählt zu den immunogenen Tumoren und zeichnet sich durch eine ausgeprägte Infiltration von verschiedenen Immunzell-Populationen aus. Dabei scheinen insbesondere CD8+ T-Lymphozyten und CD4+ T-Helfer-Zellen Typ 1 das Tumorwachstum zu beeinflussen und spielen somit eine zunehmende Rolle als prognostische Marker. Dementsprechend ergaben sich mehrere Hinweise, dass eine hohe Frequenz dieser beiden T-Zell-Populationen in KRK-Geweben mit einer erhöhten Überlebensrate assoziiert ist. Diese neuen Erkenntnisse könnten zukünftig in die Klassifikation des KRKs einfließen und therapeutische Entscheidungen beeinflussen. Im Gegensatz zu Tumor-infiltrierenden T-Zellen ist jedoch über die Frequenz und die Eigenschaften von nativen humanen dendritischen Zellen (DCs) in Kolonkarzinom-Geweben und deren mögliche Rolle in der immunologischen Abwehr von Tumoren nur sehr wenig bekannt. Als professionelle antigenpräsentierende Zellen spielen DCs eine Schlüsselrolle bei der Induktion und Aufrechterhaltung einer Tumor-gerichteten Immunantwort und können dadurch die Tumorentwicklung wesentlich beeinflussen. Daher wurden im Rahmen dieser Dissertation erstmalig Frequenz, Verteilung, Reifestatus und Zytokinexpression von 6-sulfo LacNAc+ (slan) DCs in Kolonkarzinom-Geweben sowie in korrespondierenden tumorfreien Kolon-Geweben untersucht. SlanDCs stellen eine große Subpopulation von humanen Blut-DCs dar, die nach Aktivierung hohe Konzentrationen von verschiedenen proinflammatorischen Zytokinen sezernieren. Darüber hinaus sind sie effizient in der Lage, die antitumoralen Eigenschaften von CD8+ T-Lymphozyten und CD4+ T-Helfer-Zellen sowie von Natürlichen Killer-Zellen zu fördern. Ausgehend von diesen Eigenschaften könnten slanDCs einen Beitrag zur Immunabwehr des Kolonkarzinoms leisten und somit das Tumorwachstum beeinflussen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde zunächst mit Hilfe immunhistochemischer Färbungen der Nachweis von slanDCs in Kolonkarzinom-Geweben erbracht. In diesem Zusammenhang konnte eine höhere Frequenz von slanDCs in Kolonkarzinom-Geweben (Mittelwert: 16,69 slanDCs/mm2, n=38) im Vergleich zu den korrespondierenden tumorfreien Geweben (Mittelwert: 9,25 slanDCs/mm2, n=38) detektiert werden. Des Weiteren wurde eine höhere Dichte von infiltrierenden slanDCs in Kolonkarzinom-Gewebeproben (Mittelwert: 18,85 slanDCs/mm2, n=20) im Vergleich zu plasmazytoiden DCs (Mittelwert: 4,86 pDCs/mm2, n=20), welche eine andere Subpopulation von humanen DCs im Blut repräsentieren, nachgewiesen. Ausgehend von diesen Erkenntnissen erfolgten verschiedene Immunfluoreszenzfärbungen zur Untersuchung des Reifestatus und der Zytokinexpression der Kolonkarzinom-infiltrierenden slanDCs. Dabei konnten in allen zehn untersuchten Tumorgeweben CD83-exprimierende slanDCs detektiert werden (Mittelwert: 46,7 % CD83+ slanDCs), was auf einen reifen Phänotyp dieser DCs hinweist. Zudem erfolgte der Nachweis einer Interleukin (IL)-23-Expression in variabler Ausprägung durch infiltrierende slanDCs in zehn von elf analysierten Kolonkarzinom-Geweben (Mittelwert: 33,8 % IL-23+ slanDCs). Dabei stellte sich heraus, dass slanDCs einen wesentlichen Anteil der IL-23-exprimierenden Zellen in einigen untersuchten Gewebeproben darstellen. Eine Expression von Tumornekrosefaktor durch Kolonkarzinom-infiltrierende slanDCs wurde hingegen nur in einer geringen Frequenz detektiert. Weitere Untersuchungen identifizierten slanDCs als neue zelluläre Komponente der T-Zell-Zone von tertiären lymphoiden Strukturen (TLS) der Tumorumgebung des Kolonkarzinoms. Darüber hinaus wies ein deutlicher Anteil der dort lokalisierten slanDCs einen reifen Phänotyp oder eine Expression von IL-23 auf. Ausgehend von diesen neuen Ergebnissen könnten die infiltrierenden slanDCs