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Functional characterization of purinergic receptors in the differentiation and activation of macrophages = Caracterización funcional de recptores purinérgicos en la diferenciación y activación de macrófagos

Barberá Cremades, María 08 January 2016 (has links)
Esta Tesis estudia la caracterización de diferentes receptores purinérgicos, principalmente P2X7, en células presentadoras de antígeno de la estirpe mieloide mononuclear fagocítica (monocitos, macrófagos peritoneales y macrófagos derivados de médula ósea). En concreto, se determina como la señalización purinérgica afecta a la diferenciación de los macrófagos, la producción de eicosanoides y de TNF-α, en estados tanto pro-inflamatorias y como de inmunosupresión. Para ello, se emplearon diferentes estímulos celulares; señales de patógenos, principalmente lipopolisacarido (LPS) bacteriano, señal que activa a los macrófagos a través de los receptores tipo toll 4; y señales de daño celular, principalmente ATP y adenosina. Siendo los objetivos concretos de esta Tesis: 1) Estudiar cómo afecta la señalización purinérgica a la diferenciación de los macrófagos; 2) Analizar la relación entre la activación del receptor P2X7 en macrófagos y la producción de eicosanoides; 3) Determinar cómo el receptor P2X7 regula la liberación del factor de necrosis tumoral (TNF)-α en macrófagos extenuados. La metodología empleó macrófagos peritoneales humanos y monocitos de sangre periférica de donantes sanos y pacientes con un proceso séptico severo de origen abdominal; muestras de ratones de la cepa C57BL/6 y deficientes para los receptores a estudio (P2rx7-/- y P2rx4-/-) que se emplearon para estudios tanto in vivo como in vitro. En la mayoría de ensayos se emplearon macrófagos derivados de médula ósea de ratón. Los diferentes macrófagos fueron sometidos a distintos protocolos de estímulo según el objetivo abordado: diferentes dosis de LPS para estudiar la respuesta ante situaciones inflamatorias, o polarización de macrófagos a M1 con LPS e interferon-o a M2 con interleuquina (IL)-4, para en todos los casos estimular con un nucleótido. De los estudios in vitro se analizó la cantidad de IL-1β, TNF-α, prostaglandina (PG) E2, tromboxano A2 y leucotrieno B4 liberada al medio mediante la técnica ELISA, la muerte celular cuantificando la actividad de lactatodehidrogenasa en los sobrenadantes celulares; la viabilidad celular mediante ensayos de reducción meatabólica del bromuro de 3-(4,5- dimetiltiazol-2-ilo)-2,5-difeniltetrazol; la cuantificación de la expresión relativa de los genes que codifican para los diferentes receptores y marcadores citoquímicos de interés, empleando la técnica de PCR-transcriptasa reversa a tiempo real, la cuantificación de marcadores de membrana específicos de macrófagos mediante citometría de flujo, y finalmente la actividad de la enzima convertidora de TNF-α (TACE) y la actividad catepsina B, mediante técnicas fluorométricas. Los estudios in vivo realizados en ratón analizaron la actividad del receptor P2X7 tras la administración intraperitoneal de LPS, cuantificando IL-1β y TNF-α en lavados peritoneales empleando la técnica ELISA, la presencia de ATP extracelular en peritoneo se cuantificó mediante bioluminiscencia, y la medición de la temperatura rectal en un modelo inducido de sepsis mediante una sonda térmica. Resultados y conclusiones: En esta Tesis se demuestra que la señalización purinérgica es capaz de reducir el número de macrófagos diferenciados de médula ósea, resultando en una regulación positiva de ciertos marcadores M2, derivando en un fenotipo específico de macrófago. En los macrófagos maduros, la activación de P2X7 induce la liberación del mediador lipídico PGE2, siendo P2X7 importante en la respuesta febril, un signo clásico asociado con el proceso inflamatorio. Además, la señalización mediante el receptor P2X7 en macrófagos M1 extenuados es capaz de controlar la liberación clásica de TNF-α. Estos resultados tienen implicaciones clínicas, ya que el receptor P2X7 emerge como una diana terapéutica prometedora para la fiebre y su potenciación durante inmunosupresión podría aumentar la inmunidad en los procesos sépticos. / This Thesis studies the characterization of different purinergic receptors, mainly P2X7, analyzing their functions in antigen presenting cells of mononuclear phagocytic myeloid lineage (monocytes, peritoneal macrophages and bone marrow derived macrophages). Precisely, the Thesis determine how purinergic signaling affects macrophage differentiation, eicosanoids and tumor necrosis factor (TNF)-α release, during both proinflammatory and immunosuppressive conditions. Therefore, cells were treated with bacterial products, mainly lipopolysaccharide (LPS), which specifically activates Toll-like receptor 4, and signals of cell damage, mainly ATP and adenosine. Objectives: 1) To study how purinergic signaling affects macrophage differentiation; 2) To analyze the association between the activation of P2X7 in macrophages and the production of eicosanoids; 3) To identify how P2X7 receptor regulates TNF-α release during immune extenuation. Methods: The experiments were performed using peritoneal human macrophages and peripheral blood monocytes of healthy subjects and patients with severe sepsis; mice samples from strain C57BL/6 and the knockout for the genes encoding the receptors to study (P2rx7-/- and P2rx4-/-), these mice were used for both in vivo and in vitro studies. Mice bone marrow derived macrophages were used in almost all the experiments of this thesis. The different macrophages were stimulated with different protocols to address the different objectives: different doses of LPS to mimic inflammatory conditions; LPS and interferon- to polarize macrophages to M1 and with interleukin (IL)-4 to polarize to M2. The amount of IL-1β, TNF-α, prostaglandin (PG) E2, thromboxane A2 and leukotriene B4 released, were measured by ELISA; cell death quantification was measured by the activity of lactate dehydrogenase in cells supernatants; macrophage viability was measured by the metabolic reduction of 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide; relative expression of genes encoding for the desired receptors and markers was quantified by real-time reverse-transcription PCR; the quantification of specific macrophage membrane markers was analyzed by flow cytometry; the converting TNF-α enzyme (TACE) and cathepsin B activity were measured by fluorometric techniques. In vivo mouse studies to study P2X7 receptor activity after intraperitoneal administration of LPS was analyzed by ELISA, measuring IL-1β and TNF-α in peritoneal lavage; detection of extracellular ATP in peritoneum was quantified by bioluminescence; rectal temperature was measured in a sepsis model. Results and Conclusions: this Thesis demonstrates that purinergic signaling is able to reduce the number of differentiated macrophages from bone marrow, which display upregulation of certain M2 markers, resulting in a specific phenotype of macrophage. In mature macrophages, ATP activating P2X7 receptor induces the release of the lipid mediator PGE2, being P2X7 important for the febrile response, a classical signal associated with the inflammatory process. Furthermore, P2X7 receptor signaling in extenuated M1 macrophages is able to control the classical release of TNF-α. These findings have important clinical implications, since P2X7 receptor emerges as a promising target for fever, however its potentiation during immunosuppression could boost immunity in septic processes.
