En 2002, notre équipe a montré que la stimulation de cellules primaires cortico-surrénaliennes bovines en culture primaire par l'hormone hypophysaire ACTH induisait l'expression du VEGF de manière indépendante de sa transcription. En effet, en réponse à l'ACTH, l'expression du VEGF est régulée au niveau post-transcriptionnel par la stabilisation/déstabilisation de son transcrit via des séquences riches en AU (ARE) situées dans la région 3‘ non traduite (3'UTR) de son ARNm. Le laboratoire a mis en évidence une protéine, TIS11b, exprimée également en réponse à une stimulation des cellules par l'ACTH, mais de manière concomitante avec la phase de déstabilisation de l'ARNm du VEGF. TIS11b appartient à une famille de protéines déstabilisatrices des ARNm via les séquences ARE. L'interaction de TIS11b avec l'ARNm du VEGF a été confirmée par la suite, et le site de liaison de la protéine à l'ARNm a également été identifié.<br /><br />Dans ce contexte, le premier objectif de ma thèse était d'évaluer la possibilité d'utiliser les propriétés déstabilisatrices de TIS11b sur l'ARNm du VEGF pour une thérapie anti-angiogène et anti-tumorale. Pour cela, la protéine a été vectorisée par la fusion de petits peptides ou PTD (protein transduction domain, Tat issu du VIH ou les polyarginines R7 et R9) lui permettant de traverser les membranes et d'atteindre sa cible intracellulaire, l'ARNm du VEGF. Nous avons pu montrer dans cette étude que 100 nM de protéines de fusion Flag-Tat-, Flag-R7- et Flag-R9-TIS11b sont capables d'induire une diminution du taux d'ARNm du VEGF ainsi que de la production de la protéine VEGF, dans des cellules en culture après 24 h d'incubation. De plus, nous avons pu montrer que l'injection de 100 nM de la protéine de fusion Flag-R9-TIS11b dans la glande corticosurrénalienne de souris, induisait une diminution d'environ 50 % de l'expression du VEGF par cette glande et que cette diminution était maintenue à 48 h. Des résultats préliminaires encourageants d'inhibition de croissance tumorale ont été obtenus avec l'injection de cette protéine de fusion dans des tumeurs pré-établies chez la souris nude, et doivent être confirmés.<br /><br />L'ACTH étant une hormone qui active la voie de l'AMPc et de la protéine kinase A (PKA), le deuxième objectif de ma thèse était de caractériser la phosphorylation de TIS11b par la PKA en réponse à une stimulation par l'ACTH et d'étudier les conséquences de cette phosphorylation sur son activité déstabilisatrice des ARNm. Nous avons pu montrer pour la première fois, que la PKA phosphoryle la protéine TIS11b, in vitro, au niveau de la sérine 54. Un deuxième site de phosphorylation en réponse à une stimulation par l'ACTH, via probablement une autre kinase que la PKA, a été mis en évidence au niveau de la sérine 334. Il semblerait que la protéine TIS11b comporte un domaine d'activation et un domaine d'inhibition susceptibles d'être régulés en réponse à une stimulation par l'ACTH. L'attribution de ces domaines aux sérines 54 et 334 nécessite des expériences complémentaires.

ColQ est un collagène spécifique qui ancre l’acétylcholinestérase (AChE) dans la fente synaptique de la jonction neuromusculaire (JNM). L'importance du complexe AChE-ColQ dans la physiologie humaine de cette synapse est soulignée par l’identification de mutations dans le gène codant pour ColQ qui conduisent à un syndrome myasthénique congénital (SMC) associé à une déficience en AChE. Le déficit en AChE a, jusqu’à présent, été considéré comme l’unique facteur responsable des symptômes observés chez les patients ainsi que des défauts de la JMN chez le modèle de souris SMC (souris déficiente pour ColQ). Toutefois, ces symptômes sont complexes et l’absence d’AChE ne peut probablement pas expliquer tous les symptômes. Nous avons montré auparavant que ColQ participait à la formation de la synapse ce qui expliquerait les symptômes observés chez les patients et la souris modèle. En effet, nous avons pu montrer que ColQ contrôle l’agrégation du récepteur à l’acétylcholine (RACh) et de l’expression de gènes spécifiques de la synapse. En particulier, nous avons montré in vitro et in vivo, que l’absence de ColQ induit une augmentation du niveau des ARNm codant pour toutes les sous-unités de RACh et une expression réduite du niveau de leurs protéines. Des résultats préliminaires indiquent que cette augmentation de ces ARNm n’est pas transcriptionnelle. L’objectif de cette thèse est d’expliquer les mécanismes qui induisent l’augmentation du niveau des ARNm de AChR en l’absence de ColQ et les voies de signalisation qui relient ColQ au métabolisme des ARN du