MicroRNAs são pequenos RNAs que desempenham papel importante como reguladores da expressão gênica em processos de iniciação e progressão do câncer. Achados recentes demonstram que microRNAs estão presentes em biofluidos, podendo ser encontrados na corrente sanguínea Especula-se que alterações nos níveis de expressão dos microRNAs em tecidos tumorais podem ser identificadas em plasma. Apesar de desafios relacionados a variáveis analíticas e pré-analíticas desta abordagem, há um grande interesse clínico em identificar microRNAs circulantes como biomarcadores em câncer dada a simplicidade e baixo risco de um exame como este. O carcinoma de cabeça e pescoço está entre as principais neoplasias no mundo. Ele está associado ao uso crônico de tabaco e álcool e a taxa de sobrevida média fica em torno de 50% em 5 anos. O objetivo deste trabalho foi estabelecer parâmetros adequados para processamento e detecção de microRNAs circulantes, assim como identificar microRNAs circulantes que pudessem caracterizar indivíduos portadores de carcinoma de cavidade oral e de orofaringe e, em particular, distinguir aqueles que apresentavam metástase linfonodal ao diagnóstico daqueles livres de comprometimento linfonodal. A expressão de 179 microRNAs foi analisada por PCR em tempo real no plasma de 45 indivíduos portadores de carcinoma epidermóide (28 com metástase linfonodal ao diagnóstico e 17 sem metástases linfonodais) e 15 indivíduos sadios. As amostras foram pareadas quanto a sexo, idade e quanto ao uso de tabaco. Identificamos microRNAs preferencialmente expressos em amostras de plasma de portadores do tumor, dentre os quais microRNAs já descritos como relevantes em carcinoma epidermóide oral, como miR-210, e miRNAs ainda pouco estudados, como miR-543. Diferenças importantes foram observadas quando tumores de cavidade oral foram analisados separadamente dos tumores de orofaringe, de acordo com diferenças moleculares existentes entre estes sub-sítios tumorais. MicroRNAs possivelmente envolvidos com o processo metastático foram identificados quando amostras de plasma de pacientes que apresentavam metástases em linfonodos foram comparadas com amostras de pacientes sem comprometimento linfonodal. Dentre estes miRNAs destacam-se miR-192 e miR-574, mais expressos em plasma de indivíduos portadores de tumores metastáticos de orofaringe e esses dados estão de acordo com ,a literatura onde formam identificados com perfil semelhante em amostras de plasma associadas a outros tipos de tumor. Concluímos que os miRNAs circulantes presentes em plasma podem refletir características moleculares do tumor, e que a desregulação da sua expressão em contextos específicos, como subsítios tumorais e condições clínicas distintas, como a presença ou ausência de metástase, poderiam auxiliar no diagnóstico e na avaliação do prognóstico de portadores de carcinoma epidermoide de cabeça e pescoço. / MicroRNAs are small non-coding RNA molecules with roles in gene regulation and implications in cancer initiation and progression. Cell-free microRNAs detected in body fluids are of clinical interest due to their possible application as biomarkers. The stability of microRNAs in plasma has been demonstrated and it seems that alterations in cancer tissue may be detected in plasma from patients. Despite the fact that their reliable quantification depends on several technical parameters there is great clinical interest in this approach due to its simplicity and low risk to the patient. Oral squamous cell carcinoma is one of the most common cancer types worldwide. Tobacco and alcohol consumption are the most important risk factors and survival rates are about 50% in 5 years. The aim of this study was to establish reliable parameters for the detection of microRNAs in plasma and to identify plasma microRNAs associated with squamous cell carcinomas of the oral cavity and oropharynx as well as with the presence of cervical lymph node metastases. With this purpose we evaluated the expression of 179 microRNAs in plasma from 45 patients (28 presenting cervical lymph node metastases at diagnosis and 17 with no lymph node metastasis) and 15 healthy controls. Samples were matched according to age, sex, drinking and smoking habits. We identified microRNAs mostly expressed in tumor samples, some of which already described in oral squamous cell carcinoma, such as miR-210, and microRNAs poorly studied, such as miR-573. Comparisons between oral and oropharynx carcinomas yielded several differences, in accordance with molecular differences known between these cancer types. MicroRNAs possibly involved in the metastatic process were identified between plasma samples from individuals presenting lymph node metastasis at diagnosis and plasma from patients who were metastasis-free. Among these molecules, miR-192 and miR-574 were identified as more expressed in plasma from individuals with metastatic oropharynx squamous cell carcinoma. We conclude that plasma microRNAs may indicate molecular characteristics of the tumor and that its differential detection in association with specific clinical conditions or sub-sites may be considered as a potential tool to help in the diagnosis and prognosis assessment of head and neck squamous cell carcinoma.

