Frankfurt (Main), Univ., Diss., 2008

Frankfurt (Main), University, Diss., 2008.

Tübingen, Univ., Diss., 2007.

Würzburg, Univ., Diss., 2009. / Zsfassung in engl. Sprache.

Diss. phil.-nat. Univ. Bern, 1999. / Bibliogr.: p. 165-172.

Köln, Universiẗat, Diss., 1998.

Würzburg, Univ., Diss., 2002.

Universiẗat, Diss., 2002--Würzburg.

Der eukaryotische Initiationsfaktor 5A (eIF5A) ist evolutionär hoch konserviert und besitzt als einzig bislang bekanntes Protein die Aminosäuremodifikation Hypusin. Obwohl eIF5A ubiquitär exprimiert wird, sind die zellulären Funktionen von eIF5A noch weitgehend unklar. Hypusininhibitoren konnten die Oberflächenexpression von CD83 die CD83 mRNA im Zellkern dendritischer Zellen anreichern und folglich die Oberflächenexpression von CD83 verhindern konnten, wurde eine Beteiligung von eIF5A beim nukleozytoplasmatischen Export der CD83 mRNA vermutet. Weiterhin ist bekannt, dass HuR, ein Protein der ELAV-Familie, an ein cis-aktives RNA-Element mit einer ausgeprägten Sekundärstruktur innerhalb der kodierenden Sequenz der CD83 mRNA bindet. Während die Bindung von HuR an AU-reiche Elemente in der 3UTR bestimmter Transkripte zu deren Stabilisierung führt, wird die Stabilität von CD83-Transkripten durch die Interaktion mit HuR jedoch nicht beeinflusst. In dieser Arbeit wurden Mikroinjektionsstudien in Xenopus laevis-Oozyten zum nukleozytoplasmatischen Export von CD83 mRNA durchgeführt. Es konnte gezeigt werden, dass die charakteristische Sekundärstruktur des HuR-Response-Elements essentiell für den Kernexport von CD83-Transkripten ist. HuR wurde zudem als Bindungspartner von eIF5a identifiziert. Inhibitorische Antikörper sowohl gegen HuR als auch eIF5A waren in der Lage, den Export von CD83-Transkripten zu inhibieren. Während die meisten mRNAs durch den TAP/NXT1-vermittelten Exportweg in das Zytoplasma transportiert werden, transloziert CD83 mRNA CRM1-vermittelt, da der Export durch den CRM1-Inhibitor Leptomycin B gehemmt werden konnte. Oozytentypischer TFIIIA, ebenfalls ein Interaktionspartner von eIF5A, ist in jungen Xenopus-Oozyten sowohl bei der RNA-Polymerase III-abhängigen Transkription von 5S rRNA als auch am nukleozytoplasmatischem Export und der Lagerung von 5S rRNA im Zytoplasma beteiligt. Aufgrund der Parallele zwischen dem HIV-1-Rev vermittelten HIV-1-mRNA-Export und dem TFIIIA-vermittelten 5S rRNA-Export, wurde der Export von TFIIIA im Hinblick auf eine Beteiligung von eIF5A als Kofaktor analysiert. In Xenopus-Oozyten wurde TFIIIA an den nukleoplasmatischen Filamenten der Kernporenkomplexe detektiert. Weiterhin konnte durch den Einsatz des spezifischen CRM1-Inhibitors Leptomycin B bestätigt werden, dass TFIIIA, welches ein leucinreiches Kernexportsignal enthält, mittels CRM1 exportiert wird. Im Overlay-Blot-Assay konnte gezeigt werden, dass eIF5A mit TFIIIA interagiert. Außerdem deuten Mikroinjektionsexperimente darauf hin, dass eIF5A, wie beim HIV-1-Rev-vermittelten Export, auch beim TFIIIA-Export als essentieller Kofaktor involviert ist. Ein weiterer bekannter Bindungspartner von eIF5A ist Aktin, das im Zellkern an verschiedenen Exportprozessen sowie der RNA-Polymerase I-, II- und III-abhängigen Transkription beteiligt ist. Im Gegensatz zu Aktin wurde die Existenz des Aktinpartners Myosin im Zellkern erst vor kurzem realisiert. In dieser Arbeit konnten durch bioinformatische Analysen gezeigt werden, dass Kernmyosin IC bei Vertebraten weit verbreitet ist. Es wurde auch bei Xenopus laevis identifiziert. Im Vergleich zu Myosin IC fand sich ein zusätzlicher Aminoterminus aus 16 Aminosäuren, welcher als Kernlokalisationssignal fungiert. In Oozyten von Xenopus laevis konnte Kernmyosin IC, ähnlich wie RNA-Polymerase II, an den lateralen Schleifen der Lampenbürstenchromosomen dargestellt werden. Inhibierende Kernmyosinantikörper führten nach Mikroinjektion in den Zellkern von Xenopus-Oozyten zu einer kompletten Retraktion der meisten lateralen transkriptionsaktiven Schleifen sowie zu einer Verkürzung der Chromosomenachsen. konnte Kernmyosin IC vor allem im Nukleoluskern detektiert werden, wo es partiell mit RNA-Polymerase I und Fibrillarin kolokalisierte. In amplifizierten Nukleolen führte eine Transkriptionsinhibition mit Aktinomycin D zu einer Umverteilung des Kernmyosin IC zusammen mit der RNA-Polymerase I und der rDNA. Nach Injektion inhibierender Kernmyosinantikörper kam es zu einem massiven architektonischen Umbau der Nukleolen. Im Gegensatz zu den Nukleolen von somatischen Xenopus-Zellen war ein BrUTP-Einbau in amplifizierte Nukleolen jedoch noch möglich. Wie für Kernaktin bereits beschrieben, konnte auch Kernmyosin IC an den nukleoplasmatischen Filamenten der Kernporenkomplexe von Xenopus