RACh. Notre hypothèse de travail a été que l'absence de ColQ stimule la stabilisation post-transcriptionnelle des ARNm codant pour les sous-unités du RACh via la protéine HuR. HuR est une protéine qui stabilise les ARNm quand elle se fixe sur les AU-richelement (ARE) dans la séquence 3’UTR. HuR est une protéine clé dans la myogenèse et la formation de la JNM parce qu’elle stabilise de manière post-transcriptionnelle de nombreux transcrits tels que myogénine, MyoD et AChE. Dans cette étude, nous montrons pour la première fois qu’un mécanisme post-transcriptionnel de stabilisation des ARNm est responsable de l’augmentation du niveau des ARNm du RACh via ColQ. De plus, nous constatons qu’en absence de ColQ, il y a une augmentation aux niveaux d’ARNm et de protéine de HuR. HuR est également capable de se lier au domaine ARE dans le 3’UTR des ARNm des sous-unités de AChR. De plus, l’interaction entre HuR et les ARNm du RACh augmente la stabilité et par conséquence les niveaux des transcrits du RACh. Trois conclusions importantes ressortent de ma thèse : nous démontrons que (1) en plus de la régulation transcriptionnelle, il existe des mécanismes de régulation post-transcriptionnlle du RACh (2) ColQ régule la stabilité des ARNm RACh via HuR médiée par MuSK (3) la voie de signalisation p38 contrôle les niveaux de HuR de manière dépendante de ColQ. Ensemble, ces résultats donnent un aperçu des voies de signalisation du muscle qui sont affectées par les mutations de ColQ conduisant à des SMC avec une déficience en AChE. Nos résultats mettront en évidence des nouvelles cibles moléculaires spécifiques qui peuvent conduire au développement des interventions thérapeutiques dans le cadre de myasthénies congénitales. / ColQ is a specific collagen that anchors acetylcholinesterase (AChE) in the synaptic cleft of the neuromuscular junction (NMJ). The importance of AChE-ColQ complex in the physiology of this synapse has been highlighted by the identification of COLQ mutations in the human gene, leading to a congenital myasthenic syndrome (CMS) with AChE deficiency. The lack of AChE has been incriminated for the symptoms observed in patients along with NMJ defects in the CMS mouse model (ColQ-deficient). However, symptoms observed in the patients and mouse model of CMS with AChE deficiency are complex and AChE deficiency cannot account for all of them. We have demonstrated that ColQ could play a role per se in synapse formation which would explain some of the defects observed in patients and model mice. Indeed, we have shown that ColQ controls the clustering of Acetylcholine Receptors (AChR) and the expression of a number of specific synaptic genes. The most striking effect of the absence of ColQ is an upregulation of all AChR subunit mRNAs correlated by an increase in their protein levels. Preliminary results indicate that AChR mRNA upregulation is not transcriptional. This thesis deciphers the mechanisms that drive AChR mRNA upregulation in the absence of ColQ and the pathways that connect ColQ to the AChR RNA metabolism. Accordingly, we hypothesize that the absence of ColQ induces an upregulation of the stabilization of AChR subunit mRNAs, a post-transcriptional mechanism mediated by HuR. HuR is an RNA binding protein which stabilizes its target transcript by binding AU-rich elements (AREs) in their 3’UTR. HuR is critical during skeletal myogenesis and post-synaptic NMJ formation due to its stabilization of such transcripts as myogenin, MyoD and AChE. In this study, we show for the first time that a post-transcriptional mechanism of AChR mRNA stabilization is responsible for the ColQ mediated increase of AChR mRNAs. In support of these findings, the absence of ColQ also increased HuR mRNA and protein levels. We demonstrate that HuR is capable of binding to conserved ARE elements in the 3’UTR of AChR subunit mRNA. HuR’s interaction with AChR mRNA increased the stability of the transcripts, resulting in an increase in mRNA levels. Three major conclusions emerge from my thesis: we provide evidence that (1) in addition to transcriptional and assembly regulation of AChR, post-transcriptional mechanisms of AChR mRNA exist (2) ColQ regulates HuR mediated AChR stability through MuSK and (3) the p38 signalling pathway controls the levels of HuR in a ColQ dependent manner. Collectively, our data provides insight into the muscle signaling pathways which are affected by ColQ mutations leading to CMS with AChE deficiency. Thus, we have identified specific new molecular targets that may become important for the development of therapeutic interventions for patients with CMS.