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Chromatin fibers are formed by heterogeneous groups of nucleosomes in vivo

Ricci, Maria Aurelia, 1985- 05 June 2015 (has links)
La arquitectura del genoma y la estructura de la cromatina, junto con los factores de transcripción son actores clave para la autorenovación, la pluripotencia y la diferenciación de las células madre embrionarias (ESCs). Combinando una microscopía cuantitativa de super-resolución (STORM) con simulaciones numéricas hemos sido capaz de definir cómo los nucleosomas están empaquetados en vivo, y hemos identificado un nuevo modelo de organización de la fibra de cromatina. Encontramos que la fibra de cromatina está formada por grupos de nucleosomas de diferentes tamaños, que llamamos "nucleosome clutches" y que estos están intercalados con regiones sin nucleosomas. Además, el número medio de nucleosomas y su nivel de compactación dentro de los clutches, está relacionado con el estado celular. Células madre pluripotentes, tienen en promedio clutches con menos nucleosomas incluidos y de menos densidad con respecto a las células diferenciadas. / Nuclear architecture and chromatin structure, together with the transcriptional network are key players for self-renew, pluripotency and differentiation of embryonic stem cells (ESCs). Combining quantitative super-resolution microscopy (STORM) with computer simulations we resolved how nucleosomes are arranged in vivo, identifying a novel model of organization of the chromatin fiber. We found that chromatin fiber is formed by groups of nucleosomes of varying sizes, which we term “clutches” and these were interspersed with nucleosome-depleted regions. Moreover the median number of nucleosomes and their compaction inside clutches highly correlated with cellular state. Ground-state pluripotent stem cells had, on average, less dense clutches containing fewer nucleosomes with respect to differentiated cells.
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Parasitofauna del zorro rojo (Vulpes vulpes) en la Comunidad Valenciana

Sanchis Monsonís, Gloria 11 February 2016 (has links)
El presente estudio sobre la parasitofauna del zorro rojo (Vulpes vulpes) se ha realizado en la Comunidad Valenciana, dentro del Programa de Vigilancia Epidemiológica sobre especies cinegéticas y salvajes. Entre mayo de 2006 y noviembre de 2013 se realizaron las necropsias de 286 zorros obtenidos de capturas autorizadas para el control de predadores, de atropellos o recogidos enfermos. Tras el análisis de las vísceras torácicas y abdominales, así como el examen de muestras de musculatura esquelética sometidas a una digestión artificial, se detectaron 26 especies de helmintos, incluyendo 16 especies de nematodos, 8 especies de cestodos, una especie de trematodo y una especie de acantocéfalo. La prevalencia de helmintos fue del 98,25% (281/286). La riqueza parasitaria media de helmintos fue de 5,1 (SD=2,42, rango 0-11). Se identificaron Mesocestoides spp. (prevalencia 75,87%), Pterigodermatites affinis (59,09%), Uncinaria stenocephala (58,39%), Eucoleus aerophilus (51,40%), Angiostrongylus vasorum (40,91%), Oxynema crassispiculum (34,97%), Crenosoma vulpis (27,97%), Joyeuxiella echinorrhynchoides (27,62%), Toxocara canis (26,57%), Toxascaris leonina (25,17%), Spirocerca lupi (22,03%), Macracanthorhynchus catulinus (14,69%), Taenia pisiformis (13,29%), Trichuris vulpis (11,54%), Pearsonema plica (4,20%), Mastophorus spp. (3,50%), Dipilydium caninum (3,15%), Taenia spp. (2,80%), Filaroides hirthi (1,75%, primera cita en el zorro de la Península Ibérica), Taenia polyacantha (1,05%), Dirofilaria immitis (1,05%), Brachylaima spp. (0,70%), Taenia hydatigena (0,70%), Taenia crassiceps (0,70%) y Trichinella spp. (0,70%, confirmándose que era T. britovi en un zorro), Taenia taeniaeformis (0,35%) y Physaloptera sibirica (0,35%). Además, es la primera vez que se cita en el zorro en la Península Ibérica la presencia de Tethratirydium en cavidad torácica. La detección de ectoparásitos se realizó en 272 zorros mediante el examen visual de la piel y mediante el examen microscópico de muestras de raspados cutáneos y del conducto auditivo del oído. El 90,8% de los zorros tuvo ectoparásitos (247/272). Se identificaron 24 especies de artrópodos, incluyendo 11 especies de ixódidos (Rhipicephalus turanicus: prevalencia 65,07%, Rhipicephalus pusillus: 28,68%, Ixodes hexagonus: 20,22%, Ixodes ricinus: 7,72%, Rhipicephalus sanguineus: 3,68%, Ixodes ventalloi: 2,21%, Hyalomma lusitanicum: 1,10%, Ixodes inopinatus: 0,74%, Dermacentor marginatus: 0,37%, Haemaphysalis sulcata: 0,37%, Haemaphysalis concinna: 0,37%), 10 especies de pulgas (Pulex irritans: 62,13%, Spilopsyllus cuniculi: 26,84%, Ctenocephalides canis: 9,56%, Ctenocephalides felis: 1,84% Odontopsyllus quirosi: 1,47% Archaeopsylla erinacei subsp. maura: 0,74%, Echidnophaga iberica: 0,74%, Chaetopsylla trichosa: 0,37%, Xenopsylla cunicularis: 0,37% y Nosopsyllus fasciatus: 0,37%), una especie de malófago (Trichodectes canis: 0,70%) y dos especies de ácaros (Sarcoptes scabiei: 2,80% y Otodectes cynotis: 0,35%). Es la primera cita de H. sulcata, E. ibérica y X. cunicularis en el