laevis-Ooyzten dargestellt werden. Da Aktin als essentieller Kofaktor an Exportprozessen beteiligt ist, sollte in Mikroinjektionsexperimenten auch eine Beteiligung von Kernmyosin IC beim Kernexport überprüft werden. Antikörper gegen ein Epitop in der Myosinkopfdomäne des Kernmyosin IC (XNMIC #42) waren im Gegensatz zu Antikörpern, die den charakteristischen Aminoterminus aus 16 Aminosäuren erkennen (XNMIC #54), in der Lage, einen CRM1-vermittelten Proteinexport zu inhibieren. / Eucaryotic initiation factor 5A (eIF5A), an evolutionary highly conserved protein, is the only protein known to contain the unique amino acid modification hypusine. Even if eIF5A is ubiquitous expressed, cellular functions of eIF5A remain widely obscure. Hypusine inhibitors are able to enrich CD83 transcripts in the cell nucleus of dendritic cells and subsequently prevent surface expression of CD83. Therefore, a role of eIF5A in nucleocytoplasmic export of CD83 mRNA was supposed. Furthermore, HuR, a member of the ELAV family, binds CD83 transcripts on a specific cis-active RNA element, which forms a characteristic secondary structure. Whereas binding of HuR on AU-rich elements in the 3-UTR of certain transcripts leads to their stability, binding of HuR on CD83 transcripts in the coding region does not. In this thesis, microinjection experiments were performed in Xenopus laevis oocytes to elucidate the nucleocytoplasmic export of CD83 mRNA. The characteristic secondary structure of the HuR response element could be demonstrated as crucial for the nucleocytoplasmic export of CD83 transcripts. Furthermore, HuR could be identified as a binding partner of eIF5A. Inhibitory antibodies against both HuR and eIF5A were able to inhibit nuclear export of CD83 mRNA. While the bulk of cellular mRNAs leaves the nucleus with the aid of TAP/NXT1, CD83 mRNA is exported via the CRM1-mediated pathway, as could be demonstrated by export inhibition using specific CRM1 inhibitor leptomycin B. Oocyte type TFIIIA, another interaction partner of eIF5A, promotes RNA-Polymerase III-dependent transcription, nucleocytoplasmic translocation as well as storage of 5S rRNA in immature Xenopus oocytes. Due to a parallel of HIV-1 Rev mediated HIV-1 mRNA export and TFIIIA mediated 5S rRNA export, nuclear export of TFIIIA was examined with respect to a possible role of eIF5A as a cofactor. In Xenopus oocytes, TFIIIA could be detected on nucleoplasmic filaments of the nuclear pore complexes. Moreover, treatment with specific CRM1 inhibitor Leptomycin B comfirmed nucleocytoplasmic export of leucin-rich nuclear export signal containing TFIIIA via CRM1. Interaction of eIF5A with TFIIIA could be demonstrated using overlay blot assay. In microinjection experiments, eIF5A also seems to be an essential cofactor in TFIIIA export, parallel to HIV-1-Rev mediated export. Actin, a further known binding partner of eIF5A, is involved in diverse nuclear export pathways and RNA-Polymerase I, II and III dependent transcription. In contrast to actin, its partner myosin was only recently discovered undeniable in the cell nucleus. Nuclear myosin IC is a member of the Myosin I family of non filamentous, unconventional myosins. In this thesis, bioinformatical analysis displayed a wide distribution in vertebrates. Nuclear myosin IC is also present in Xenopus laevis. Compared to myosin IC, it contains a specific 16 amino acid aminoterminus, which acts as a nuclear localization signal. In Xenopus laevis oocytes, nuclear myosin IC, as well as RNA-polymerase II, localized on the lateral transcriptional active loops of lampbrush chromosomes. Inhibitory antibodies against nuclear myosin lead to complete retraction of most of the lateral transcriptional active loops and to a shortening of the chromosome axes. After inhibition of transcription in amplified nucleoli, using actinomycin D, nuclear myosin IC was relocated together with RNA-polymerase I and rDNA. Injection of inhibitory antibodies against nuclear myosin resulted in a massive architectural alteration of the amplified nucleoli. In contrast to nucleoli of somatic Xenopus cells, BrUTP-incorporation in amplified nucleoli was still possible. As already published for nuclear actin, nuclear myosin IC could also be detected on nucleoplasmic filaments of nuclear pore complexes in Xenopus laevis oocytes. As actin is an essential cofactor in export pathways, a possible role for nuclear myosin IC in nuclear export was examined by microinjection experiments. Antibodies against an epitop in the nuclear myosin head domain (XNMIC #42) were able to inhibit a CRM1 mediated protein export, whereas antibodies against the specific 16 amino acid terminus (XNMIC #54) failed.