O câncer bucal é uma doença que afeta principalmente homens acima de 40 anos com hábito de fumar e beber. Em geral, esses pacientes têm o diagnóstico da enfermidade realizado tardiamente, acarretando tratamentos complexos, mutilantes e de alto custo tanto financeiro como social e de prognóstico sombrio a ponto do câncer bucal apresentar uma taxa de sobrevida em 5 anos inferior a 50%. O diagnóstico precoce representa uma alternativa importante para alterar esse panorama. Os recursos de que os profissionais da área da saúde, principalmente os cirurgiões-dentistas, dispõem são o diagnóstico clínico de lesões estabelecidas acompanhado da biópsia com exame histopatológico.Outra alternativa para o diagnóstico precoce dos carcinomas espinocelulares ocorre quando estes são precedidos de lesões cancerizáveis. Nas duas últimas décadas, a utilização da citopatologia como método de diagnóstico de danos celulares prévios ao aparecimento de lesões clínicas possibilitou sua utilização em mucosa bucal. Os estudos apresentados tratam especificamente desta aplicação clínica, abordando: a) os aspectos genéticos do câncer bucal; b) a correlação histocitopatológica de lesões cancerizáveis em câncer bucal e na mucosa normal exposta aos carcinógenos; c) a validação das amostras citopatológicas; d) a padronização da técnica de extração de DNA em células esfoliadas da mucosa bucal. / Oral cancer affects mainly men over 40 years who are exposed to tobacco and alcohol. These patients usually receive a late diagnosis, which results in complex, mutilating treatments with high financial and social costs, poor prognosis, and, therefore, a 5-year survival rate lower than 50%. Early diagnosis is critical to change this situation. The resources currently available to healthcare professionals, particularly dentists, are the clinical diagnosis of lesions and biopsies for histopathologic examination. Another alternative for the early diagnosis of squamous cell carcinomas is the identification of precursor lesions. In the last two decades, cytopathology has been used as a method to diagnose cell damage that precedes the appearance of clinical lesions, and this use can be extended to the oral mucosa. The studies reported here deal specifically with this clinical application, and discuss: A) the genetic factors in oral cancer; B) the cytohistologic correlation of cancer precursor lesions and the normal mucosa exposed to carcinogens; C) the validation of cytopathologic samples; D) the standardization of the technique to extract DNA of cells exfoliated from the oral mucosa.

