Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2013-04-18T18:08:55Z No. of bitstreams: 1 Ana Paula Almeida de Souza Validação de proteinas...pdf: 2348379 bytes, checksum: 16135e91d8da506bd6d51b00312ae853 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-04-18T18:08:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ana Paula Almeida de Souza Validação de proteinas...pdf: 2348379 bytes, checksum: 16135e91d8da506bd6d51b00312ae853 (MD5) Previous issue date: 2013 / Universidade Federal da Bahia. Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz / O controle das populações de flebotomíneos, a contenção das epidemias nas fases iniciais e a facilitação do diagnóstico precoce dos indivíduos parasitados são estratégias traçadas pela OMS para a vigilância e controle da leishmaniose. Neste contexto, os testes sorológicos utilizando tanto o sonicado de glândula salivar (SGS) dos flebotomíneos quanto o antígeno solúvel de Leishmania (SLA) são importantes ferramentas para o controle/diagnóstico das Leishmanioses. No entanto, os testes realizados a partir da utilização de antígenos obtidos de frações brutas, apesar de apresentarem alta sensibilidade, alguns destes antígenos apresentam reação cruzada com epítopos compartilhados por outros patógenos/vetores. Além disso, o preparo dos antígenos não tem adequada reprodutibilidade devido a grande dificuldade de obtenção e/ou padronização destes. No presente trabalho, objetivamos identificar biomarcadores para a vigilância e o controle das Leishmanioses, utilizando proteínas recombinantes da saliva dos flebotomíneos como biomarcadores de exposição ao vetor e proteínas recombinantes da Leishmania para obtenção de um diagnóstico sorológico mais preciso para a Leishmaniose Tegumentar humana. Numa primeira etapa, foram realizados testes imunoenzimáticos contra as proteínas recombinante da saliva do vetor L. longipalpis (rLJM11 e rLJM17) para estimar a positividade anti-saliva num pequeno número de soros de crianças de uma área endêmica para Leishmaniose Visceral. Foi observado que os soros que reconhecem o SGS do L. longipalpis também reconhecem em diferentes proporções as proteínas rLJM17 e rLJM11. Ademais, as proteína recombinantes foram capazes de detectar a soroconversão anti-saliva de soros de uma segunda área endêmica para LV, havendo aumento no reconhecimento quando utilizadas as duas proteínas recombinantes de forma combinada. Além disso, a análise das curvas ROC evidenciou o desempenho superior da combinação das proteínas rLJM17 + rLJM11. Estes dados foram confirmados com a avaliação das proteínas frente um grande painel de 1.077 amostras de soro de indivíduos de uma outra área endêmica para LV. Nesta etapa, nossos resultados indicam que as proteínas rLJM11+rLJM17 representam uma ferramenta epidemiológica promissora que pode auxiliar na implementação de medidas de controle contra a Leishmaniose Visceral. Numa segunda etapa, testes imunoenzimáticos foram realizados contra uma série de proteínas recombinantes da Leishmania (HSP70, H2A, H2B, H3, H4 e KMP11) a fim de selecionarmos proteínas antigênicas contra soros de pacientes com Leishmaniose Cutânea (LC) e Leishmaniose Mucosa (LM) e que apresentassem elevada especificidade quando testadas contra soros de indivíduos com outras patologias (doença de Chagas, Lúpus Eritematoso Sistêmico, Hanseníase e Tuberculose). Para avaliar a eficácia das proteínas recombinantes foram utilizadas curvas ROC, possibilitando a seleção de antígenos possivelmente mais eficientes que o SLA no imunodiagnóstico da Leishmaniose. As proteínas recombinantes HSP70 e H2A foram selecionadas por apresentarem elevada sensibilidade, sendo reconhecida por anticorpos dos soros de pacientes com LM e LC respectivamente. Na última etapa dos experimentos, utilizando soros de indivíduos que apresentavam outras patologias, observou-se que a reação cruzada diminui frente aos antígenos recombinantes, especialmente para a rHSP70, quando comparamos à observada para o SLA. Nossos resultados mostram a elevada antigenicidade da rHSP70, sugerindo a possibilidade de utilização desta proteína recombinante para o sorodiagnóstico da Leishmaniose Tegumentar. Neste trabalho foi possível identificar e validar o uso de proteínas recombinantes do parasito e da saliva dos flebotomíneos como biomarcadores para o sorodiagnóstico e avaliação da exposição às leishmanioses. / The population control of sand flies, containment of epidemics in the early stages and facilitating early diagnosis of infected individuals are strategies outlined by WHO for surveillance and control of Leishmaniasis. In this context, serologic tests using both the salivary gland sonicate (SGS) of sandflies as soluble Leishmania antigen (SLA) are important tools for the control / diagnosis of Leishmaniasis. However, tests based on the use of antigens derived from crude fractions, despite showing high sensitivity, some of these antigens cross-react with epitopes shared by other pathogens / vectors. Moreover, the preparation of antigens has adequate reproducibility due to difficulty in obtaining and / or standardization of these. In this study, we aimed to identify biomarkers for the surveillance and control of Leishmaniasis, through use of recombinant proteins from the saliva of sandflies as biomarkers of exposure to vector and through the use of recombinant proteins of Leishmania to get a more accurate serodiagnosis for human leishmaniasis. On the first step, ELISAs were performed against the recombinant protein from the saliva of the vector L. longipalpis (rLJM11 and rLJM17) to estimate the positive anti-saliva on a small number of sera from children from an endemic area for VL. It was observed that the sera that recognize the SGS of L. longipalpis also recognize in different proportions of rLJM17 and rLJM11 proteins. Further, each recombinant protein was able to detect anti-saliva seroconversion in sera from a second endemic area for VL, with increase in recognizing when the two recombinant proteins were used in combination. Furthermore, the ROC analysis showed the superior performance of the combination of rLJM17 + rLJM11, these data confirmed using a large panel of 1077 serum samples from individuals from another endemic area for LV. At this stage, our results indicate that proteins rLJM11 + rLJM17 represent a promising epidemiological tool that can assist in the implementation of control measures against Visceral Leishmaniasis. In a second step, ELISAs were performed against a series of recombinant proteins of Leishmania (HSP70, H2A, H2B, H3, and H4 KMP11) so antigenic proteins were selected against serum from patients with cutaneous leishmaniasis (CL) and mucocutaneous leishmaniasis (MCL) and that presented high specificity when tested against sera from patients with other diseases (Chagas disease, Systemic Lupus Erythematosus, Leprosy and Tuberculosis). To identify the effectiveness of recombinant proteins, ROC curves were used to select antigens possibly more efficient than SLA. Recombinant proteins HSP70 and H2A were selected for having high sensitivity in recognizing sera from patients with LM and LC respectively. In the last experimental stage using sera from individuals with other pathologies, it was observed that the reduced cross-reactivity against the recombinant antigen, especially for rHSP70 when compared to that observed for the SLA. Our results show the high antigenicity of rHSP70, suggesting the possibility of using this recombinant protein for serodiagnosis of Leishmaniasis. In this work, it was possible to identify and validate the use of recombinant proteins of the parasite and of the saliva of sandflies as biomarkers for serodiagnosis and assessment of exposure to Leishmaniasis.