an der Modulation einer adaptiven Immunantwort in der T-Zell-Zone Kolonkarzinom-assoziierter TLS beteiligt sein und einen Einfluss auf das Tumorwachstum ausüben. Weiterhin könnte die Expression des proinflammatorischen Zytokins IL-23 durch slanDCs im Tumor-umgebenden Stroma und in den TLS eine Induktion IL-17-produzierender Zellen fördern und damit auf eine Beteiligung der slanDCs an einem entzündungsbedingten Fortschreiten der Tumorerkrankung über die IL-23/IL-17-Achse hindeuten. Insgesamt leisten die gewonnenen Erkenntnisse einen Beitrag zum Verständnis der Rolle von humanen nativen DCs im Kolonkarzinom und könnten die Entwicklung neuer immuntherapeutischer Strategien in der Behandlung dieser Tumorerkrankung fördern. / Colorectal cancer as an immunogenic tumor is characterized by a marked infiltration of different immune cell populations. Especially CD8+ T-lymphocytes and CD4+ T helper cells type 1 seem to influence tumor growth and therefore play an increasing role as prognostic markers. Thus, it has been shown that high densities of these T cell subsets are associated with improved survival of colorectal cancer patients. These new insights could become part of the classification of colorectal cancer and influence therapeutic decisions. Despite these studies, little is known about the frequency and properties of native human dendritic cells (DCs) in colon cancer tissues and their potential role in antitumor immunity. DCs as professional antigen-presenting cells are critical for the induction and maintenance of antitumor immunity and can essentially influence tumor progression. Thus, the frequency, distribution, maturation, and cytokine expression of 6-sulfo LacNAc+ (slan) DCs in colon cancer tissues as well as in corresponding tumor-free colon specimens were investigated. SlanDCs represent a subset of human blood DCs that secrete large amounts of proinflammatory cytokines upon activation. Furthermore slanDCs are able to efficiently activate CD4+ T cells, tumor-reactive CD8 + T cells, and natural killer cells. Due to these functional properties, slanDCs may contribute to antitumor immunity and may influence tumor growth. Within this doctoral thesis the presence of slanDCs in primary colon cancer samples was immunohistochemically verified. In this context, a higher frequency of slanDCs in colon cancer tissues (mean: 16,69 slanDCs/mm2, n=38) in comparison to the corresponding tumor-free specimens (mean: 9,25 slanDCs/mm2, n=38) could be detected. Moreover, higher frequencies of infiltrating slanDCs in colon cancer tissues (mean: 18,85 slanDCs/mm2, n=20) were detectable compared to plasmacytoid DCs (mean: 4,86 pDCs/mm2, n=20), representing another human blood DC-subset. Based on these results, various immunofluorescence stainings were performed to investigate maturation and cytokine expression of the infiltrating slanDCs. SlanDCs expressing the maturation marker CD83 were detected in all 10 analyzed colon cancer tissues (mean: 46,7% CD83+ slanDCs). In addition, IL-23-expressing slanDCs were present at varying percentages in 10 of 11 evaluated colon cancer samples (mean: 33,8% IL-23+ slanDCs). Interestingly, in several tissues slanDCs represented a marked proportion of all IL-23-expressing cells. However, slanDCs expressing tumor necrosis factor could only be detected in low frequencies in the analyzed colon cancer specimens. Further studies revealed that slanDCs are a novel component of the T-cell zone of colon cancer-associated tertiary lymphoid structures (TLS). A proportion of these TLS-associated slanDCs displays a mature phenotype or express IL-23. These novel findings indicate that slanDCs may modulate adaptive immune responses in the T-cell zone of colon cancer-associated TLS and may contribute to the regulation of tumor progression. Furthermore the IL-23-expressing slanDCs in the tumor-surrounding stroma and the TLS may promote the generation of IL-17-producing cells and may participate in inflammation-related cancer progression mediated by the IL-23/IL-17 axis. These novel observations can help to decipher the role of human native DCs in colon cancer and may have implications for the design of therapeutic strategies against this tumor entity.

