Das maligne Melanom ist die aggressivste Form von Hautkrebs und verschiedene Familien von Rezeptortyrosinkinasen sind an der Entwicklung und der verstärkten Malignität beteiligt. Eph-Rezeptoren stellen die größte Klasse der Rezeptortyrosinkinasen dar und spielen eine wichtige Rolle bei der Tumorangiogenese und -progression. Die Genexpression und Proteinsynthese verschiedener Eph-Rezeptoren und Ephrin-Liganden ist bei vielen Tumorentitäten erhöht. Aus diesem Grund sollten sie sich als Zielproteine für die Entwicklung neuer Radiopharmaka eignen. Zudem zeigen Literaturbefunde einen Einfluss der hypoxischen Zellumgebung auf die Genexpression und die Proteinsynthese verschiedener Eph-Rezeptoren und Ephrin-Liganden. Das Ziel dieser Arbeit war es, Regulationsmechanismen bei verschiedenen Eph-Rezeptoren und Ephrin-Liganden aufzuklären, welche durch ein hypoxisches Umfeld hervorgerufen werden. Dazu wurde neben einem extrinsischen Hypoxiemodell an Monolayerzellkulturen auch ein intrinsisches Hypoxiemodell in Form von Tumorsphäroiden untersucht. Da die Genexpression und die Proteinsynthese von EphA2, EphB4, EphrinA1 und EphrinB2 laut Literatur vom Malignitätsgrad abhängig sind, wurden die metastatischen Melanomzelllinien A375, A2058 und MeWo und die prämetastatische Melanomzelllinie MEL-JUSO verwendet. Die Verifizierung der experimentellen Hypoxie erfolgte durch den etablierten Hypoxiemarker [18F]Fluormisonidazol, sowie dem Nachweis der VEGF-Genexpression unter den verwendeten Kulturbedingungen. Damit konnte die Eignung der hypoxischen Systeme gezeigt werden. Unabhängig vom Hypoxiemodell war in keiner der untersuchten Zelllinien ein Einfluss der Hypoxie auf die Genexpression und Proteinsynthese von EphA2, EphB4, EphrinA1 und EphrinB2 nachweisbar. Ein gesteigerter EphA2-Gehalt in Melanomzellen ist laut Literatur mit einer Erhöhung des Metastasierungspotentials verbunden. Um diesen Einfluss innerhalb einer Zelllinie zu untersuchen, wurden transgene A375-Zellen generiert. Mit dieser Zelllinie fanden Untersuchungen zu verschiedenen Metastasierungseigenschaften statt. Dabei wurde festgestellt, dass sich die Migration der Zellen durch den erhöhten EphA2-Gehalt verringerte, dabei war die hypoxische Umgebung ohne Einfluss. Weiterhin wurde festgestellt, dass der EphA2-Rezeptor das Adhäsionsverhalten von A375-Zellen nicht beeinflusst. Auch ein Einfluss auf das invasive Verhalten konnte nicht festgestellt werden. Eine hypoxische Umgebung war in beiden Fällen nicht von Bedeutung. Aus den Ergebnissen der vorliegenden Arbeit kann geschlussfolgert werden, dass bei den untersuchten Melanomzelllinien keine Regulation der Eph-Rezeptoren und Ephrin-Liganden durch ein hypoxisches Umfeld erfolgt. Durch die ausführliche Charakterisierung des EphA2-Rezeptors in der Arbeit kann jedoch geschlussfolgert werden, dass sich der Rezeptor als potentielles Zielmolekül für die Entwicklung neuer Radiotherapeutika und Radiodiagnostika eignet, nicht jedoch für die Detektion hypoxischer Bereiche in Tumoren. Durch die nunmehr etablierte Generierung von Sphäroiden und einer Zelllinie, welche den Rezeptor verstärkt exprimiert und synthetisiert, stehen nun Zellmodelle für die weiterführende Charakterisierung und Analyse neuer Radiodiagnostika und Radiotherapeutika auf der Basis von Inhibitoren und Antikörper gegen EphA2 zur Verfügung.

Das maligne Melanom ist die aggressivste Form von Hautkrebs und verschiedene Familien von Rezeptortyrosinkinasen sind an der Entwicklung und der verstärkten Malignität beteiligt. Eph-Rezeptoren stellen die größte Klasse der Rezeptortyrosinkinasen dar und spielen eine wichtige Rolle bei der Tumorangiogenese und -progression. Die Genexpression und Proteinsynthese verschiedener Eph-Rezeptoren und Ephrin-Liganden ist bei vielen Tumorentitäten erhöht. Aus diesem Grund sollten sie sich als Zielproteine für die Entwicklung neuer Radiopharmaka eignen. Zudem zeigen Literaturbefunde einen Einfluss der hypoxischen Zellumgebung auf die Genexpression und die Proteinsynthese verschiedener Eph-Rezeptoren und Ephrin-Liganden. Das Ziel dieser Arbeit war es, Regulationsmechanismen bei verschiedenen Eph-Rezeptoren und Ephrin-Liganden aufzuklären, welche durch ein hypoxisches Umfeld hervorgerufen werden. Dazu wurde neben einem extrinsischen Hypoxiemodell an Monolayerzellkulturen auch ein intrinsisches Hypoxiemodell in Form von Tumorsphäroiden untersucht. Da die Genexpression und die Proteinsynthese von EphA2, EphB4, EphrinA1 und EphrinB2 laut Literatur vom Malignitätsgrad abhängig sind, wurden die metastatischen Melanomzelllinien A375, A2058 und MeWo und die prämetastatische Melanomzelllinie MEL-JUSO verwendet. Die Verifizierung der experimentellen Hypoxie erfolgte durch den etablierten Hypoxiemarker [18F]Fluormisonidazol, sowie dem Nachweis der VEGF-Genexpression unter den verwendeten Kulturbedingungen. Damit konnte die Eignung der hypoxischen Systeme gezeigt werden. Unabhängig vom Hypoxiemodell war in keiner der untersuchten Zelllinien ein Einfluss der Hypoxie auf die Genexpression und Proteinsynthese von EphA2, EphB4, EphrinA1 und EphrinB2 nachweisbar. Ein gesteigerter EphA2-Gehalt in Melanomzellen ist laut Literatur mit einer Erhöhung des Metastasierungspotentials verbunden. Um diesen Einfluss innerhalb einer Zelllinie zu untersuchen, wurden transgene A375-Zellen generiert. Mit dieser Zelllinie fanden Untersuchungen zu verschiedenen Metastasierungseigenschaften statt. Dabei wurde festgestellt, dass sich die Migration der Zellen durch den erhöhten EphA2-Gehalt verringerte, dabei war die hypoxische Umgebung ohne Einfluss. Weiterhin wurde festgestellt, dass der EphA2-Rezeptor das Adhäsionsverhalten von A375-Zellen nicht beeinflusst. Auch ein Einfluss auf das invasive Verhalten konnte nicht festgestellt werden. Eine hypoxische Umgebung war in beiden Fällen nicht von Bedeutung. Aus den Ergebnissen der vorliegenden Arbeit kann geschlussfolgert werden, dass bei den untersuchten Melanomzelllinien keine Regulation der Eph-Rezeptoren und Ephrin-Liganden durch ein hypoxisches Umfeld erfolgt. Durch die ausführliche Charakterisierung des EphA2-Rezeptors in der Arbeit kann jedoch geschlussfolgert werden, dass sich der Rezeptor als potentielles Zielmolekül für die Entwicklung neuer Radiotherapeutika und Radiodiagnostika eignet, nicht jedoch für die Detektion hypoxischer Bereiche in Tumoren. Durch die nunmehr etablierte Generierung von Sphäroiden und einer Zelllinie, welche den Rezeptor verstärkt exprimiert und synthetisiert, stehen nun Zellmodelle für die weiterführende Charakterisierung und Analyse neuer Radiodiagnostika und Radiotherapeutika auf der Basis von Inhibitoren und Antikörper gegen EphA2 zur Verfügung.

We report the use of thin film poly(dimethylsiloxane) (PDMS) prints for the arrayed mass production of highly uniform 3-D human HT29 colon carcinoma spheroids. The spheroids have an organotypic density and, as determined by 3-axis imaging, were genuinely spherical. Critically, the array density impacts growth kinetics and can be tuned to produce spheroids ranging in diameter from 200 to 550 µm. The diffusive limit of competition for media occurred with a pitch of ≥1250 µm and was used for the optimal array-based culture of large, viable spheroids. During sustained culture mass transfer gradients surrounding and within the spheroids are established, and lead to growth cessation, altered expression patterns and the formation of a central secondary necrosis. These features reflect the microenvironment of avascularised tumours, making the array format well suited for the production of model tumours with defined sizes and thus defined spatio-temporal pathophysiological gradients. Experimental windows, before and after the onset of hypoxia, were identified and used with an enzyme activity-based viability assay to measure the chemosensitivity towards irinotecan. Compared to monolayer cultures, a marked reduction in the drug efficacy towards the different spheroid culture states was observed and attributed to cell cycle arrest, the 3-D character, scale and/or hypoxia factors. In summary, spheroid culture using the array format has great potential to support drug discovery and development, as well as tumour biology research. / Dieser Beitrag ist mit Zustimmung des Rechteinhabers aufgrund einer (DFG-geförderten) Allianz- bzw. Nationallizenz frei zugänglich.

We report the use of thin film poly(dimethylsiloxane) (PDMS) prints for the arrayed mass production of highly uniform 3-D human HT29 colon carcinoma spheroids. The spheroids have an organotypic density and, as determined by 3-axis imaging, were genuinely spherical. Critically, the array density impacts growth kinetics and can be tuned to produce spheroids ranging in diameter from 200 to 550 µm. The diffusive limit of competition for media occurred with a pitch of ≥1250 µm and was used for the optimal array-based culture of large, viable spheroids. During sustained culture mass transfer gradients surrounding and within the spheroids are established, and lead to growth cessation, altered expression patterns and the formation of a central secondary necrosis. These features reflect the microenvironment of avascularised tumours, making the array format well suited for the production of model tumours with defined sizes and thus defined spatio-temporal pathophysiological gradients. Experimental windows, before and after the onset of hypoxia, were identified and used with an enzyme activity-based viability assay to measure the chemosensitivity towards irinotecan. Compared to monolayer cultures, a marked reduction in the drug efficacy towards the different spheroid culture states was observed and attributed to cell cycle arrest, the 3-D character, scale and/or hypoxia factors. In summary, spheroid culture using the array format has great potential to support drug discovery and development, as well as tumour biology research. / Dieser Beitrag ist mit Zustimmung des Rechteinhabers aufgrund einer (DFG-geförderten) Allianz- bzw. Nationallizenz frei zugänglich.