As células tronco espermatogoniais (SSCs) são caracterizadas pela capacidade de autorrenovação, proliferação e transmissão das informações genéticas. Em caninos a primeira tentativa de xenotransplante não obteve o sucesso da produção de espermatozoides, no entanto, há evidências de que as células testiculares xenogênicas podem ser transplantadas no testículo do animal hospedeiro, e gerar espermatozoides viáveis do doador. Portanto, este estudo tem como objetivo realizar o xenotransplante das células germinativas caninas em camundongos imunosuprimidos, e com isto promover à produção de espermatozoides caninos viáveis, geneticamente modificados. E por meio desta técnica, analisar a eficiência da espermatogênese pós-transplante. Células germinativas testiculares foram caracterizadas, isoladas e cultivadas de cães pré-púberes, por meio de sistemas de cultura de enriquecimento e fatores de crescimento. As células foram transduzidas com um gene repórter GFP e LacZ, e por um vetor lentiviral para indentificar as SSCs nos testículos receptores. As SSCs transduzidas foram transplantadas nos testículos de camundongos (C57BL/6) tratados com Busulfan, após diferentes períodos os animais receptores foram eutanasiados e analisados. Aos 10 dias de cultivo as células germinativas adultas foram positivas para CD49f, CD117, e com 5 dias uma expressão semelhante de GFRA1 e DAZL, demonstrando a presença de SSCs e algumas células em meiose. Transplantamos 105 células e 20-43% das células transplantadas foram identificadas na membrana basal dos túbulos seminíferos do animal receptor. Portanto, o transplante das células germinativas caninas, mostrou que a purificação e o cultivo realizados são possíveis para obter SSCs caninas, as quais colonizaram os túbulos seminíferos dos camundongos imunodeficientes e mantiveram-se vivas na membrana basal por 90 dias após transplante, mesmo que estes animais tenham distância filogenética / The spermatogonial stem cells (SSCs) are characterized by the capacity for self-renewal, proliferation and transmission of genetic information. In canines the first attempt to xenotransplantation did not achieve the success of sperm production. However, there is evidence that testicular xenogeneic cells can be transplanted into the testis of the host animal, and generate viable sperm donor. Therefore, this study aims conduct xenotransplantation of the canine germ cells in immunosuppressed mice, and thereby promote the production of viable sperm canines, genetically modified. And by this technique, analyze the efficiency of post-transplant spermatogenesis. Testicular germ cells were identified, isolated and cultured prepuberes dogs through enrichment culture systems and growth factors. Cells were modificated with a reporter gene GFP and LacZ. The SSCs canine was transplanted in mice (C57Bl/6), after different period and then the recipient animals were euthanized and analyzed. After 10 days in culture the germ cells were positive for CD49f, CD117, and 5 days a similar expression of GFRA1 and DAZL was observed, demonstrating the presence of SSCs and some cells in meiosis. 105 cells were transplanted and 20-43% of the transplanted cells were identified in the basement membrane of the seminiferous tubules after 90 days after transplantation. Therefore, the transplantation of canine germ cells showed that the cultivation and purification are performed possible for canine SSCs, it can colonize the seminiferous tubules the mice infertility remained alive in the basement membrane for 90 days after transplanting, even though these animals have phylogenetic distance

Orientador: Samuel Monroe Cohen / Resumo: O aumento da incidência de distúrbios testiculares e a possível influência de substâncias químicas ambientais, como o dibutilftalato (DBP) e a acrilamida (AA), exigem a identificação de modos de ação. A maioria dos estudos de toxicologia reprodutiva utiliza amostras de RNA provenientes de todo o testículo para avaliar a expressão genica; entretanto, análises de tipos celulares isolados poderiam gerar resultados mais específicos. Entre as células germinativas testiculares, as espermatogônias são importantes pois representam o início da espermatogênese. Este estudo objetivou, 1) estabelecer técnica de isolamento de espermatogônias; 2) aplicar esta técnica para verificar possíveis alterações na expressão gênica (Pou5f1, Kitlg, Mki-67, Bak1 e Spry4) em testículos de ratos pré-púberes (DPN24) e púberes (DPN45) após exposição in utero e pós-natal ao DBP ou à AA. A técnica foi eficiente para o isolamento das espermatogônias. A exposição ao DBP levou à redução do peso corporal da ninhada ao nascer, da distância anogenital dos filhotes machos no DPN4 e ao aumento da frequência de retenção de mamilos no DPN14. Os pesos relativos dos testículos expostos ao DBP estavam reduzidos apenas no DPN24. Animais expostos ao DBP mostraram níveis reduzidos de expressão de Pou5f1 e Mki67 no DPN24, e de Pou5f1 e Spry4 no DPN45. A exposição a AA reduziu a expressão de Pou5f1, Mki67 e Spry4, embora não significativamente. Nossos resultados sugerem que DBP atue reduzindo a proliferação celular e prejudi... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The increased incidence of testicular disorders in young men and the possible influence of environmental chemicals, such as dibutyl phthalate (DBP) and acrylamide (AA), requires experimental models for identifying modes of action. Most published reproductive toxicologic studies use RNA samples from the total testis to evaluate testicular gene expression; however, analyses of isolated cell types could provide a more specific tool. Among testicular germ cells, spermatogonia are critical since they represent the onset of spermatogenesis. This study aimed, 1) to establish a technique for spermatogonia isolation; 2) to apply this isolation technique to verify possible gene expression alterations (Pou5f1, Kitlg, Mki-67, Bak1 and Spry4) in prepubertal post-natal day, (PND24) and pubertal (PND45) testes after in utero and postnatal exposure to DBP or AA. The technique was efficient for isolation of a majority of spermatogonia. In utero DBP exposure led to reduced litter body weight at birth, reduced anogenital distance of male pups on PND4, and increased frequency of male nipple retention on PND14 compared to controls. DBP-exposed relative testes weights were reduced only at PND24 compared to control but they did not differ at PND45. DBP-exposed animals showed reduced expression levels of Pou5f1 and Mki67 on PND24, and reduced expression of Pou5f1 and Spry4 on PND45. AA exposure reduced expression of Pou5f1, Mki67 and Spry4 at PND45 although not significantly. Our results suggest tha... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

O objetivo deste trabalho foi o de avaliar o efeito da suplementação da dieta de Tilápias (Oreochromis niloticus) utilizando sal comercial composto dos microminerais cobre, manganês e zinco, sobre a histologia e o desenvolvimento das gônadas dos machos. Foram utilizados 1200 machos masculinizados de tilápia, com média de peso de 120g, suplementadas com níveis crescentes (0,00; 0,35; 0,70; 1,05; 1,40 e 1,75 mg/kg) de um produto comercial composto por Cu 13,40 g/kg; Mn 26,70 g/kg e Zn 66,70 g/kg. O experimento foi conduzido em um sistema de recirculação de água, composto por 24 tanques divididos ao meio totalizando 48 unidades experimentais. O delineamento experimental foi inteiramente casualizado, com medidas repetidas no tempo. As biometrias e coletas foram realizadas em 16 e 32 semanas de experimento, para avaliar o desenvolvimento dos peixes. As gônadas coletadas foram preparadas e cortadas para confecção de lamina histológica, após coradas com hematoxilina e eosina, e posteriormente fotografadas, utilizando microscópio com câmera acoplada. A contagem das fotos foi realizada manualmente, e avaliou-se o número de células por mm3, para espermatogônias, espermatócitos, espermátides e espermatozoides. As correlações entre número de espermatozoides, espermatócitos, espermátides e tratamentos foi de -0,30, -0,20 e -0,30, respectivamente, demonstrando que o efeito da suplementação crescente com o sal, é prejudicial para o desenvolvimento das células reprodutivas masculinas. Foi observado que os tratamentos com adição igual ou superior a 0,70 mg/kg do sal comercial causaram danos as gônadas para os parâmetros da gametogênese de número de espermatócitos, espermátides e espermatozoides. Sendo assim, a utilização de sais que contenham combinação de Cu 13,40 g/kg; Mn 26,70 g/kg e Zn 66,70 g/kg reprodutores machos de tilápia, não é recomendada em função dos danos causados nas etapas da gametogênese, reduzindo a produção de espermatozoides. / The objective of this study was to evaluate the effect of supplementing the diet of tilapia (Oreochromis niloticus) using commercial salt compound of micro minerals copper, manganese and zinc, on the histology and gonadal development of males. A total of 1200 masculinized male tilapia were used, with 120 g average weight, supplemented with increasing levels (0.00, 0.35, 0.70, 1.05, 1.40 and 1.75 mg / kg) of a product commercial composed of Cu 13,40 g/kg; Mn 26,70 g/kg e Zn 66,70 g/kg. The trial was conducted in a water recirculation system, consisting of 24 tanks divided in half, totaling 48 experimental units. The experimental design was completely randomized with repeated measures over time. The biometry and samples were taken at 16 and 32 weeks of experiment, to evaluate the fish development. The collected gonads were prepared and sliced for making histological slide, after stained with hematoxylin and eosin, and then photographed using a microscope with attached camera. The count of the photos was performed manually, and was rated the number of cells per mm3 to spermatogonia, spermatocytes, spermatids and sperm cell. The correlations between the number of spermatozoa, spermatocytes, spermatids and treatments was of -0.30, -0.20 and -0.30, respectively, demonstrating that the effect of increasing supplementation of the salt is detrimental to the development of male reproductive cells. It was observed that the addition equal or superior to 0.70 mg / kg of commercial salt caused damage in the gonads for gametogenesis parameters number of spermatocytes, spermatids and sperma cell. Thus, the use of combination of salts containing 13.40 g Cu / kg; Mn 26.70 g / kg Zn and 66.70 g / kg breeding male tilapia is not recommended due to the damage caused in the stages of gametogenesis, reducing the sperm production.