Das kolorektale Karzinom (KRK) zählt zu den immunogenen Tumoren und zeichnet sich durch eine ausgeprägte Infiltration von verschiedenen Immunzell-Populationen aus. Dabei scheinen insbesondere CD8+ T-Lymphozyten und CD4+ T-Helfer-Zellen Typ 1 das Tumorwachstum zu beeinflussen und spielen somit eine zunehmende Rolle als prognostische Marker. Dementsprechend ergaben sich mehrere Hinweise, dass eine hohe Frequenz dieser beiden T-Zell-Populationen in KRK-Geweben mit einer erhöhten Überlebensrate assoziiert ist. Diese neuen Erkenntnisse könnten zukünftig in die Klassifikation des KRKs einfließen und therapeutische Entscheidungen beeinflussen. Im Gegensatz zu Tumor-infiltrierenden T-Zellen ist jedoch über die Frequenz und die Eigenschaften von nativen humanen dendritischen Zellen (DCs) in Kolonkarzinom-Geweben und deren mögliche Rolle in der immunologischen Abwehr von Tumoren nur sehr wenig bekannt. Als professionelle antigenpräsentierende Zellen spielen DCs eine Schlüsselrolle bei der Induktion und Aufrechterhaltung einer Tumor-gerichteten Immunantwort und können dadurch die Tumorentwicklung wesentlich beeinflussen. Daher wurden im Rahmen dieser Dissertation erstmalig Frequenz, Verteilung, Reifestatus und Zytokinexpression von 6-sulfo LacNAc+ (slan) DCs in Kolonkarzinom-Geweben sowie in korrespondierenden tumorfreien Kolon-Geweben untersucht. SlanDCs stellen eine große Subpopulation von humanen Blut-DCs dar, die nach Aktivierung hohe Konzentrationen von verschiedenen proinflammatorischen Zytokinen sezernieren. Darüber hinaus sind sie effizient in der Lage, die antitumoralen Eigenschaften von CD8+ T-Lymphozyten und CD4+ T-Helfer-Zellen sowie von Natürlichen Killer-Zellen zu fördern. Ausgehend von diesen Eigenschaften könnten slanDCs einen Beitrag zur Immunabwehr des Kolonkarzinoms leisten und somit das Tumorwachstum beeinflussen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde zunächst mit Hilfe immunhistochemischer Färbungen der Nachweis von slanDCs in Kolonkarzinom-Geweben erbracht. In diesem Zusammenhang konnte eine höhere Frequenz von slanDCs in Kolonkarzinom-Geweben (Mittelwert: 16,69 slanDCs/mm2, n=38) im Vergleich zu den korrespondierenden tumorfreien Geweben (Mittelwert: 9,25 slanDCs/mm2, n=38) detektiert werden. Des Weiteren wurde eine höhere Dichte von infiltrierenden slanDCs in Kolonkarzinom-Gewebeproben (Mittelwert: 18,85 slanDCs/mm2, n=20) im Vergleich zu plasmazytoiden DCs (Mittelwert: 4,86 pDCs/mm2, n=20), welche eine andere Subpopulation von humanen DCs im Blut repräsentieren, nachgewiesen. Ausgehend von diesen Erkenntnissen erfolgten verschiedene Immunfluoreszenzfärbungen zur Untersuchung des Reifestatus und der Zytokinexpression der Kolonkarzinom-infiltrierenden slanDCs. Dabei konnten in allen zehn untersuchten Tumorgeweben CD83-exprimierende slanDCs detektiert werden (Mittelwert: 46,7 % CD83+ slanDCs), was auf einen reifen Phänotyp dieser DCs hinweist. Zudem erfolgte der Nachweis einer Interleukin (IL)-23-Expression in variabler Ausprägung durch infiltrierende slanDCs in zehn von elf analysierten Kolonkarzinom-Geweben (Mittelwert: 33,8 % IL-23+ slanDCs). Dabei stellte sich heraus, dass slanDCs einen wesentlichen Anteil der IL-23-exprimierenden Zellen in einigen untersuchten Gewebeproben darstellen. Eine Expression von