MicroRNAs são pequenos RNAs que desempenham papel importante como reguladores da expressão gênica em processos de iniciação e progressão do câncer. Achados recentes demonstram que microRNAs estão presentes em biofluidos, podendo ser encontrados na corrente sanguínea Especula-se que alterações nos níveis de expressão dos microRNAs em tecidos tumorais podem ser identificadas em plasma. Apesar de desafios relacionados a variáveis analíticas e pré-analíticas desta abordagem, há um grande interesse clínico em identificar microRNAs circulantes como biomarcadores em câncer dada a simplicidade e baixo risco de um exame como este. O carcinoma de cabeça e pescoço está entre as principais neoplasias no mundo. Ele está associado ao uso crônico de tabaco e álcool e a taxa de sobrevida média fica em torno de 50% em 5 anos. O objetivo deste trabalho foi estabelecer parâmetros adequados para processamento e detecção de microRNAs circulantes, assim como identificar microRNAs circulantes que pudessem caracterizar indivíduos portadores de carcinoma de cavidade oral e de orofaringe e, em particular, distinguir aqueles que apresentavam metástase linfonodal ao diagnóstico daqueles livres de comprometimento linfonodal. A expressão de 179 microRNAs foi analisada por PCR em tempo real no plasma de 45 indivíduos portadores de carcinoma epidermóide (28 com metástase linfonodal ao diagnóstico e 17 sem metástases linfonodais) e 15 indivíduos sadios. As amostras foram pareadas quanto a sexo, idade e quanto ao uso de tabaco. Identificamos microRNAs preferencialmente expressos em amostras de plasma de portadores do tumor, dentre os quais microRNAs já descritos como relevantes em carcinoma epidermóide oral, como miR-210, e miRNAs ainda pouco estudados, como miR-543. Diferenças importantes foram observadas quando tumores de cavidade oral foram analisados separadamente dos tumores de orofaringe, de acordo com diferenças moleculares existentes entre estes sub-sítios tumorais. MicroRNAs possivelmente envolvidos com o processo metastático foram identificados quando amostras de plasma de pacientes que apresentavam metástases em linfonodos foram comparadas com amostras de pacientes sem comprometimento linfonodal. Dentre estes miRNAs destacam-se miR-192 e miR-574, mais expressos em plasma de indivíduos portadores de tumores metastáticos de orofaringe e esses dados estão de acordo com ,a literatura onde formam identificados com perfil semelhante em amostras de plasma associadas a outros tipos de tumor. Concluímos que os miRNAs circulantes presentes em plasma podem refletir características moleculares do tumor, e que a desregulação da sua expressão em contextos específicos, como subsítios tumorais e condições clínicas distintas, como a presença ou ausência de metástase, poderiam auxiliar no diagnóstico e na avaliação do prognóstico de portadores de carcinoma epidermoide de cabeça e pescoço. / MicroRNAs are small non-coding RNA molecules with roles in gene regulation and implications in cancer initiation and progression. Cell-free microRNAs detected in body fluids are of clinical interest due to their possible application as biomarkers. The stability of microRNAs in plasma has been demonstrated and it seems that alterations in cancer tissue may be detected in plasma from patients. Despite the fact that their reliable quantification depends on several technical parameters there is great clinical interest in this approach due to its simplicity and low risk to the patient. Oral squamous cell carcinoma is one of the most common cancer types worldwide. Tobacco and alcohol consumption are the most important risk factors and survival rates are about 50% in 5 years. The aim of this study was to establish reliable parameters for the detection of microRNAs in plasma and to identify plasma microRNAs associated with squamous cell carcinomas of the oral cavity and oropharynx as well as with the presence of cervical lymph node metastases. With this purpose we evaluated the expression of 179 microRNAs in plasma from 45 patients (28 presenting cervical lymph node metastases at diagnosis and 17 with no lymph node metastasis) and 15 healthy controls. Samples were matched according to age, sex, drinking and smoking habits. We identified microRNAs mostly expressed in tumor samples, some of which already described in oral squamous cell carcinoma, such as miR-210, and microRNAs poorly studied, such as miR-573. Comparisons between oral and oropharynx carcinomas yielded several differences, in accordance with molecular differences known between these cancer types. MicroRNAs possibly involved in the metastatic process were identified between plasma samples from individuals presenting lymph node metastasis at diagnosis and plasma from patients who were metastasis-free. Among these molecules, miR-192 and miR-574 were identified as more expressed in plasma from individuals with metastatic oropharynx squamous cell carcinoma. We conclude that plasma microRNAs may indicate molecular characteristics of the tumor and that its differential detection in association with specific clinical conditions or sub-sites may be considered as a potential tool to help in the diagnosis and prognosis assessment of head and neck squamous cell carcinoma.

Diss. (sammanfattning) Umeå : Univ., 2008. / Härtill 4 uppsatser.

