Seulement 30% des cas d'infertilité masculine peuvent être diagnostiqués grâce à un spermogramme. Comme l'épididyme joue un rôle important dans la maturation posttesticulaire spermatique, le dysfonctionnement de cet organe peut être à l'origine de cas d'infertilité non expliquée. Ainsi, puisque la communication intercellulaire au niveau du tractus reproducteur mâle est différente lorsqu’il y a un problème de fertilité, nous avons émis l’hypothèse qu’une signature moléculaire précise pourrait aider à mieux comprendre et diagnostiquer une plus large population. Pour ce faire, nous avons utilisé un modèle murin génétiquement modifié ayant une délétion conditionnelle (cKO) pour une enzyme impliquée dans la biogenèse des microARNs (miARNs) au niveau proximal de l’épididyme. Nous avons comparé le profil d’expression des miARNs et des gènes au sein de l’épididyme avec un modèle de souris témoin. Cent cinquante-quatre miARNs ont illustrés une forte diminution d’expression chez la souris génétiquement modifiée, dont miR-210, miR-672, miR-191 and miR-204. Notons également la variation d’expression des protéines AZGP1 (Zn-alpha 2-glycoprotein) et PATE4 (Prostate And Testis Expressed 4 protein) qui ont particulièrement attiré notre attention, car elles sont directement impliquées dans le pouvoir fécondant masculin. Deuxièmement, comme ces molécules se sont avérées être relarguées dans le milieu extracellulaire, nous avons décidé d’investiguer leur mode de sécrétion dans le liquide épididymaire afin d’évaluer leur potentiel en tant que biomarqueurs pour un certain type d’infertilité masculine. En nous référant aux critères de l’Organisation Mondial de la santé (OMS), j’ai créé une biobanque contenant 43 échantillons humains. J’ai pu mettre également en pratique une méthode plus actuelle d’isolement de vésicules membranaire à partir de fluide séminal. Finalement, j’ai validé l’association de 4 molécules (miR-672, miR- 191 and miR-204 et AZGP1) avec les exosomes. Tous ces résultats suggèrent donc qu’il existe un profil moléculaire associé au phénotype de fertilité et que ces nouvelles molécules extracellulaires pourraient aider à représenter des sous-types d’infertilité masculine. / Only 30% cases of male infertility can be diagnosed with a spermogram. As the epididymis plays an important role in spermatic post-testicular maturation, the dysfunction of this organ may be at the origin of unexplained infertility. Thus, since intercellular communication in the male reproductive tract is different when there is a fertility problem, we hypothesized that a precise molecular signature could help to better understand and diagnose a larger population. To do this, we used a genetically modified murine model with a conditional kockout (cKO) for an enzyme involved in the biogenesis of microRNAs (miRNAs) at the proximal level of the epididymis. We compared the epididymal miRNAs and genes expression pattern between a control and cKO mouse model. One hundred and fifty-four miRNAs showed a strong expression decrease in the genetically modified mice, including miR-210, miR-672, miR-191 and miR-204. Note also the variation in expression of the proteins AZGP1 (Zn-alpha 2-glycoprotein) and PATE4 (Prostate And Testis Expressed 4 protein) which have particularly attracted our attention, because they are directly involved in the male fertility. Secondly, since these molecules were found to be released into the extracellular environment, we decided to investigate their secretion pattern in the epididymal fluid in order to evaluate their potential as biomarkers for a certain type of male infertility. Referring to the criteria of the World Health Organization (WHO), I was able to create a biobank containing 43 human samples. I was also able to practice a more current method of isolating membrane vesicles from seminal fluid. Finally, I validated the association of 4 molecules (miR-672, miR-191 and miR-204 and AZGP1) with exosomes. All these results therefore suggest that there is a molecular profile associated with the fertility phenotype and that these new extracellular molecules might help to represent subtypes of male infertility.

Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) sont impliqués dans la majeure partie des communications intercellulaires. Un grand nombre de RCPG ont été découverts en comparant la séquence des récepteurs connus avec les données fournies par le séquençage du génome humain. Pour plus d'une centaine de ces récepteurs, le ligand activateur ou agoniste est inconnu. Ces récepteurs sont dès lors qualifiés d'orphelins.<p>Les LGR forment une sous-famille de RCPG structurellement proches de la rhodopsine qui comprend les récepteurs aux hormones glycoprotéiques (TSH, LH, hCG, FSH) et à la relaxine. LGR4 est un membre de cette famille dont ni la fonction précise, ni l'agoniste ne sont connus.<p>Dans un premier temps, une cartographie détaillée de l'expression de Lgr4 chez la souris a été obtenue. Nous avons tiré parti de l'existence d'une lignée de souris transgéniques dont le gène Lgr4 a été interrompu par l'introduction d'une cassette comportant deux marqueurs histologiques. L'activité beta-galactosidase d'un de ces marqueurs a été analysée chez les souris hétérozygotes. Ces dernières ne présentent pas de phénotype particulier, ce qui permet d'estimer que l'expression des marqueurs rend effectivement compte de l'expression normale du gène Lgr4. Lgr4 est exprimé dans un grand nombre de structures, notamment dans le cartilage, le rein, les appareils reproducteurs mâle et femelle et certaines cellules du système nerveux.<p>Ensuite, le phénotype des souris homozygotes pour l'inactivation de Lgr4 (LGR4KO) a été exploré. Ces souris présentent à la naissance un poids inférieur à leurs congénères des autres phénotypes. Les mâles sont stériles à cause d'une malformation des tubules efférents et de l'épididyme. Un blocage au niveau des tubules efférents reliant le testicule à l'épididyme contraint les spermatozoïdes à s'accumuler à la sortie du testicule, dans la région du rete testis. De plus, les tubes de l'épididyme, pourtant normaux à la naissance, ne s'allongent pas pour former la structure convolutée habituelle. L'épithélium de ces tubes est aplati et est entouré d'une quantité anormalement élevée de mésenchyme.<p>Dans un troisième temps, des outils nécessaires aux futures tentatives d'identification de l'agoniste naturel de LGR4 ont été réalisés. Il s'agit :(1) d'anticorps monoclonaux dirigés contre la partie extracellulaire du récepteur humain. (2) d'un appât moléculaire pour la ‘pêche au ligand’. Cet appât est constitué du domaine extracellulaire du récepteur humain couplé à un marqueur histologique. (3) d'une construction peptidique constituée du domaine extracellulaire du récepteur humain couplé à une queue poly-histidine. Cette construction est destinée à servir de greffon lors de chromatographies d'affinités devant permettre de purifier le ligand. (4) de lignées cellulaires exprimant le récepteur LGR4 humain ainsi que le système æquorine devant permettre de détecter l'activation de ce récepteur.<p>Les données apportées par ce travail montrent un rôle important du récepteur LGR4 au cours du développement et permettent de circonscrire le champ des recherches futures. Ceci, ainsi que les outils moléculaires développés, constitue une base pour l'identification future de l'agoniste et la détermination précise de la fonction de LGR4. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished