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MOLECULAR AND FUNCTIONAL INVESTIGATION OF CANCER-TYPE AND LIVER-TYPE VARIANTS OF ORGANIC ANION TRANSPORTING POLYPEPTIDE 1B3Thakkar, Nilay 01 January 2015 (has links)
OATP1B3 belongs to the OATP (organic anion transporting polypeptides) superfamily, responsible for mediating the transport of various endogenous and xenobiotic substrates. OATP1B3 was initially reported to be expressed exclusively in the hepatocytes where it mediates the uptake of numerous endogenous substrates (e.g. bile acids, steroid hormone conjugates) and several clinically relevant drugs including anticancer drugs. Later, a number of studies reported that OATP1B3 is also frequently expressed in multiple types of cancers and may be associated with differing clinical outcomes. However, a detailed investigation on the expression, localization and functions of OATP1B3 expressed in cancer has been lacking. In this thesis work, we confirmed that colon and pancreatic cancer cells express a cancer-specific OATP1B3 variant (csOATP1B3), different from OATP1B3 wild-type (WT) expressed in the normal liver. The csOATP1B3 utilizes an alternative transcription initiation site and the translated product of csOATP1B3 lacks the first 28 amino acids at the N-terminus of OATP1B3 WT. Our results show that csOATP1B3 has modest uptake transporter functions and reduced plasma membrane localization compared to OATP1B3 WT. In our efforts to investigate the regulatory mechanism underlying the expression of csOATP1B3, we found that hypoxia inducible factor-1α (HIF-1α) may play a key role in the regulation of csOATP1B3 in colon and pancreatic cancer cells. In a separate study, we tested whether the N-terminal sequence of OATP1B3 WT plays an important role in the membrane trafficking. This is based on the observation that csOATP1B3 lacking the first 28 amino acids at N-terminus of OATP1B3 WT displays a predominantly cytoplasmic localization pattern. Using the constructs with N-terminal truncations and point mutations, we verified that the N-terminus of OATP1B3 WT contains important motifs in its membrane trafficking. In particular, the amino acids within a putative β-turn-forming tetrapeptide appear to be important in regulating the membrane trafficking of OATP1B3 WT. The findings from this thesis work provide important insights into the functional and clinical significance of OATP1B3 in cancer and normal liver.
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Vergleichende immunhistochemische Untersuchungen zum LH/hCG-Rezeptor (LHCGR) im Urothel und Detrusor der Harnblase mit Veränderungen bei Bladder Pain Syndrome/Interstitial Cystitis (BPS/IC)Schulze, Claudia 16 July 2014 (has links) (PDF)
BPS/IC (Bladder Pain Syndrome/Interstitial Cystitis) ist ein sehr schweres und noch weitgehend unverstandenes Krankheitsbild in der Urologie. Viele Frauen sind im Alltag durch den ständigen Harndrang und die Schmerzen stark eingeschränkt und von Depressionen betroffen. Die Aufklärung der Pathogenese ist deshalb sehr wichtig, um eine adäquate Therapie für die Betroffenen zu entwickeln und die Krankheit möglichst frühzeitig diagnostizieren zu können. Das Schwangerschaftshormon hCG (humanes Choriongonadotropin) besitzt differenzierende und wachstumsfördernde Eigenschaften und eine Rolle in der Urothelregeneration und – stabilisierung scheint möglich. Daher ist das Ziel dieser Arbeit seinen Rezeptor, den LHCGR (Luteinizing-Hormone/Choriogonadotropin Rezeptor), in der Harnblase nachzuweisen und die urothelialen und muskulären Charakteristika zwischen gesunden und an BPS/IC erkrankten Harnblasen zu vergleichen. Die Darstellung des LHCGR erfolgte auf Proteinebene mittels indirekter Immunfluoreszenz und auf mRNA-Ebene durch Standard-PCR. Es zeigten sich im Urothel von Harnblase und Ureter 5 unterschiedliche Verteilungsmuster des Rezeptors hinsichtlich seiner Expression in verschiedenen Zellschichten und seiner subzellulären Lokalisation. Je nach Urothelzustand und zwischen den Entitäten Kontroll- bzw. BPS/IC-Harnblase variierten diese Muster in ihrer Häufigkeit. In anderen Epithelien, wie dem Vaginalepithel, änderte sich die zelluläre Verteilung des LHCGR in Abhängigkeit vom Differenzierungsgrad der Zellen. Es scheint möglich, dass auch die Rezeptorexpression in Urothelzellen deren verschiedene Differenzierungszustände widerspiegelt. Dies unterstützt den für hCG vermuteten Einfluss auf die Epithelregeneration. Ein Vergleich der urothelialen Fluoreszenzintensitäten zwischen weiblichen Kontroll – und BPS/IC-Harnblasen zeigte eine signifikant stärkere Expression des Rezeptors bei erkrankten Patienten. Dem gegenüber war kein Unterschied im Detrusor, weder zwischen Kontroll – und BPS/IC-Harnblasen noch im geschlechtsspezifischen Vergleich, festzustellen. Damit scheint der Rezeptor seine Hauptaufgabe vorrangig im Urothel zu entfalten. Die Korrelationsanalysen ergaben keinen signifikanten Zusammenhang zwischen dem Erkrankungsalter (Zeitpunkt der Diagnosestellung und Biopsieentnahme) und der LHCGR-Immunfluoreszenz. Ein endokrinologischer Einfluss auf die Rezeptorexpression wurde dadurch unwahrscheinlich und unterstützt die immer akzeptiertere Auffassung, dass BPS/IC nicht mehr mit der Menopause assoziiert ist. Neben dem Urothel und Detrusor zeigten auch Lamina propria und Gefäße von Harnblase und Ureter die Expression des LHCGR in der Immunhistochemie. Unterschiedliche Clustermuster des Rezeptors im Detrusor ließen auf die Oligomerisierung des Rezeptors schließen. Die Bedeutung dieser Zusammenschlüsse ist jedoch noch unklar, wobei unterschiedliche funktionelle Zustände des Rezeptors vermutet werden. Orientierung bieten andere Rezeptoren, die durch Dimerisierung verschiedener Rezeptorvarianten ihre Funktionalität verbessern oder verschlechtern konnten. Obwohl für keine bisher entdeckte Variante des LHCGR eine definitive Aufgabe ermittelt werden konnte, scheinen doch viele Varianten auch unterschiedliche Funktionen wahrnehmen zu können. Besonders auf der Regulierbarkeit des Rezeptors mittels interagierender Splicevarianten sollte das Augenmerk zukünftiger Studien liegen. Ob durch Komplexbildung verschiedener Varianten oder Bildung nichtfunktioneller trunkierter Rezeptoren, die Kontrollmöglichkeiten sind vielfältig und können auch auf Liganden wirken. Letztlich ließ der Nachweis des LHCGR in allen Schichten von Harnblase und Ureter eher eine globale Rolle des Rezeptors im Harntrakt des Menschen vermuten. Dazu passten auch die bereits nachgewiesenen Einflüsse seiner Liganden auf die Blasenfunktion von Hunden. Die hier vorgelegte Arbeit untersuchte zum ersten Mal die Expression des LHCGR mittels PCR und Immunhistochemie in humanen Harnblasen und Ureteren. Dabei löste sie sich von den sonst üblichen Vorstellungen einer Beziehung des Rezeptors zu Blasentumoren, Schwangerschaft oder Inkontinenz. Diagnose und Therapie von BPS/IC sind zur Zeit noch ständigen Wandlungen unterworfen und dabei entgehen viele Patienten der (frühen) Diagnosestellung und einer adäquaten Behandlung. Diese Studie sollte dazu beitragen neue Einblicke in die Pathophysiologie der Erkrankung zu erlangen, um eine kausale Therapie entwickeln zu können. Zukünftig könnten diese Ergebnisse dabei helfen die Anwendung einer sensitiven und vor allem spezifischen Diagnostik auf molekularer Ebene (mRNA - oder Proteinnachweis) zu ermöglichen.