Der organische Kationentransport im proximalen Tubulus der Niere spielt eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der Homöostase der Körperflüssigkeiten und der Ausschleusung von toxischen organischen Kationen. Der Transport von organischen Kationen wird an der Bürstensaummembran durch den H+/organische Kationen-Austauscher vermittelt, während bei dem Transport von organischen Kationen an der basolateralen Membran das nach innen gerichtete negative Membranpotential eine treibende Kraft darstellt. Durch Expressionsklonierung wurde der erste organische Kationentransporter, rOCT1, aus der Rattenniere isoliert. Kurz darauf wurde im Rahmen dieser Arbeit ein zweiter organischer Kationentransporter ebenfalls aus der Ratenniere kloniert. rOCT2 besteht aus 593 Aminosäuren und besitzt 12 putative Transmembrandomänen. Zum funktionellen Vergleich zwischen rOCT1 und rOCT2 wurde das Oozytenexpressionssystem verwendet. In der vorliegenden Arbeit wurde ein pharmakologisches Profil von rOCT2 erstellt. Das Substratsprektrum von rOCT2 ist dem von rOCT1 sehr ähnlich. Die Affinitäten von rOCT2 gegenüber verschiedenen Substanzen wurden direkt mit denen von rOCT1 verglichen. Einerseits fanden wir bei einigen Substraten Unterschiede in den Km- und Vmax-Werten, aber andererseits auch viele Ähnlichkeiten zwischen beiden Transportern. Anionen (z. B. p-Aminohippurat) wurden als neue Gruppe von Inhibitoren für den durch rOCT1- und rOCT2-vermittelten Transport identifiziert. Die Potentialdifferenz ist die treibende Kraft des rOCT1- und rOCT2-vermittelten Transportes. Wir konnten potentialabhängige Veränderungen der Km-Werte von Cholin-induzierten Einwärtsströmen zeigen. Bei dem Austausch von Na+-Ionen gegen K+-Ionen im Reaktionspuffer wurde die Aufnahme von Cholin und MPP durch rOCT2 erniedrigt. Der bidirektionale Transport von MPP wurde gezeigt und trans-Stimulationsexperimente für MPP-Influx und MPP-Efflux durchgeführt, um die Asymmetrie des Transporters zu studieren. Darüberhinaus wurde in der vorliegenden Arbeit die Interaktion von verschiedenen Substraten mit rOCT1 und rOCT2 untersucht und ein kompetitver und nicht-kompetitiver Hemmtyp bei der TEA-Aufnahme gefunden. / Organic cation transport in the renal tubule is an important physiological function for the maintenance of body fluid homeostasis and detoxification of harmful organic cations. In general, transport of organic cations in brush-border membranes is mediated by the H+/organic cation antiporter, whereas transport of organic cations in basolateral membranes is stimulated by the inside-negative membrane potential. By the expression cloning method, the organic cation transporter rOCT1, which is expressed in rat liver and kidney, was isolated. In 1996 another organic cation transporter from rat kidney, rOCT2, was isolated by homology cloning. rOCT2 was deduced to be a glycoprotein comprised of 593 amino acid residues with 12 putative transmembrane domains. To analyse the functional characteristics of rOCT2 in comparison with rOCT1 we utilized the Xenopus expression system. During this dissertation a pharmacological profile was made for rOCT2. The apparent substrate spectrum of rOCT2 was similar to that of rOCT1. Affinities of rOCT2 against several compounds were directly compared with those of rOCT1. We found differences in Km- and IC50-values for distinct substrates but also a lot of similarities between both transporters. Anions like p-aminohippuric acid were identified as a new group of inhibitors for rOCT1- and rOCT2-mediated transport. The potential difference is the driving force of transport mediated by rOCT1 and rOCT2. We showed the potential-dependent changes of Km-values of choline induced inward currents. Further when extracellular Na+ ions were replaced with K+ ions, the uptake of MPP and choline by rOCT2 was decreased. The bidirectional transport of MPP was shown and trans-sitmulation experiments for MPP influx and efflux were performed to study asymmetry of the transporter. The mechanism of interaction of several substrates with rOCT1 and rOCT2 were investigated and we found competitive and non-competitive inhibition of TEA uptake.