zorro de la Península Ibérica. Se ha comprobado que todas las especies aisladas de helmintos y artrópodos presentaban un alto nivel de agregación parasitaria. Además, la riqueza de especies de helmintos está influida significativamente por el sexo y la edad, así como por el menor grado de urbanización y la latitud. Se comprueba que la presencia de varias especies de helmintos y garrapatas está correlacionada significativamente con la edad y el sexo, y también con factores extrínsecos tales como la latitud, altitud, la estación del año, el termoclima y el grado de urbanización. Nuestros resultados demuestran que los zorros de la Comunidad Valenciana son portadores de helmintos cuya importancia epidemiológica es muy destacada, ya sea por su carácter zoonósico (en particular Toxocara canis y Trichinella spp.), o por su acción patógena demostrada en perros (Spirocerca lupi y Angiostrongylus vasorum). Además, la riqueza de ixódidos y pulgas sugiere que el zorro puede participar de forma activa en la difusión de enfermedades transmitidas por vectores. Por tanto, este cánido silvestre es una especie clave para los estudios epidemiológicos en zonas periurbanas y rurales, donde su presencia debe ser valorada como un factor de riesgo sanitario. / The present study investigated the helminth and ectoparasite species parasitizing the red fox (Vulpes vulpes) in the Valencia Community (south-east of Spain). The work was carried out in the context of a wildlife surveillance program developed by the Valencian Community authorities. Between May 2006 and November 2013 a total of 286 red foxes were necropsied. The animals were hunted under official permits or killed by traffic accidents. During necropsy, thoracic and abdominal viscera were processed to determine the presence of helminth species. Moreover, a sample of skeletal muscle was analyzed. A total of 26 helminth species were identified, including 16 nematodes, 8 cestodes, one trematode and one acanthocephalan. The helminth prevalence was 98.25% (281/286), and the mean helminth richness was 5.1 (SD=2.42, range 0-11). Foxes harboured the following nematode and cestode species: Mesocestoides spp. (prevalence 75.87%), Pterigodermatites affinis (59.09%), Uncinaria stenocephala (58.39%), Eucoleus aerophilus (51.40%), Angiostrongylus vasorum (40.91%), Oxynema crassispiculum (34.97%), Crenosoma vulpis (27.97%), Joyeuxiella echinorrhynchoides (27.62%), Toxocara canis (26.57%), Toxascaris leonina (25.17%), Spirocerca lupi (22.03%), Macracanthorhynchus catulinus (14.69%), Taenia pisiformis (13.29%), Trichuris vulpis (11.54%), Pearsonema plica (4.20%), Mastophorus spp. (3.50%), Dipilydium caninum (3.15%), Taenia spp. (2.80%), Filaroides hirthi (1.75%, being the first report for this nematode in the red fox from the Iberian Peninsula), Taenia polyacantha (1.05%), Dirofilaria immitis (1.05%), Brachylaima spp. (0.70%), Taenia hydatigena (0.70%), Taenia crassiceps (0.70%), Trichinella spp. (0.70%, with a case of T. britovi), Taenia taeniaeformis (0.35%) and Physaloptera sibirica (0.35%). Moreover, the study represent the first report of Tethratirydium larvae in the thoracic cavity of red fox. The presence of ectoparasites was evaluated in 272 red foxes through visual and microscopic examination of the skin and ear canal. Ninety-eight percent of the animals were found positives for ectoparasites. Twenty-four ectoparasite species were identified: 11 ixodid ticks (Rhipicephalus turanicus: prevalence 65.07%, Rhipicephalus pusillus: 28.68%, Ixodes hexagonus: 20.22%, Ixodes ricinus: 7.72%, Rhipicephalus sanguineus: 3.68%, Ixodes ventalloi: 2.21%, Hyalomma lusitanicum: 1.10%, Ixodes inopinatus: 0.74%, Dermacentor marginatus: 0.37%, Haemaphysalis sulcata: 0.37%, Haemaphysalis concinna: 0.37%), 10 fleas (Pulex irritans: 62.13%, Spilopsyllus cuniculi: 26.84%, Ctenocephalides canis: 9.56%, Ctenocephalides felis: 1.84% Odontopsyllus quirosi: 1.47% Archaeopsylla erinacei subsp. maura: 0.74%, Echidnophaga iberica: 0.74%, Chaetopsylla trichosa: 0.37%, Xenopsylla cunicularis: 0.37% and Nosopsyllus fasciatus: 0.37%), one mallophagus louse (Trichodectes canis: 0.70%) and two mites (Sarcoptes scabiei: 2.80% and Otodectes cynotis: 0.35%). This work represent the first report of H. sulcata, E. iberica and X. cunicularis for red fox in the Iberian Peninsula. All helminths and ecoparasites showed a high degree of aggregation. Helminth richness and the prevalence of different parasite species were significantly affected by host (sex and age) and environmental factors (presence of urban areas, latitude, altitude, season and climate). The results demonstrate that foxes in Valencia Community are carriers of helminths whose epidemiological role is noticeable, either because of their zoonotic potential (specially Toxocara canis and Trichinella spp.), or for their pathogenicity in dogs (Spirocerca lupi and Angiostrongylus vasorum). Finally, ixodid and flea richness suggests that the red fox can actively participate in the spread of vector-borne diseases. This wild canid is a key species for epidemiological studies in periurban and rural areas, and its presence should be evaluated as a health risk factor.