Submitted by PRICILA VIANA DE OLIVEIRA null (biologa.prila@gmail.com) on 2016-05-13T19:12:08Z No. of bitstreams: 1 Dissertação Versão Final Pricila.pdf: 8047719 bytes, checksum: 2522aa1eeab9bf3e055ddc9ca38d23c1 (MD5) / Approved for entry into archive by Juliano Benedito Ferreira (julianoferreira@reitoria.unesp.br) on 2016-05-18T16:29:25Z (GMT) No. of bitstreams: 1 oliveira_pv_me_ilha.pdf: 8047719 bytes, checksum: 2522aa1eeab9bf3e055ddc9ca38d23c1 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-18T16:29:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 oliveira_pv_me_ilha.pdf: 8047719 bytes, checksum: 2522aa1eeab9bf3e055ddc9ca38d23c1 (MD5) Previous issue date: 2016-03-03 / A influência antrópica vem crescendo continuamente no ambiente, legitimando a importância de se investigar as causas de estresse aos animais nos sistemas naturais no qual se encontram. Como resultados a essas ações houve um aquecimento linear de 0,85 ºC nas últimas décadas e, estudos demonstram que essa temperatura pode aumentar em 4,8 ºC até 2100. A compreensão da atuação da temperatura sobre os animais aquáticos contribui significativamente para as previsões dos efeitos na população e níveis de comunidades, já que poucos fatores ambientais têm maior influência sobre a atividade animal do que a temperatura, devido a exposição física externa. O objetivo deste trabalho foi investigar a influência de diferentes temperaturas sobre o ciclo testicular e a espermatogênese de D. aequipinnatus. Para o presente estudo foram utilizados exemplares machos de D. aequipinnatus. Foram testadas três temperaturas 18º, 24º e 30º e utilizados 20 exemplares para cada temperatura. As coletas foram realizadas em um intervalo de 4 dias, totalizando 10 coletas, onde cinco indivíduos de cada tratamento foram coletados. Após aferidos dados biométricos os testículos foram submetidos a procedimentos usuais de histologia. As lâminas obtidas foram analisadas sob microscopia de luz. Para a análise estereológica, utilizou-se um grid de intersecção de 475 pontos (Motic Image Plus 2.0), sobreposto a uma área da secção histológica; foram contados os seguintes componentes: espermatogônias, espermatócitos, espermátides, espermatozoides, células de Sertoli, células com núcleo picnótico, interstício e lúmen. Para análise estatística, aplicou-se o teste de homogeneidade de Bartlett e o teste de normalidade de Shapiro Wilk. Quando atenderam as premissas, aplicou-se ANOVA e teste de Tukey (P<0.05), quando não, foi aplicado o teste de Kruskal Wallis. As fases de maturação gonadal encontradas foram maturação intermediária, maturação final - dividida em maturação final 1, maturação final 2, maturação final 3 e maturação final 4 – e regressão (somente em 18º), que apresenta características de reabsorção e proliferação celular ocorrendo na mesma fase. Os maiores valores de IGS ocorreram em indivíduos em maturação final 1. A temperatura de 30º acelerou a espermatogênese, e 18 ºC proporcionou período reprodutivo mais longo; porém na temperatura de 30 ºC houveram danos a morfologia testicular, causando uma desorganização gonadal e a supressão da espermatogênese nas regiões lesadas. Em 18 ºC houve a formação de vacúolos no citoplasma e núcleo das de espermatogônias e espermatócitos. Além disso, o número de células picnóticas foi maior em 18 ºC e 30 ºC, em relação ao controle. Indivíduos mantidos a 30º apresentaram maior número de espermatogônias. / The human influence has been growing continuosly in the environment, legitimizing the importance of investigating the causes of stress to animals in natural systems in which they are. As a result of these actions there was a linear heating of 0.85 ° C in recent decades, and studies show that this temperature could increase in 4.8 ° C until 2100. Understanding the temperature acting on aquatic animals contributes significantly to the predictions of the effects on population and levels of communities, as few environmental factors have the greatest influence on animal activity than the temperature due to external physical exposure. The aim of this study was to investigate the influence of different temperatures on testicular cycle and spermatogenesis of D. aequipinnatus. For this study were used copies males D. aequipinnatus. Three temperatures were tested 18 ºC, 24 ºC and 30 ºC, and used 20 specimens for each temperature. Samples were collected in a four-day intervals, totaling 10 collections, in which five individuals from each treatment were collected. After measured biometric data testes underwent usual histology procedures. The obtained slides were examined under light microscopy. For stereological analysis, we used a 475 grid intersection points (Motic Image Plus 2.0) overlapping an area of the histological section; were counted the following components: spermatogonia, spermatocytes, spermatids, spermatozoa, Sertoli cells, cells with pyknotic nucleus, interstitium and lumen. Statistical analysis was applied Bartlett's homogeneity test and the Shapiro-Wilk normality test. When met the assumptions applied ANOVA and Tukey test (P <0.05), if not, we applied the Kruskal Wallis test. It was found of intermediate maturation, final maturation - divided into: final maturation 1, final maturing 2, final maturation 3 and final maturation 4 - and regression (only 18ºC) having cell resorption and proliferation characteristics occurring in the same phase. The highest GSI values occurred in individuals in final maturation 1. Temperature of 30 ºC accelerated spermatogenesis, and 18 ° C provided a longer reproductive period; but at the temperature of 30 ° C there were damage to testicular morphology, causing gonadal disruption and suppression of spermatogenesis in the damaged regions. At 18 ° C was the vacuole formation in the cytoplasm and nucleus of spermatogonia and spermatocytes. Furthermore, the number of cells was higher in picnotic 18 ° C and 30 ° C, compared to the control. Animals kept at 30 ºC showed greater number of spermatogonia.