Tumornekrosefaktor durch Kolonkarzinom-infiltrierende slanDCs wurde hingegen nur in einer geringen Frequenz detektiert. Weitere Untersuchungen identifizierten slanDCs als neue zelluläre Komponente der T-Zell-Zone von tertiären lymphoiden Strukturen (TLS) der Tumorumgebung des Kolonkarzinoms. Darüber hinaus wies ein deutlicher Anteil der dort lokalisierten slanDCs einen reifen Phänotyp oder eine Expression von IL-23 auf. Ausgehend von diesen neuen Ergebnissen könnten die infiltrierenden slanDCs an der Modulation einer adaptiven Immunantwort in der T-Zell-Zone Kolonkarzinom-assoziierter TLS beteiligt sein und einen Einfluss auf das Tumorwachstum ausüben. Weiterhin könnte die Expression des proinflammatorischen Zytokins IL-23 durch slanDCs im Tumor-umgebenden Stroma und in den TLS eine Induktion IL-17-produzierender Zellen fördern und damit auf eine Beteiligung der slanDCs an einem entzündungsbedingten Fortschreiten der Tumorerkrankung über die IL-23/IL-17-Achse hindeuten. Insgesamt leisten die gewonnenen Erkenntnisse einen Beitrag zum Verständnis der Rolle von humanen nativen DCs im Kolonkarzinom und könnten die Entwicklung neuer immuntherapeutischer Strategien in der Behandlung dieser Tumorerkrankung fördern.:Abbildungsverzeichnis IV Tabellenverzeichnis VI Abkürzungsverzeichnis VII 1 Einleitung 1 1.1 Das humane Immunsystem 1 1.2 Dendritische Zellen 2 1.2.1 Phänotyp und Funktion dendritischer Zellen 3 1.2.2 Aktivierung von T-Lymphozyten durch dendritische Zellen 4 1.2.3 Subpopulationen humaner dendritischer Zellen 6 1.3 Interaktion von Immunsystem und Tumor 8 1.4 Infiltration von Tumoren durch Immunzellen 10 1.5 Kolonkarzinome 11 1.5.1 Entwicklung, Charakteristika und Klassifikation kolorektaler Karzinome 12 1.5.2 Therapieansätze des Kolonkarzinoms 14 1.6 Zielstellung 17 2 Material und Methoden 19 2.1 Material 19 2.1.1 Chemikalien und Reagenzien 19 2.1.2 Lösungen und Puffer 19 2.1.3 Testkitsysteme 19 2.1.4 Antikörper zur Detektion von Oberflächenmolekülen 20 2.1.5 Seren 20 2.1.6 Geräte 21 2.1.7 Sonstige Materialien 21 2.1.8 Gewebeproben 21 2.2 Methoden 23 2.2.1 Vorbereitung der Gewebeproben zur Immunmarkierung 23 2.2.2 Immunhistochemischer Nachweis von slanDCs und pDCs in Kolonkarzinom-Geweben und tumorfreien Kolon-Geweben 24 2.2.3 Untersuchung der Zytokinexpression von slanDCs in Kolonkarzinom-Geweben und tumorfreien Kolon-Geweben mit Fluoreszenzfärbungen 25 2.2.4 Nachweis der Expression von CD83 durch slanDCs in Kolonkarzinom-Geweben mit einer Fluoreszenzfärbung 26 2.2.5 Analyse einer Kolokalisation von slanDCs und CD3+ T-Lymphozyten in Kolonkarzinom-Geweben 26 2.2.6 Detektion von slanDCs in tertiären lymphoiden Strukturen von Kolonkarzinom-Geweben 26 2.2.7 Nachweis der Expression von CD83 und Interleukin-23 durch slanDCs in TLS von Kolonkarzinom-Geweben 28 2.2.8 Auswertung der immunhistochemischen Färbungen von slanDCs und pDCs in Kolonkarzinom-Geweben und in tumorfreien Kolon-Geweben 29 2.2.9 Statistik 30 3 Ergebnisse 31 3.1 Nachweis von slanDCs in Kolonkarzinom-Geweben 31 3.2 Assoziation der ermittelten Frequenz infiltrierender slanDCs mit der TNM-Klassifikation des Kolonkarzinoms 37 3.3 Nachweis von pDCs in Kolonkarzinom-Geweben 39 3.4 Expression von CD83 durch slanDCs in Kolonkarzinom-Geweben 42 3.5 Expression von Interleukin-23 durch slanDCs in Kolonkarzinom-Geweben 44 3.6 Expression von Tumornekrosefaktor durch slanDCs in Kolonkarzinom-Geweben 47 3.7 Kolokalisation von slanDCs und CD3+ T-Lymphozyten in Kolonkarzinom-Geweben 50 3.8 Detektion von slanDCs in tertiären lymphoiden Strukturen von Kolonkarzinom-Geweben 51 3.9 Expression von CD83 durch slanDCs in TLS von Kolonkarzinom-Geweben 54 3.10 Expression von IL-23 durch slanDCs in TLS von Kolonkarzinom-Geweben 56 4 Diskussion 57 4.1 DCs