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The zebrafish (Danio rerio) : new model to study the role of telomerase in aging and regeneration = El pez cebra (Danio rerio): nuevo modelo para el estudio de la función de la telomersa en envejecimiento y regeneración

Anchelin Flageul, Monique 05 February 2016 (has links)
Objetivos. 1. Caracterización de la longitud telomérica y de la expresión y actividad de la telomerasa en el pez cebra (Danio rerio) a lo largo de su ciclo de vida. 2. Caracterización de la línea de pez cebra deficiente en la subunidad catalítica de la telomerasa (tert). 3. Estudio de la longitud telomérica y de la expresión y actividad de la telomerasa en el pez cebra (Danio rerio) durante el proceso de regeneración de la aleta caudal del pez cebra salvaje y del pez cebra tert-deficiente. - Metodología. Para el primer objetivo, se han utilizado peces cebra de tipo salvaje, de diferentes estirpes y edades. El estudio de la expresión de genes se ha llevado a cabo mediante RT-PCR y PCR a tiempo real, el estudio de la actividad telomerasa mediante una técnica específica y cuantitativa llamada Q-TRAP basada en la amplificación de la secuencia telomérica. La longitud telomérica se ha cuantificado por técnicas diferentes: TRF que consiste en una hibridación con una sonda telomérica radioactiva, Q-FISH y Flow-FISH que consisten en una hibridación in situ con una sonda telomérica fluorescente. Para el cumplimiento del segundo objetivo, se han utilizado los genotipos, tert+/+, tert+/- y tert-/-. Además de las técnicas antes citadas, se han realizado curvas de supervivencia y un estudio histológico sobre diferentes tejidos (Hematoxilina/Eosina, PAS y TUNEL). El estudio de la G2 mutante se ha llevado a cabo con curvas de supervivencia, ensayo de apoptosis por TUNEL, y Q-FISH en núcleos metafásicos. Para el tercer objetivo, con los mismos genotipos y a diferentes edades. Se ha realizado un ensayo de detección de los círculos de ADN telomérico, un ensayo de regeneración en adultos con inhibición de un gen utilizando un morfolino seguido de electroporación o en larvas con inhibición de un gen por inmersión. Peces cebra han sido mantenidos según se indica en el manual del pez cebra. Todos los experimentos cumplen con la directiva de la Unión Europea (86/609/EU) y han sido aprobados por el Comité de Bioética del Hospital Clínico Universitario “Virgen de la Arrixaca” (España) y por el Comité Institucional del Cuidado y Uso Animal del Hospital Infantil de Boston (EEUU). - Resultados y conclusiones. Los resultados de esta tesis han demostrado la estrecha relación de la expresión de la telomerasa y la longitud de los telómeros durante la vida del pez, concluyendo que estos dos parámetros pueden ser utilizados como biomarcadores de envejecimiento en el pez cebra. La línea de pez cebra deficiente en telomerasa ha mostrado signos de envejecimiento prematuro, como curvatura de la columna, infertilidad y reducción de la vida media de la G1, apoyando al pez cebra como un modelo prometedor para estudiar el envejecimiento inducido por el telómero. Además, la G1 muestra activación de p53 en respuesta al desgaste telomerico, reproduce el fenómeno de anticipación genética, ligado al acortamiento telomérico observado en humanos con DC, debido a haploinsuficiencia de la telomerasa. La G2 muere en las primeras etapas de desarrollo y la restauración de la actividad telomerasa rescata la longitud de los telómeros y la supervivencia, indicando que la dosis de telomerasa es crucial. La inhibición genética de p53 rescata los efectos adversos de la perdidad de telómeros, indicando que los mecanismos moleculares están conservados desde peces hasta mamíferos. El estudio de regeneración demuestra que los genotipos tert+/+ y tert-/- regeneran después de una o varias escisiones, aunque la eficiencia de regeneración disminuye con el envejecimiento en ambos. La línea tert-/- regenera con un ratio de regeneración menor que tert+/+, y mantiene la longitud telomérica. ALT está implicado en el mantenimiento de los telómeros durante la regeneración de la aleta caudal en el pez mutante, y se necesitan más estudios para determinar el papel de la telomerasa y posiblemente de ALT en el pez cebra salvaje durante este proceso. / Objectives. The specific objectives of the present work are: 1. Characterization of telomere length, telomerase expression and activity in zebrafish (Danio rerio) throughout its life cycle. 