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Vergleichende immunhistochemische Untersuchungen zum LH/hCG-Rezeptor (LHCGR) im Urothel und Detrusor der Harnblase mit Veränderungen bei Bladder Pain Syndrome/Interstitial Cystitis (BPS/IC)Schulze, Claudia 01 October 2013 (has links)
BPS/IC (Bladder Pain Syndrome/Interstitial Cystitis) ist ein sehr schweres und noch weitgehend unverstandenes Krankheitsbild in der Urologie. Viele Frauen sind im Alltag durch den ständigen Harndrang und die Schmerzen stark eingeschränkt und von Depressionen betroffen. Die Aufklärung der Pathogenese ist deshalb sehr wichtig, um eine adäquate Therapie für die Betroffenen zu entwickeln und die Krankheit möglichst frühzeitig diagnostizieren zu können. Das Schwangerschaftshormon hCG (humanes Choriongonadotropin) besitzt differenzierende und wachstumsfördernde Eigenschaften und eine Rolle in der Urothelregeneration und – stabilisierung scheint möglich. Daher ist das Ziel dieser Arbeit seinen Rezeptor, den LHCGR (Luteinizing-Hormone/Choriogonadotropin Rezeptor), in der Harnblase nachzuweisen und die urothelialen und muskulären Charakteristika zwischen gesunden und an BPS/IC erkrankten Harnblasen zu vergleichen. Die Darstellung des LHCGR erfolgte auf Proteinebene mittels indirekter Immunfluoreszenz und auf mRNA-Ebene durch Standard-PCR. Es zeigten sich im Urothel von Harnblase und Ureter 5 unterschiedliche Verteilungsmuster des Rezeptors hinsichtlich seiner Expression in verschiedenen Zellschichten und seiner subzellulären Lokalisation. Je nach Urothelzustand und zwischen den Entitäten Kontroll- bzw. BPS/IC-Harnblase variierten diese Muster in ihrer Häufigkeit. In anderen Epithelien, wie dem Vaginalepithel, änderte sich die zelluläre Verteilung des LHCGR in Abhängigkeit vom Differenzierungsgrad der Zellen. Es scheint möglich, dass auch die Rezeptorexpression in Urothelzellen deren verschiedene Differenzierungszustände widerspiegelt. Dies unterstützt den für hCG vermuteten Einfluss auf die Epithelregeneration. Ein Vergleich der urothelialen Fluoreszenzintensitäten zwischen weiblichen Kontroll – und BPS/IC-Harnblasen zeigte eine signifikant stärkere Expression des Rezeptors bei erkrankten Patienten. Dem gegenüber war kein Unterschied im Detrusor, weder zwischen Kontroll – und BPS/IC-Harnblasen noch im geschlechtsspezifischen Vergleich, festzustellen. Damit scheint der Rezeptor seine Hauptaufgabe vorrangig im Urothel zu entfalten. Die Korrelationsanalysen ergaben keinen signifikanten Zusammenhang zwischen dem Erkrankungsalter (Zeitpunkt der Diagnosestellung und Biopsieentnahme) und der LHCGR-Immunfluoreszenz. Ein endokrinologischer Einfluss auf die Rezeptorexpression wurde dadurch unwahrscheinlich und unterstützt die immer akzeptiertere Auffassung, dass BPS/IC nicht mehr mit der Menopause assoziiert ist. Neben dem Urothel und Detrusor zeigten auch Lamina propria und Gefäße von Harnblase und Ureter die Expression des LHCGR in der Immunhistochemie. Unterschiedliche Clustermuster des Rezeptors im Detrusor ließen auf die Oligomerisierung des Rezeptors schließen. Die Bedeutung dieser Zusammenschlüsse ist jedoch noch unklar, wobei unterschiedliche funktionelle Zustände des Rezeptors vermutet werden. Orientierung bieten andere Rezeptoren, die durch Dimerisierung verschiedener Rezeptorvarianten ihre Funktionalität verbessern oder verschlechtern konnten. Obwohl für keine bisher entdeckte Variante des LHCGR eine definitive Aufgabe ermittelt werden konnte, scheinen doch viele Varianten auch unterschiedliche Funktionen wahrnehmen zu können. Besonders auf der Regulierbarkeit des Rezeptors mittels interagierender Splicevarianten sollte das Augenmerk zukünftiger Studien liegen. Ob durch Komplexbildung verschiedener Varianten oder Bildung nichtfunktioneller trunkierter Rezeptoren, die Kontrollmöglichkeiten sind vielfältig und können auch auf Liganden wirken. Letztlich ließ der Nachweis des LHCGR in allen Schichten von Harnblase und Ureter eher eine globale Rolle des Rezeptors im Harntrakt des Menschen vermuten. Dazu passten auch die bereits nachgewiesenen Einflüsse seiner Liganden auf die Blasenfunktion von Hunden. Die hier vorgelegte Arbeit untersuchte zum ersten Mal die Expression des LHCGR mittels PCR und Immunhistochemie in humanen Harnblasen und Ureteren. Dabei löste sie sich von den sonst üblichen Vorstellungen einer Beziehung des Rezeptors zu Blasentumoren, Schwangerschaft oder Inkontinenz. Diagnose und Therapie von BPS/IC sind zur Zeit noch ständigen Wandlungen unterworfen und dabei entgehen viele Patienten der (frühen) Diagnosestellung und einer adäquaten Behandlung. Diese Studie sollte dazu beitragen neue Einblicke in die Pathophysiologie der Erkrankung zu erlangen, um eine kausale Therapie entwickeln zu können. Zukünftig könnten diese Ergebnisse dabei helfen die Anwendung einer sensitiven und vor allem spezifischen Diagnostik auf molekularer Ebene (mRNA - oder Proteinnachweis) zu ermöglichen.
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