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:49:51Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-02-22 / As espermatogônias tronco são células responsáveis pela produção contínua dos gametas masculinos, os espermatozóides. Essas células se diferenciam a partir dos gonócitos, porém, pouco se sabe sobre sua biologia e sobre os processos pelos quais elas se diferenciam. Embora sejam células de grande importância, não há informações precisas sobre a dinâmica de formação dessas células a partir dos gonócitos nem sobre o número total e a distribuição das espermatogônias indiferenciadas nos testículos, o que dificulta a interpretação de estudos nessa área. A proposta deste trabalho foi analisar a proliferação, morte e distribuição dos gonócitos e pré-espermatogônias nos testículos de ratos no desenvolvimento embrionário e pós-natal, em períodos críticos do desenvolvimento testicular. Foram utilizados ratos com idades de 19dpc, 1, 3, 5, 8, 11 e 15dpp, cujos testículos foram analisados quanto à distribuição, proliferação e apoptose dos gonócitos e pré-espermatogônias durante o desenvolvimento testicular. A análise morfológica dos testículos, o método de TUNEL, a imunomarcação das proteínas p53 e caspase-3 clivada foram empregados para investigação de apoptose, enquanto a densidade numérica (Nv), quantificação de gonócitos, densidade de comprimento cordonal (Lv), comprimento cordonal total (L), volume total dos cordões seminíferos e estimativa do número total de gonócitos foram utilizados para investigação da distribuição dessas células. A citometria de fluxo foi empregada para avaliar a proliferação dos gonócitos através do uso do kit Guava Cell Cycle. Para identificar as espermatogônias indiferenciadas nas idades de 11 e 15dpc foi utilizada a imunomarcação da proteína OCT4. Durante a análise morfológica testicular observou-se que ocorre redução do número de gonócitos por seção testicular nos primeiros cinco dias após o nascimento e que as primeiras espermatogônias são observadas aos 8dpp. Foi observado aumento da Lv nos animais de 1dpp em relação aos de 19dpc. Dos 3 aos 11dpp, houve aumento progressivo da Lv, que voltou a diminuir aos 15dpp. Houve crescimento muito acentuado dos cordões seminíferos entre 19dpc e 1dpp. Após o nascimento, o crescimento continuou até os 15dpp, mas foi menos intenso. Já a Nv de gonócitos foi inversamente proporcional ao crescimento testicular, enquanto o número estimado de gonócitos foi cerca de quatro vezes maior aos 1dpp em relação aos de 19dpc. Isto explica os dados obtidos a partir da análise morfológica na qual a frequência de gonócitos por seção testicular diminuiu nos cinco primeiros dias após o nascimento. Após o nascimento, o número de gonócitos permaneceu estável até os 5dpp, sugerindo que não há morte ou proliferação dessas células nessas idades. Não foram detectados gonócitos em apoptose nas idades estudadas, embora corpos apoptóticos tenham sido observados. Esses corpos apoptóticos eram muito raros dos 19dpc aos 5dpp e começaram a se tornar mais frequentes aos 8dpp, atingindo sua frequência máxima aos 15dpp. Também aos 15dpp, células positivas para TUNEL e caspase 3 clivada foram observadas, mas essas células não puderam ser identificadas devido ao fato de sua morfologia já estar consideravelmente alterada. Contudo, todos os gonócitos de 19dpc até 8dpp foram positivos ao emprego da caspase-3 clivada, embora apresentassem morfologia normal. Isto indica que a caspase-3 clivada pode ter outra função, que não seja apoptótica, no desenvolvimento dos gonócitos. A análise ao citômetro de fluxo nas idades de 19dpc a 5dpp mostrou que mais da metade dos gonócitos encontravam-se em fase G0/G1 do ciclo celular, indicando que muitas estão em quiescência nestas idades. Não houve marcação da proteína OCT4 nas espermatogônias, o que impossibilitou a quantificação dessas células nas idades de 8, 11 e 15dpp. Os dados do presente estudo sugerem que a diminuição da frequência de gonócitos por seção testicular nos primeiros dias após o nascimento não é consequência de apoptose dessas células, como tem sido sugerido na literatura, mas sim de sua redistribuição ao longo dos cordões seminíferos. Como não há indícios de que estas células estejam proliferando nessas idades, menos gonócitos são observados por seção testicular. Concluiu-se ainda que a proteína OCT4 não está presente nos testículos de rato nas idades pós-natais, diferentemente do observado em camundongo. Estudos estão sendo realizados para verificar quando os gonócitos retomam a proliferação, quando a população definitiva de espermatogônias tronco é formada e quais seriam os marcadores ideais para estudos das espermatogônias indiferenciadas no rato. / Spermatogonial stem cells (SSC) are responsible for the constant production of the male gamete. These cells differentiate from the gonocytes, but little is known about its biology and about the mechanisms of their differentiation. Despite