O câncer bucal é uma doença que afeta principalmente homens acima de 40 anos com hábito de fumar e beber. Em geral, esses pacientes têm o diagnóstico da enfermidade realizado tardiamente, acarretando tratamentos complexos, mutilantes e de alto custo tanto financeiro como social e de prognóstico sombrio a ponto do câncer bucal apresentar uma taxa de sobrevida em 5 anos inferior a 50%. O diagnóstico precoce representa uma alternativa importante para alterar esse panorama. Os recursos de que os profissionais da área da saúde, principalmente os cirurgiões-dentistas, dispõem são o diagnóstico clínico de lesões estabelecidas acompanhado da biópsia com exame histopatológico.Outra alternativa para o diagnóstico precoce dos carcinomas espinocelulares ocorre quando estes são precedidos de lesões cancerizáveis. Nas duas últimas décadas, a utilização da citopatologia como método de diagnóstico de danos celulares prévios ao aparecimento de lesões clínicas possibilitou sua utilização em mucosa bucal. Os estudos apresentados tratam especificamente desta aplicação clínica, abordando: a) os aspectos genéticos do câncer bucal; b) a correlação histocitopatológica de lesões cancerizáveis em câncer bucal e na mucosa normal exposta aos carcinógenos; c) a validação das amostras citopatológicas; d) a padronização da técnica de extração de DNA em células esfoliadas da mucosa bucal. / Oral cancer affects mainly men over 40 years who are exposed to tobacco and alcohol. These patients usually receive a late diagnosis, which results in complex, mutilating treatments with high financial and social costs, poor prognosis, and, therefore, a 5-year survival rate lower than 50%. Early diagnosis is critical to change this situation. The resources currently available to healthcare professionals, particularly dentists, are the clinical diagnosis of lesions and biopsies for histopathologic examination. Another alternative for the early diagnosis of squamous cell carcinomas is the identification of precursor lesions. In the last two decades, cytopathology has been used as a method to diagnose cell damage that precedes the appearance of clinical lesions, and this use can be extended to the oral mucosa. The studies reported here deal specifically with this clinical application, and discuss: A) the genetic factors in oral cancer; B) the cytohistologic correlation of cancer precursor lesions and the normal mucosa exposed to carcinogens; C) the validation of cytopathologic samples; D) the standardization of the technique to extract DNA of cells exfoliated from the oral mucosa.

O câncer bucal é uma doença que afeta principalmente homens acima de 40 anos com hábito de fumar e beber. Em geral, esses pacientes têm o diagnóstico da enfermidade realizado tardiamente, acarretando tratamentos complexos, mutilantes e de alto custo tanto financeiro como social e de prognóstico sombrio a ponto do câncer bucal apresentar uma taxa de sobrevida em 5 anos inferior a 50%. O diagnóstico precoce representa uma alternativa importante para alterar esse panorama. Os recursos de que os profissionais da área da saúde, principalmente os cirurgiões-dentistas, dispõem são o diagnóstico clínico de lesões estabelecidas acompanhado da biópsia com exame histopatológico.Outra alternativa para o diagnóstico precoce dos carcinomas espinocelulares ocorre quando estes são precedidos de lesões cancerizáveis. Nas duas últimas décadas, a utilização da citopatologia como método de diagnóstico de danos celulares prévios ao aparecimento de lesões clínicas possibilitou sua utilização em mucosa bucal. Os estudos apresentados tratam especificamente desta aplicação clínica, abordando: a) os aspectos genéticos do câncer bucal; b) a correlação histocitopatológica de lesões cancerizáveis em câncer bucal e na mucosa normal exposta aos carcinógenos; c) a validação das amostras citopatológicas; d) a padronização da técnica de extração de DNA em células esfoliadas da mucosa bucal. / Oral cancer affects mainly men over 40 years who are exposed to tobacco and alcohol. These patients usually receive a late diagnosis, which results in complex, mutilating treatments with high financial and social costs, poor prognosis, and, therefore, a 5-year survival rate lower than 50%. Early diagnosis is critical to change this situation. The resources currently available to healthcare professionals, particularly dentists, are the clinical diagnosis of lesions and biopsies for histopathologic examination. Another alternative for the early diagnosis of squamous cell carcinomas is the identification of precursor lesions. In the last two decades, cytopathology has been used as a method to diagnose cell damage that precedes the appearance of clinical lesions, and this use can be extended to the oral mucosa. The studies reported here deal specifically with this clinical application, and discuss: A) the genetic factors in oral cancer; B) the cytohistologic correlation of cancer precursor lesions and the normal mucosa exposed to carcinogens; C) the validation of cytopathologic samples; D) the standardization of the technique to extract DNA of cells exfoliated from the oral mucosa.