als zentrale Mediatoren einer Tumor-gerichteten Immunantwort 57 4.2 DCs als Komponente des Immunzellinfiltrats im Kolonkarzinom 58 4.2.1 Immunhistochemischer Nachweis von DCs in Kolonkarzinom-Geweben 58 4.2.2 Zielstrukturen eingesetzter Antikörper in immunhistochemischen Färbungen von DCs 60 4.2.3 SlanDCs als DC-Subpopulation in Kolonkarzinom-Geweben 61 4.3 Phänotyp infiltrierender slanDCs im Kolonkarzinom 64 4.3.1 Expression von CD83 durch slanDCs 64 4.3.2 Expression von Interleukin-23 durch slanDCs 67 4.3.3 Expression von Tumornekrosefaktor durch slanDCs 69 4.4 SlanDCs als Komponente von tertiären lymphoiden Strukturen im Kolonkarzinom 71 5 Zusammenfassung 75 6 Summary 77 7 Literaturverzeichnis 79 Anlage 1 91 Anlage 2 92 Danksagung 93 / Colorectal cancer as an immunogenic tumor is characterized by a marked infiltration of different immune cell populations. Especially CD8+ T-lymphocytes and CD4+ T helper cells type 1 seem to influence tumor growth and therefore play an increasing role as prognostic markers. Thus, it has been shown that high densities of these T cell subsets are associated with improved survival of colorectal cancer patients. These new insights could become part of the classification of colorectal cancer and influence therapeutic decisions. Despite these studies, little is known about the frequency and properties of native human dendritic cells (DCs) in colon cancer tissues and their potential role in antitumor immunity. DCs as professional antigen-presenting cells are critical for the induction and maintenance of antitumor immunity and can essentially influence tumor progression. Thus, the frequency, distribution, maturation, and cytokine expression of 6-sulfo LacNAc+ (slan) DCs in colon cancer tissues as well as in corresponding tumor-free colon specimens were investigated. SlanDCs represent a subset of human blood DCs that secrete large amounts of proinflammatory cytokines upon activation. Furthermore slanDCs are able to efficiently activate CD4+ T cells, tumor-reactive CD8 + T cells, and natural killer cells. Due to these functional properties, slanDCs may contribute to antitumor immunity and may influence tumor growth. Within this doctoral thesis the presence of slanDCs in primary colon cancer samples was immunohistochemically verified. In this context, a higher frequency of slanDCs in colon cancer tissues (mean: 16,69 slanDCs/mm2, n=38) in comparison to the corresponding tumor-free specimens (mean: 9,25 slanDCs/mm2, n=38) could be detected. Moreover, higher frequencies of infiltrating slanDCs in colon cancer tissues (mean: 18,85 slanDCs/mm2, n=20) were detectable compared to plasmacytoid DCs (mean: 4,86 pDCs/mm2, n=20), representing another human blood DC-subset. Based on these results, various immunofluorescence stainings were performed to investigate maturation and cytokine expression of the infiltrating slanDCs. SlanDCs expressing the maturation marker CD83 were detected in all 10 analyzed colon cancer tissues (mean: 46,7% CD83+ slanDCs). In addition, IL-23-expressing slanDCs were present at varying percentages in 10 of 11 evaluated colon cancer samples (mean: 33,8% IL-23+ slanDCs). Interestingly, in several tissues slanDCs represented a marked proportion of all IL-23-expressing cells. However, slanDCs expressing tumor necrosis factor could only be detected in low frequencies in the analyzed colon cancer specimens. Further studies revealed that slanDCs are a novel component of the T-cell zone of colon cancer-associated tertiary lymphoid structures (TLS). A proportion of these TLS-associated slanDCs displays a mature phenotype or express IL-23. These novel findings indicate that slanDCs may modulate adaptive immune responses in the T-cell zone of colon cancer-associated