2. Characterization of the tert-deficient zebrafish line. 3. Study of telomere length, telomerase expression and activity in zebrafish (Danio rerio) during the caudal fin regeneration process in wild-type and tert mutant - Methodology. For approaching the first goal, wild-type zebrafish from different strains and different ages have been used. The study of gene expression was carried out by RT-PCR and real time PCR. The telomerase activity was determined by using a specific and quantitative assay based in the amplification of the telomere sequence called Q-TRAP, and also analyzed quantitatively by TRAP. The telomere length was quantified using three different techniques: by a whole-mount in situ hybridization with a fluorescent telomeric probe (Q-FISH and Flow-FISH) or by hybridization using a radioactive telomeric probe (TRF assay). To address the second goal, three zebrafish genotypes: tert+/+, tert+/- y tert-/- have been used. Besides the above techniques, survival curves to estimate the mean lifespan of the first generation (G1) of tert mutant line, and a histological study of different tissues (Hematoxylin / Eosin, PAS and TUNEL staining) have been performed. To study the tert mutant line G2: survival curves, apoptosis by TUNEL assay, and Q-FISH on metaphasic nucleus. To achieve the third objective, we have used all three genotypes at different ages. Telomere length was analyzed by Flow-FISH, and the detection of telomeric DNA circles by CCassay. A caudal fin regeneration assay on adult with gene inhibition using morpholino following by electroporation was performed and finally a caudal fin regeneration assay on larvae with gene inhibition by immersion. Zebrafish were maintained as described in the zebrafish handbook. The experiments performed comply with the Guidelines of the European Union Council (86/609/EU). Experiments and procedures were performed as approved by the Bioethical Committee of the University Hospital “Virgen de la Arrixaca” (Spain) and by the Children's Hospital Boston institutional Animal Care and Use Committee (USA). - Results and conclusions. The results of this tesis have shown that the expression of telomerase and telomere length are closely related during the entire life cycle of the fish and that these two parameters can be used as biomarkers of aging in zebrafish. Telomerase-deficient zebrafish characterization have shown premature aging and reduced lifespan in the first generation, as occurs in humans and may be considered as a promising model to study telomere-driven aging. Interestingly, this mutant line reproduced the genetic anticipation phenomenon, related to telomere shortening, observed in humans with DC. The second-generation embryos died in early developmental stages, and restoration of telomerase activity rescued telomere length and survival, indicating that telomerase dosage is crucial. Genetic inhibition of p53 rescued the adverse effects of telomere loss, indicating that the molecular mechanisms induced by telomere shortening are conserved from fish to mammals. The regeneration study showed that all genotypes regenerated after single or successive amputations and that regeneration efficiency decreased with aging. Tert mutant line showed a lower regeneration rate than its wild-type counterpart, and maintained telomere length in the regenerative tissue. ALT mechanism is implicated in telomere maintenance during caudal fin regeneration in telomerase-deficient fish. Further studies are necessary to definitively elucidate the role of telomerase and the possible ALT implication in telomere maintenance during caudal fin regeneration in wild-type animals.
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Efecto de la testosterona en el sistema reproductor e inmunitario de la dorada (Sparus aurata L.). Identificación de una variante constitutivamente activa del receptor de andrógenos.= Effect of testosterone on reproductive and immune systems of gilthead seabream (Sparus aurata L.). Identification of a constitutively active androgen receptor variant

Sánchez Hernández, Miriam 20 December 2013 (has links)
En la siguiente Tesis Doctoral hemos analizado la influencia de la testosterona (T) exógena sobre el metabolismo de esteroides sexuales y la fisiología de la gónada de la dorada (Sparus aurata L.). Además hemos descrito la presencia de un mecanismo de procesamiento alternativo del ARN, para el receptor de andrógenos (AR), cuya expresión varía con el estado reproductor y se correlaciona con el nivel de T. Esta forma truncada del AR está presente en los granulocitos acidófilos (GAs), descubriéndonos así nuevos mecanismos de regulación en la biología de los neutrófilos de vertebrados. El uso de la dorada como ejemplar de estudio se debe a que es una especie de alto interés comercial en el Mar Mediterráneo. La dorada es un teleósteo marino que presenta un hermafroditismo protándrico, siendo los ejemplares machos durante sus dos primeros años de vida, y pudiendo cambiar de sexo a partir del segundo año. El ciclo reproductor (CR) de los ejemplares macho se caracteriza por presentar cuatro etapas secuenciales: espermatogénesis (ES), puesta (P), post-puesta (PP) y quiesciencia (Q) durante el primer CR. La etapa de Q es sustituida por una etapa de involución testicular (IT), en el segundo CR que permite el cambio de sexo. Tras la puesta, el testículo suele sufrir una serie de cambios morfológicos, entre los que se encuentra una infiltración masiva de leucocitos, la cual es mayor en la etapa IT, antes del cambio de sexo. En primer lugar, quisimos comprobar la capacidad de la T exógena para modificar el balance de las hormonas sexuales esteroideas y la fisiología de la gónada. Con este fin, incorporamos la T en las doradas