the importance of these cells, the information about the dynamic of formation of these cells from the gonocytes or about the total number and distribution of the undifferentiated spermatogonia is not precise, causing problems to the interpretation of the studies in this area. The goal of this study was to analyze the proliferation, death and distribution of the gonocytes and pre-spermatogonia in the rat testis in embryonic and postnatal life. Rat testes were collected at 19dpc and at 1, 3, 5, 8, 11 and 15dpp for the analysis of the distribution, proliferation and apoptosis of the gonocytes and pre-spermatogonia during key periods of testicular development. To investigate gonocyte apoptosis, four methods were used: morphological analysis, TUNEL method and immunostaining of p53 and cleaved caspase 3. The number of gonocytes was investigated using the numerical density (Nv) and an estimative of the total number of these cells was obtained. These data were associated with the seminiferous cord length density (Lv), the total cordonal length (L) the total volume of the seminiferous cords and the total estimated number of gonocytes were used to investigate the distribution of these cells. Guava flow citometry was used to evaluate the proliferation of the gonocytes. To identify the undifferentiated spermatogonia at 11 and 15dpp, OCT4 labeling was used. During testicular morphological analysis it was observed a reduction of the number of the gonocytes per testicular section during the first five days after birth and the first spermatogonial cells were seen at 8dpp. The Lv increased in the 1dpp rats in relation to 19dpc rats. From 3 to 11dpp, Lv increased progressively and subsequently decreased at 15dpp. There was very accentuated growth of the seminiferous cords (L) between 19dpc and 1dpp. The growth progressed until 15dpp, although it was less intense. The gonocyte Nv was inversely proportional to the seminiferous cord growth, while the total estimated number of gonocytes was about four times higher at 1dpp in relation to the 19dpc embryos. This explains the data obtained from morphological analysis, in which the frequency of gonocytes per testicular section decreased in the first days after birth. The number of gonocytes remained stable from 1 to 5dpp, suggesting that the gonocytes do not die or proliferate in this period. Apoptotic gonocytes were not detected in all ages, although apoptotic bodies were observed. These apoptotic bodies were rare between 19dpc and 5dpp, and at 8dpp they became more frequent, and reached the highest frequency at 15dpp. Also at 15dpp, TUNEL positive-cells and cleaved caspase3-positive cells were observed, although these cells could not be indentified due to the fact that their morphology was already changed. Nevertheless, all gonocytes between 19dpc and 8dpp were positive to cleaved caspase-3, although they presented normal morphology. This suggests that cleaved caspase-3 could have other function that not apoptotic in gonocytes development. The flow citometry analysis between 19dpc and 5dpp showed that more than half of the gonocytes was at G0/G1 phase of the cell cycle, proving that lots of them are quiescent in these ages. There were no OCT4-positive spermatogonia, what impaired the quantification of these cells at 8, 11 and 15dpp. The data of this study suggest that the decrease in the frequency of gonocytes per testicular section in the first days after birth is not due to apoptosis, as has been suggested in the literature, but rather to their redistribution throughout the seminiferous cords. Since there is no evidence that these cells are proliferating in these ages, less gonocytes are seen per testicular section. It has also been concluded that OCT4 protein is not present in rat testis in postnatal ages, differing from what is observed in the mouse testis. Further studies are been performed to verify when gonocytes resume its proliferation, when the final SSC population is established and which markers could be useful to study undifferentiated spermatogonia in the rat. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

O objetivo deste trabalho foi o de avaliar o efeito da suplementação da dieta de Tilápias (Oreochromis niloticus) utilizando sal comercial composto dos microminerais cobre, manganês e zinco, sobre a histologia e o desenvolvimento das gônadas dos machos. Foram utilizados 1200 machos masculinizados de tilápia, com média de peso de 120g, suplementadas com níveis crescentes (0,00; 0,35; 0,70; 1,05; 1,40 e 1,75 mg/kg) de um produto comercial composto por Cu 13,40 g/kg; Mn 26,70 g/kg e Zn 66,70 g/kg. O experimento foi conduzido em um sistema de recirculação de água, composto por 24 tanques divididos ao meio totalizando 48 unidades experimentais. O delineamento experimental foi inteiramente casualizado, com medidas repetidas no tempo. As biometrias e coletas foram realizadas em 16 e 32 semanas de experimento, para avaliar o desenvolvimento dos peixes. As gônadas coletadas foram preparadas e cortadas para confecção de lamina histológica, após coradas com hematoxilina e eosina, e posteriormente fotografadas, utilizando microscópio com câmera acoplada. A contagem das fotos foi realizada manualmente, e avaliou-se o número de células por mm3, para espermatogônias, espermatócitos, espermátides e espermatozoides. As correlações entre número de espermatozoides, espermatócitos, espermátides e tratamentos foi de -0,30, -0,20 e -0,30, respectivamente, demonstrando que o efeito da suplementação crescente com o sal, é prejudicial para o desenvolvimento das células reprodutivas masculinas. Foi observado que os tratamentos com adição igual ou superior a 0,70 mg/kg do sal comercial causaram danos as gônadas para os parâmetros da gametogênese de número de espermatócitos, espermátides e espermatozoides. Sendo assim, a utilização de sais que contenham combinação de Cu 13,40 g/kg; Mn 26,70 g/kg e Zn 66,70 g/kg reprodutores machos de tilápia, não é recomendada em função dos danos causados nas etapas da gametogênese, reduzindo a produção de espermatozoides. / The objective of this study was to evaluate the effect of supplementing the diet of tilapia (Oreochromis niloticus) using commercial salt compound of micro minerals copper, manganese and zinc, on the histology and gonadal development of males. A total of 1200 masculinized male tilapia were used, with 120 g average weight, supplemented with increasing levels (0.00, 0.35, 0.70, 1.05, 1.40 and 1.75 mg / kg) of a product commercial composed of Cu 13,40 g/kg; Mn 26,70 g/kg e Zn 66,70 g/kg. The trial was conducted in a water recirculation system, consisting of 24 tanks divided in half, totaling 48 experimental units. The experimental design was completely randomized with repeated measures over time. The biometry and samples were taken at 16 and 32 weeks of experiment, to evaluate the fish development. The collected gonads were prepared and sliced for making histological slide, after stained with hematoxylin and eosin, and then photographed using a microscope with attached camera. The count of the photos was performed manually, and was rated the number of cells per mm3 to spermatogonia, spermatocytes, spermatids and sperm cell. The correlations between the number of spermatozoa, spermatocytes, spermatids and treatments was of -0.30, -0.20 and -0.30, respectively, demonstrating that the effect of increasing supplementation of the salt is detrimental to the development of male reproductive cells. It was observed that the addition equal or superior to 0.70 mg / kg of commercial salt caused damage in the gonads for gametogenesis parameters number of spermatocytes, spermatids and sperma cell. Thus, the use of combination of salts containing 13.40 g Cu / kg; Mn 26.70 g / kg Zn and 66.70 g / kg breeding male tilapia is not recommended due to the damage caused in the stages of gametogenesis, reducing the sperm production.

Orientador: Rosicleire Veríssimo-Silveira / Resumo: A influência antrópica vem crescendo continuamente no ambiente, legitimando a importância de se investigar as causas de estresse aos animais nos sistemas naturais no qual se encontram. Como resultados a essas ações houve um aquecimento linear de 0,85 ºC nas últimas décadas e, estudos demonstram que essa temperatura pode aumentar em 4,8 ºC até 2100. A compreensão da atuação da temperatura sobre os animais aquáticos contribui significativamente para as previsões dos efeitos na população e níveis de comunidades, já que poucos fatores ambientais têm maior influência sobre a atividade animal do que a temperatura, devido a exposição física externa. O objetivo deste trabalho foi investigar a influência de diferentes temperaturas sobre o ciclo testicular e a espermatogênese de D. aequipinnatus. Para o presente estudo foram utilizados exemplares machos de D. aequipinnatus. Foram testadas três temperaturas 18º, 24º e 30º e utilizados 20 exemplares para cada temperatura. As coletas foram realizadas em um intervalo de 4 dias, totalizando 10 coletas, onde cinco indivíduos de cada tratamento foram coletados. Após aferidos dados biométricos os testículos foram submetidos a procedimentos usuais de histologia. As lâminas obtidas foram analisadas sob microscopia de luz. Para a análise estereológica, utilizou-se um grid de intersecção de 475 pontos (Motic Image Plus 2.0), sobreposto a uma área da secção histológica; foram contados os seguintes componentes: espermatogônias, espermatócitos, esper... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The human influence has been growing continuosly in the environment, legitimizing the importance of investigating the causes of stress to animals in natural systems in which they are. As a result of these actions there was a linear heating of 0.85 ° C in recent decades, and studies show that this temperature could increase in 4.8 ° C until 2100. Understanding the temperature acting on aquatic animals contributes significantly to the predictions of the effects on population and levels of communities, as few environmental factors have the greatest influence on animal activity than the temperature due to external physical exposure. The aim of this study was to investigate the influence of different temperatures on testicular cycle and spermatogenesis of D. aequipinnatus. For this study were used copies males D. aequipinnatus. Three temperatures were tested 18 ºC, 24 ºC and 30 ºC, and used 20 specimens for each temperature. Samples were collected in a four-day intervals, totaling 10 collections, in which five individuals from each treatment were collected. After measured biometric data testes underwent usual histology procedures. The obtained slides were examined under light microscopy. For stereological analysis, we used a 475 grid intersection points (Motic Image Plus 2.0) overlapping an area of the histological section; were counted the following components: spermatogonia, spermatocytes, spermatids, spermatozoa, Sertoli cells, cells with pyknotic nucleus, interstitium and lume... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

O objetivo deste trabalho foi o de avaliar o efeito da suplementação da dieta de Tilápias (Oreochromis niloticus) utilizando sal comercial composto dos microminerais cobre, manganês e zinco, sobre a histologia e o desenvolvimento das gônadas dos machos. Foram utilizados 1200 machos masculinizados de tilápia, com média de peso de 120g, suplementadas com níveis crescentes (0,00; 0,35; 0,70; 1,05; 1,40 e 1,75 mg/kg) de um produto comercial composto por Cu 13,40 g/kg; Mn 26,70 g/kg e Zn 66,70 g/kg. O experimento foi conduzido em um sistema de recirculação de água, composto por 24 tanques divididos ao meio totalizando 48 unidades experimentais. O delineamento experimental foi inteiramente casualizado, com medidas repetidas no tempo. As biometrias e coletas foram realizadas em 16 e 32 semanas de experimento, para avaliar o desenvolvimento dos peixes. As gônadas coletadas foram preparadas e cortadas para confecção de lamina histológica, após coradas com hematoxilina e eosina, e posteriormente fotografadas, utilizando microscópio com câmera acoplada. A contagem das fotos foi realizada manualmente, e avaliou-se o número de células por mm3, para espermatogônias, espermatócitos, espermátides e espermatozoides. As correlações entre número de espermatozoides, espermatócitos, espermátides e tratamentos foi de -0,30, -0,20 e -0,30, respectivamente, demonstrando que o efeito da suplementação crescente com o sal, é prejudicial para o desenvolvimento das células reprodutivas masculinas. Foi observado que os tratamentos com adição igual ou superior a 0,70 mg/kg do sal comercial causaram danos as gônadas para os parâmetros da gametogênese de número de espermatócitos, espermátides e espermatozoides. Sendo assim, a utilização de sais que contenham combinação de Cu 13,40 g/kg; Mn 26,70 g/kg e Zn 66,70 g/kg reprodutores machos de tilápia, não é recomendada em função dos danos causados nas etapas da gametogênese, reduzindo a produção de espermatozoides. / The objective of this study was to evaluate the effect of supplementing the diet of tilapia (Oreochromis niloticus) using commercial salt compound of micro minerals copper, manganese and zinc, on the histology and gonadal development of males. A total of 1200 masculinized male tilapia were used, with 120 g average weight, supplemented with increasing levels (0.00, 0.35, 0.70, 1.05, 1.40 and 1.75 mg / kg) of a product commercial composed of Cu 13,40 g/kg; Mn 26,70 g/kg e Zn 66,70 g/kg. The trial was conducted in a water recirculation system, consisting of 24 tanks divided in half, totaling 48 experimental units. The experimental design was completely randomized with repeated measures over time. The biometry and samples were taken at 16 and 32 weeks of experiment, to evaluate the fish development. The collected gonads were prepared and sliced for making histological slide, after stained with hematoxylin and eosin, and then photographed using a microscope with attached camera. The count of the photos was performed manually, and was rated the number of cells per mm3 to spermatogonia, spermatocytes, spermatids and sperm cell. The correlations between the number of spermatozoa, spermatocytes, spermatids and treatments was of -0.30, -0.20 and -0.30, respectively, demonstrating that the effect of increasing supplementation of the salt is detrimental to the development of male reproductive cells. It was observed that the addition equal or superior to 0.70 mg / kg of commercial salt caused damage in the gonads for gametogenesis parameters number of spermatocytes, spermatids and sperma cell. Thus, the use of combination of salts containing 13.40 g Cu / kg; Mn 26.70 g / kg Zn and 66.70 g / kg breeding male tilapia is not recommended due to the damage caused in the stages of gametogenesis, reducing the sperm production.