TLS and may contribute to the regulation of tumor progression. Furthermore the IL-23-expressing slanDCs in the tumor-surrounding stroma and the TLS may promote the generation of IL-17-producing cells and may participate in inflammation-related cancer progression mediated by the IL-23/IL-17 axis. These novel observations can help to decipher the role of human native DCs in colon cancer and may have implications for the design of therapeutic strategies against this tumor entity.:Abbildungsverzeichnis IV Tabellenverzeichnis VI Abkürzungsverzeichnis VII 1 Einleitung 1 1.1 Das humane Immunsystem 1 1.2 Dendritische Zellen 2 1.2.1 Phänotyp und Funktion dendritischer Zellen 3 1.2.2 Aktivierung von T-Lymphozyten durch dendritische Zellen 4 1.2.3 Subpopulationen humaner dendritischer Zellen 6 1.3 Interaktion von Immunsystem und Tumor 8 1.4 Infiltration von Tumoren durch Immunzellen 10 1.5 Kolonkarzinome 11 1.5.1 Entwicklung, Charakteristika und Klassifikation kolorektaler Karzinome 12 1.5.2 Therapieansätze des Kolonkarzinoms 14 1.6 Zielstellung 17 2 Material und Methoden 19 2.1 Material 19 2.1.1 Chemikalien und Reagenzien 19 2.1.2 Lösungen und Puffer 19 2.1.3 Testkitsysteme 19 2.1.4 Antikörper zur Detektion von Oberflächenmolekülen 20 2.1.5 Seren 20 2.1.6 Geräte 21 2.1.7 Sonstige Materialien 21 2.1.8 Gewebeproben 21 2.2 Methoden 23 2.2.1 Vorbereitung der Gewebeproben zur Immunmarkierung 23 2.2.2 Immunhistochemischer Nachweis von slanDCs und pDCs in Kolonkarzinom-Geweben und tumorfreien Kolon-Geweben 24 2.2.3 Untersuchung der Zytokinexpression von slanDCs in Kolonkarzinom-Geweben und tumorfreien Kolon-Geweben mit Fluoreszenzfärbungen 25 2.2.4 Nachweis der Expression von CD83 durch slanDCs in Kolonkarzinom-Geweben mit einer Fluoreszenzfärbung 26 2.2.5 Analyse einer Kolokalisation von slanDCs und CD3+ T-Lymphozyten in Kolonkarzinom-Geweben 26 2.2.6 Detektion von slanDCs in tertiären lymphoiden Strukturen von Kolonkarzinom-Geweben 26 2.2.7 Nachweis der Expression von CD83 und Interleukin-23 durch slanDCs in TLS von Kolonkarzinom-Geweben 28 2.2.8 Auswertung der immunhistochemischen Färbungen von slanDCs und pDCs in Kolonkarzinom-Geweben und in tumorfreien Kolon-Geweben 29 2.2.9 Statistik 30 3 Ergebnisse 31 3.1 Nachweis von slanDCs in Kolonkarzinom-Geweben 31 3.2 Assoziation der ermittelten Frequenz infiltrierender slanDCs mit der TNM-Klassifikation des Kolonkarzinoms 37 3.3 Nachweis von pDCs in Kolonkarzinom-Geweben 39 3.4 Expression von CD83 durch slanDCs in Kolonkarzinom-Geweben 42 3.5 Expression von Interleukin-23 durch slanDCs in Kolonkarzinom-Geweben 44 3.6 Expression von Tumornekrosefaktor durch slanDCs in Kolonkarzinom-Geweben 47 3.7 Kolokalisation von slanDCs und CD3+ T-Lymphozyten in Kolonkarzinom-Geweben 50 3.8 Detektion von slanDCs in tertiären lymphoiden Strukturen von Kolonkarzinom-Geweben 51 3.9 Expression von CD83 durch slanDCs in TLS von Kolonkarzinom-Geweben 54 3.10 Expression von IL-23 durch slanDCs in TLS von Kolonkarzinom-Geweben 56 4 Diskussion 57 4.1 DCs als zentrale Mediatoren einer Tumor-gerichteten Immunantwort 57 4.2 DCs als Komponente des Immunzellinfiltrats im Kolonkarzinom 58 4.2.1 Immunhistochemischer Nachweis von DCs in Kolonkarzinom-Geweben 58 4.2.2 Zielstrukturen eingesetzter Antikörper in immunhistochemischen Färbungen von DCs 60 4.2.3 SlanDCs als DC-Subpopulation in Kolonkarzinom-Geweben 61 4.3 Phänotyp infiltrierender slanDCs im Kolonkarzinom 64 4.3.1 Expression von CD83 durch slanDCs 64 4.3.2 Expression von Interleukin-23 durch slanDCs 67 4.3.3 Expression von Tumornekrosefaktor durch slanDCs 69 4.4 SlanDCs als Komponente von tertiären lymphoiden Strukturen im Kolonkarzinom 71 5 Zusammenfassung 75 6 Summary 77 7 Literaturverzeichnis 79 Anlage 1 91 Anlage 2 92 Danksagung 93