utilizando el sistema de micropartículas in situ (ISM) (T-ISM). La T exógena promueve un incremento supra-fisiológico en los niveles plasmáticos de T y una disminución de los niveles de 17β-estardiol (E2). Sin embargo, no se vieron alterados los niveles de 11-cetotestosterona (11KT). La T, además, bloquea la proliferación de las células germinales del testículo aunque el incremento en la expresión del gen que codifica para dmrt1 podría prevenir la eliminación completa de las células germinales. Por otra parte, comprobamos que los andrógenos, al igual que había sido demostrado para los estrógenos, están implicados en la migración de leucocitos hacia la gónada. Además, la T de los T-ISM promueve una disminución de la expresión de los genes que codifican receptores Toll-like (tlrs), quedando inhibida la capacidad de reconocer y responder a patógenos. Posteriormente, identificamos una variante, constitutivamente activa, del AR que carece de dominio de unión al ligando (ARΔLBD) en testículo y riñón cefálico (RC) de dorada y su expresión varía con el estado reproductor y con los niveles plasmáticos de testosterona. Esta variante se forma por un procesamiento alternativo del ARNm del AR. Nuestros datos sugieren que este procesamiento alternativo es capaz de modificar la fisiología del testículo, debido a que los andrógenos son capaces de modular el procesamiento alternativo del AR. Además, los andrógenos, concretamente la T, es capaz de regular la respuesta inmunitaria a través de la variante ARΔLBD. Otro dato interesante es que sólo los AGs expresan esta forma truncada mientras que los macrófagos (MØs) no la expresan. Además, el procesamiento alternativo del AR también no sólo se ve modulado por T, sino también por estímulos inmunitarios, aunque esta modulación depende del estado reproductor de los individuos. Todos estos datos nos indican una interacción entre los estímulos endocrinos e inmunitarios en la regulación del procesamiento alternativo del AR así como de las funciones de los AGs. Además, la T podría estar implicada en los cambios fisiológicos de la gónada a través de la regulación del ARΔLBD. / During the development of this thesis, we want to analyze the effect of exogenous androgens, mainly testosterone (T), and the activity of androgen receptor (AR) in immune-reproductive interaction in the sparidae, gilthead seabream (Sparus aurata L.). Furthermore, we described the presence of a mechanism, in which the unique AR gene can give diverse transcripts either in testis or immune organs. The gilthead seabream is a marine, protandrous teleost fish with significant economic value in the Mediterranean aquaculture. The specimens of this specie are male during the two first years, and present a reproductive cycle (RC) divided in four stages. In first RC, the stages are spermatogenesis (SG), spawning (S), post-spawning (PS) and resting (R); in the second RC, the last stage is substituted by testicular involution (TI) stage. After spawning there are various changes in gonad, between which are a massive infiltration of leukocytes, being higher in TI and that can lead to sex change. For this motive this specie can being used as a model for studying the immune-reproductive interactions. In first place, we wanted to observe the capacity of exogenous T to modify the balance of sex steroid hormones and on the physiology of the gonad (proliferation, apoptosis, leukocyte influx and immune status) of mature male specimens of the gilthead seabream. To this end, we used the in situ forming microparticle (ISM) system, which delivers sex steroids without promoting significant physiological alterations in gilthead seabream and that has been previously used in our laboratory to show that T modulates the inflammatory response of head kidney (HK) leukocytes in the gilthead seabream. The results suggest that in mature males, exogenous T can blocked the cell proliferation and increase the migratory influx of leukocyte, although decrease the ability to recognize and response to pathogens. Secondly, we identified a truncated form of the AR generated by alternative splicing that lacks the ligand-binding domain (ARΔLBD) either in testis, HK and acidophilic granulocytes (AGs). We studied the modulation of this variant by androgens and immune stimulus in order to demonstrate its mediation in the role of androgens in the immune response. The results showed that T is able to regulate the testicular morphology through the modulation of the expression of ARΔLBD variant. Furthermore, T was also able to regulate the immunecompetence through ARΔLBD variant. Interestingly, ARΔLBD variant only is expressed in AGs but no in macrophages (MØ). Furthermore, the stimulation with bacterial DNA, also regulated the alternative splicing of AR, but depending of the reproductive stage. These data suggest a crosstalk between endocrine and immune stimuli in the regulation of AR alternative splicing and AGs function. Furthermore, T might be implicated, in the migratory influx into gonad and the physiological changes in gonad through by means of regulation of ARΔLBD.