As células tronco espermatogoniais (SSCs) são caracterizadas pela capacidade de autorrenovação, proliferação e transmissão das informações genéticas. Em caninos a primeira tentativa de xenotransplante não obteve o sucesso da produção de espermatozoides, no entanto, há evidências de que as células testiculares xenogênicas podem ser transplantadas no testículo do animal hospedeiro, e gerar espermatozoides viáveis do doador. Portanto, este estudo tem como objetivo realizar o xenotransplante das células germinativas caninas em camundongos imunosuprimidos, e com isto promover à produção de espermatozoides caninos viáveis, geneticamente modificados. E por meio desta técnica, analisar a eficiência da espermatogênese pós-transplante. Células germinativas testiculares foram caracterizadas, isoladas e cultivadas de cães pré-púberes, por meio de sistemas de cultura de enriquecimento e fatores de crescimento. As células foram transduzidas com um gene repórter GFP e LacZ, e por um vetor lentiviral para indentificar as SSCs nos testículos receptores. As SSCs transduzidas foram transplantadas nos testículos de camundongos (C57BL/6) tratados com Busulfan, após diferentes períodos os animais receptores foram eutanasiados e analisados. Aos 10 dias de cultivo as células germinativas adultas foram positivas para CD49f, CD117, e com 5 dias uma expressão semelhante de GFRA1 e DAZL, demonstrando a presença de SSCs e algumas células em meiose. Transplantamos 105 células e 20-43% das células transplantadas foram identificadas na membrana basal dos túbulos seminíferos do animal receptor. Portanto, o transplante das células germinativas caninas, mostrou que a purificação e o cultivo realizados são possíveis para obter SSCs caninas, as quais colonizaram os túbulos seminíferos dos camundongos imunodeficientes e mantiveram-se vivas na membrana basal por 90 dias após transplante, mesmo que estes animais tenham distância filogenética / The spermatogonial stem cells (SSCs) are characterized by the capacity for self-renewal, proliferation and transmission of genetic information. In canines the first attempt to xenotransplantation did not achieve the success of sperm production. However, there is evidence that testicular xenogeneic cells can be transplanted into the testis of the host animal, and generate viable sperm donor. Therefore, this study aims conduct xenotransplantation of the canine germ cells in immunosuppressed mice, and thereby promote the production of viable sperm canines, genetically modified. And by this technique, analyze the efficiency of post-transplant spermatogenesis. Testicular germ cells were identified, isolated and cultured prepuberes dogs through enrichment culture systems and growth factors. Cells were modificated with a reporter gene GFP and LacZ. The SSCs canine was transplanted in mice (C57Bl/6), after different period and then the recipient animals were euthanized and analyzed. After 10 days in culture the germ cells were positive for CD49f, CD117, and 5 days a similar expression of GFRA1 and DAZL was observed, demonstrating the presence of SSCs and some cells in meiosis. 105 cells were transplanted and 20-43% of the transplanted cells were identified in the basement membrane of the seminiferous tubules after 90 days after transplantation. Therefore, the transplantation of canine germ cells showed that the cultivation and purification are performed possible for canine SSCs, it can colonize the seminiferous tubules the mice infertility remained alive in the basement membrane for 90 days after transplanting, even though these animals have phylogenetic distance

Space flight has been shown to have many adverse effects on various systems throughout the body. Because the opportunity to place research animals on board a Space Shuttle or the International Space Station is infrequent, various techniques have been designed to simulate the effects of microgravity in Earth based laboratories. A commonly used technique is known as antiorthostatic suspension, also often referred to as hind limb suspension. In this technique the hind portion of the animal is raised so that its hind limbs are non-weight bearing. This places the animal in roughly a 30° head down tilt position. This results in cephalic fluid shifts similar to those seen in actual space flight. This technique has also been shown to mimic other physiological parameters that are affected during space flight. This study examined testicular tissue from rats subjected to a 7 day antiorthostatic suspension. This tissue was acquired through a tissue sharing program and some of the experimental animals were injected with Interleukin 1 receptor antagonist (IL-1ra) which was hoped to ameliorate some of the effects of antiorthostatic suspension. The injection of IL-1ra was not expected to have any effect on testicular tissue, however this tissue was included in the morphological and statistical analysis to conduct a more complete study. All tissues were embedded in paraffin, sectioned, and stained using standard H&E staining. The tissue was then qualitatively ranked according to the "health" of the seminiferous tubules. Our findings indicate that 7 days of antiorthostatic suspension had adverse effects on the tissue that comprises the walls of the seminiferous tubules. It has long been known that antiorthostatic suspension has deleterious effects on testicular tissue, however this research indicates that these effects occur much faster than indicated by previous researchers. This is a significant finding because it indicates that meaningful earth based studies in this area can be carried out in a shorter time span. This could result in more studies per year as well as saving money by avoiding longer than necessary animal suspensions. This is especially important as we enter an era when, without Space Shuttle, flight opportunities will become scarce. These antiorthostatic suspension studies indicate that space flight, even short duration spaceflight, may have harmful effects on the seminiferous tubules and blood-testis barrier of astronauts.