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Les carcinomes épidermoïdes des voies aéro-digestives supérieures (VADS) se situent au sixième rang des cancers les plus fréquents dans le monde. Ces tumeurs sont liés à deux facteurs de risque : l’intoxication éthylo-tabagique (80% des cas) et l’infection de l’épithélium des VADS par les papillomavirus humain (HPV) à haut risque oncogène (20% des cas). Ces derniers définissent une sous-population de patients de meilleur pronostic. Une des hypothèses actuellement étudiées, afin d’expliquer la survie améliorée des patients HPV positifs, serait une hypoxie moindre dans ces tumeurs. En effet, les tumeurs des VADS sont fréquemment hypoxiques, et l’hypoxie intratumorale est un facteur de mauvais pronostic. Dans une première partie de cette thèse, nous avons entrepris une caractérisation moléculaire de l’hypoxie intratumorale dans les tumeurs humaines oropharyngées en fonction du statut HPV. Il apparaît que les tumeurs HPV positives présentent un statut hypoxique moindre comparées aux tumeurs HPV négatives. Ces tumeurs se caractérisent également par une abondante vascularisation intratumorale, qui pourrait être à l’origine de ce statut hypoxique moindre. Dans une deuxième partie, nous avons étudié l’adaptation à l’hypoxie de la lignée cellulaire HPV négative SQ20B et la lignée cellulaire HPV positive SCC90. De plus, des modèles de xénogreffes ont été établis à partir de ces mêmes lignées cellulaires et ont été analysés du point de vue de l’hypoxie intratumorale. De façon comparable aux tumeurs HPV positives, les xénogreffes obtenus à partir de la lignée SCC90 montre un statut hypoxique réduit comparés aux xénogreffes SQ20B. Les deux lignées cellulaires s’adaptent également différemment en hypoxie in vitro. La réponse à l’hypoxie dans la lignée SCC90 semble plus dynamique. En effet, la lignée SCC90 tente de s’adapter et de répondre à cet environnement hypoxique en induisant de fort niveau d’expression de gènes comparée à la lignée SQ20B. / Head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) represents the sixth most common malignancy worldwide. The major risk factors for HNSCC identified are tobacco use and alcohol consumption (80% of all HNSCC), which seem to have a synergistic effect. A subgroup of HNSCCs (20% of cases), particularly those of the oropharynx, is caused by infection with high-risk types of human papillomavirus (HPV). Human papillomavirus HPV-related oropharyngeal squamous cell carcinoma defines a distinct clinical subgroup of head and neck cancer patients with improved prognosis. Currently, one of the several hypothesis studied to account for their improved survival outcomes could be a distinct hypoxia status compared to their HPV-negative counterpart. Indeed, tumour hypoxia is common in solid tumours including head and neck tumours, and hypoxia is a well-known poor prognosis factor. In first part of this thesis, we have performed a molecular characterisation of tumor hypoxia on cohort of oropharyngeal tumours according to HPV status of the patients. The results support the hypothesis that HPV-related tumours display a lesser hypoxia status compared to HPV-negative oropharyngeal tumours. These HPV-related tumours also characterize by an abundant tumour vascularisation, which could be responsible for a lesser hypoxia status. In a second part, we have studied the ability of the adaptation to hypoxia of the HPV-positive SCC90 cell line and HPV-negative SQ20B cell line. Furthermore, HPV-positive and HPV-negative HNSCC xenograft models have been established and have been analysed about tumor hypoxia. Similar to HPV-related HNSCC, tumours-derived HPV positive cell lines display a reduced hypoxic status compared to tumours-derived HPV negative cell lines. The two cell lines adapt also differently to in vitro hypoxia. In the HPV-positive cell line, the hypoxia response pathways could be more dynamics. Indeed, SCC90 cell lines attempt to adapt and to reply to hypoxic environment inducing highly expression of all of the hypoxia related genes compared to SQ20B cell lines.

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published_or_final_version / Pathology / Doctoral / Doctor of Philosophy