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Papel del ácido fosfatídico generado por la enzima fosfolipasa D2 en la formación de túbulos del complejo de Golgi

Martínez Martínez, Narcisa 25 March 2015 (has links)
INTRODUCCIÓN: Las vesículas y los túbulos son los intermediarios de transporte (ITs) que regulan el flujo de membrana a través de la vía secretora y endocítica. A diferencia de las vesículas, poco se conoce sobre los mecanismos de formación de los túbulos. Cada vez más estudios apuntan a que los lípidos y las enzimas modificadoras de lípidos tienen un papel muy importante en la formación, mantenimiento y fisión de los intermediarios de transporte. Los glicerolípidos pueden jugar un papel importante en estos procesos reclutando proteínas a las membranas, modulando la función de estas o afectando directamente la curvatura de la membrana, Las proteínas relacionadas con la formación, mantenimiento y desacoplamiento de las proteínas de cubierta tipo I (COPI) también se han relacionado con la formación de túbulos. OBJETIVOS: El objetivo general de esta tesis doctoral fue el de avanzar en el conocimiento sobre el papel de los túbulos como ITs en la vía secretora temprana e identificar mecanismos moleculares y de regulación involucrados en el proceso de tubulación, más específicamente, en el papel de glicerolípidos y enzimas modificadoras de lípidos y de las cubiertas tipo COPI. METODOLOGÍA: Para llevar a cabo estos objetivos Para inducir la formación de túbulos derivados del aparato de Golgi las células HeLa se incubaron a baja temperatura (15ºC) y con la droga brefeldina A (BFA). Se usaron inhibidores específicos de enzimas implicadas en el metabolismo de lípidos de membrana para ver el efecto que producen sobre los túbulos mediante ensayos de inmunofluorescencia. Se determinó la localización de la enzima endógena fosfolipasa D2 (PLD2) en el complejo de Golgi mediante inmunocitoquímica ultraestructural. También, se analizó el efecto de la sobreexpresión y el silenciamiento génico de PLD2. CONCLUSIONES: De los resultados obtenidos se desprenden las siguientes conclusiones: 1. Las células HeLa incubadas a 15ºC son un buen modelo para estudiar el papel de glicerolípidos y enzimas modificadoras de lípidos en la formación de túbulos. 2. El ácido fosfatídico (PA) y el diacilglicerol (DAG) son necesarios para la formación y mantenimiento de los túbulos inducidos a 15ºC y BFA, respectivamente. 3. El PA generado por PLD es el más importante para la formación de los túbulos inducidos a baja temperatura. Este lípido está involucrado en un paso temprano de la formación y en la elongación de estos túbulos. 4. PLD2, pero no PLD1, es la enzima responsable de la formación del PA necesario en la tubulación inducida a baja temperatura. Esta enzima está asociada a las membranas del complejo de Golgi y está implicada en el mantenimiento de la arquitectura de este orgánulo. 5. La reducción del PA generado por PLD2 induce la formación de un tipo específico de túbulos que contienen proteínas de matriz. 6. El reclutamiento de ArfGAP1 en las membranas del complejo de Golgi es dependiente del PA generado por PLD2. ArfGAP1 podría ser un componente de la maquinaria molecular implicada en el reclutamiento de la carga en los túbulos. 7. Las membranas del complejo de Golgi son capaces de generar distintos tipos de túbulos con una composición específica. Cuando su actividad enzimática se ve potenciada o cuando la enzima se recluta en ciertas regiones del complejo de Golgi, el PA generado favorece la curvatura local de la membrana reclutando a ArfGAP1, el cual, a su vez, podría ser necesario para el reclutamiento de enzimas residentes. Por el contrario, cuando esta actividad enzimática es inhibida, podría haber una acumulación de DAG o ácido lisofosfatídico, podrían generar otro tipo de túbulos que contienen proteínas de matriz.. Se podría especular que algunos túbulos de Golgi podrían estar relacionados con el transporte retrógado intra-Golgi, mientras que otros mantienen la arquitectura de la cinta del Golgi o bien intervienen en el transporte anterógrado intra-Golgi. / Vesicles and tubules are the transport carriers that regulate membrane flux through the secretory and endocytic pathways. In contrast to vesicles, little is known about the mechanism of formation of Golgi tubules. An increasing body of evidence has pointed to the crucial importance of lipids and lipid-modifying enzymes in the biogenesis, maintenance and fission of transport carriers. Glycerophospholipids may play an important role in these processes, by mediating protein recruitment to membranes, modulating protein functions or by affecting membrane curvature directly. The proteins involved in the formation, maintenance and detachment of the coat protein I (COPI) have also been related to the formation of tubules. AIMS: The aim of the present study was to deepen our understanding of the molecular mechanisms that participate in Golgi tubule formation. More specifically, we analysed the role of glycerolipids and related enzymatic activities in the generation and/or maintenance of Golgi tubules as well as their relationship with the COPI machinery. METHODS: To perform these aims we used low temperature (15°C) and the drug brefeldin A (BFA) to induce the formation of Golgi tubules in HeLa cells. Immunofluorescence microscopy was used to visualize the effect of specific inhibitors of lipid modified enzymes in the formation of Golgi tubules. We assessed the localization of endogenous phospholipase D2 (PLD2) within the Golgi membranes by cryoimmunoelectron microscopy. Furthermore, PLD2-overexpressed and depleted cells we analysed. CONCLUSIONS: The results obtained after these studies rendered these conclusions: 1. Hela cells cultured at low temperature (15ºC) are an useful model to study the role of glycerolipids and lipid modified enzymes in the formation of Golgi tubules. 2. Phosphatidic acid (PA) and diacylglycerol (DAG) are needed for the formation and maintenance of low temperature- and BFA-induced Golgi tubules, respectively. 3. PA generated by PLD is the most important glycerolipids for the formation of low temperature-induced Golgi tubules. This glycerolipid may be involved in an early step of the budding process as well as in the tubule elongation. 4. PLD2, but not PLD1, is the enzyme responsible for the formation of PA needed in the low temperature model of Golgi tubulation. This enzyme is associated to Golgi membranes and is involved in the maintenance of the architecture of this organelle. 5. The reduction of the levels of the PA generated by PLD2 induces the formation of a specific set of Golgi tubules containing matrix proteins. 6. ArfGAP1 recruitment to the Golgi membranes depends on the presence of the PA generated by PLD2. This protein might be a component of the molecular machinery involved in cargo recruitment into Golgi tubules. 7. Golgi membranes are able to generate different types of tubules of varied composition. When PLD2 enzymatic activity is enhanced or the enzyme is recruited to certain Golgi areas, the PA generated is able to bend the membrane and to recruit ArfGAP1, which might be necessary for the recruitment of resident enzymes. Conversely, when its activity is inhibited, there is an accumulation of DAG or lisophosphatidic acid, which might generate another type of tubule containing matrix proteins. It can be speculated that some Golgi tubules may be involved in retrograde intra-Golgi traffic, whereas others keep the architecture of the Golgi ribbon or anterograde intra-Golgi transport.
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El pez zebra (Danio rerio) como modelo de estudio in vivo del papel de la telomerasa en la hematopoyesis= The zebrafish (Danio rerio)as a model to stydy in vivo the role of telomerase in hematopoiesis

Alcaraz Pérez, Francisca 28 April 2014 (has links)
Objetivos. En el presente trabajo se han cumplido dos objetivos concretos: 1. Desarrollo de un nuevo sistema chivato basado en la luciferasa para el estudio de promotores tanto constitutivos como inducibles en el contexto de un organismo completo. 2. Estudio del papel extracurricular del componente de ARN de la telomerasa (TR) en la hematopoyesis usando el pez cebra como modelo. - Metodología. Embriones de pez cebra han sido manipulados genéticamente mediante la microinyección de plásmidos, morfolinos y ARN (solos o en combinación) en el estadío de desarrollo de 1-8 células para recrear las distintas condiciones experimentales de estudio. Para el abordaje del primer objetivo, el estudio de la actividad promotora en el contexto de un organismo completo se ha llevado a cabo mediante la medida de luminiscencia. Para el cumplimiento del segundo objetivo, el recuento de los distintos tipos de células sanguíneas en las distintas condiciones experimentales se ha abordado mediante la tinción específica con TSA (neutrófilos) o con o-dianisidina (eritrocitos), o mediante el uso de distintas líneas de pez cebra transgénico que expresan proteínas fluorescentes en neutrófilos y en macrófagos. La funcionalidad de los neutrófilos se ha estudiado mediante ensayos de reclutamiento a una herida y de respuesta a una infección bacteriana. El estudio de la actividad telomerasa se ha realizado mediante una técnica específica y cuantitativa llamada Q-TRAP basada en la amplificación de la secuencia telomérica, y la longitud de los telómeros se ha cuantificado mediante Q-FISH, que consiste en una hibridación in situ con una sonda telomérica fluorescente. El estudio de la expresión de genes se ha llevado a cabo mediante RT-PCR y PCR a tiempo real, y también mediante hibridación in situ con sondas de ARN. Peces cebra han sido mantenidos según se indica en el manual del pez cebra. Todos los experimentos cumplen con la directiva de la Unión Europea (86/609/EU) y han sido aprobados por el Comité de Bioética del Hospital Clínico Universitario “Virgen de la Arrixaca” (España) y por el Comité Institucional del Cuidado y Uso Animal del Hospital Infantil de Boston (EEUU). - Resultados y conclusiones. Para el desarrollo del primer objetivo se combinaron las ventajas que tiene el ensayo clásico de la doble luciferasa con las que tiene el pez cebra como modelo vertebrado para desarrollar una técnica que permita analizar la actividad promotora y la función génica en el contexto de un organismo completo. El resultado fue una técnica rápida y sensible que puede ser utilizada como una nueva herramienta para caracterizar in vivo la mínima región promotora de un gen, la respuesta de promotores inducibles ante distintos estímulos, la validación de construcciones genéticas y la función de un gen de interés. La técnica desarrollada resulta muy valiosa cuando se combina con las ventajas que ofrece el pez cebra para hacer escrutinios a gran escala basados en el fenotipo, convirtiéndose en un sistema muy prometedor para la identificación y la validación de fármacos o genes que, por ejemplo, reviertan el fenotipo. El desarrollo del segundo objetivo de esta tesis muestra varias evidencias que apoyan al pez cebra como modelo para estudiar el papel del componente de ARN de la telomerasa (TR) en la disqueratosis congénita, que es una enfermedad hereditaria de envejecimiento prematuro, cuyos pacientes mueren principalmente debido al fallo de la médula ósea. En este modelo, la inhibición genética de TR resultó en la afectación de la mielopoyesis, a pesar de que el desarrollo de las células madre hematopoyéticas fue normal. Sorprendentemente, la neutropenia causada por la ausencia de TR fue independiente de la longitud telomérica y de la actividad telomerasa. El análisis genetico mostró que TR modula la decisión del destino mieloide/eritroide mediante el control de los niveles de los factores de transcripción mieloide y eritroide spi1 y gata1, respectivamente, mediante la estimulación de gcsf y mcsf. Este modelo de pez cebra deficiente en TR ilumina el papel extracurricular de TR, y podría establecer dianas terapéuticas para la disqueratosis congénita. / The zebrafish (Danio rerio) as a model to study in vivo the role of telomerase in hematopoiesis - Objectives. The specific objectives of the present work are: 1. Development of a new luciferase-based reporter system for studying both constitutive and inducible promoters in the context of a whole organism. 2. Study the non-canonical role of the telomerase RNA component (TR) in hematopoiesis using the zebrafish. - Methodology. Zebrafish embryos were genetically modified by injecting plasmids, morpholinos and RNA (alone or in combination) whitin the 1- to 8-cell developmental stage to simulate the different experimental conditions. For approaching the first goal, the study of the promoter activity in the context of a whole organism was carried out by measurement of luminiscence. To addressing the second goal, the counting of the different blood cells in the different experimental conditions was carried out by specific staining with TSA (neutrophils) or o-dianisidine (erythrocytes), or by using different transgenic zebrafish lines expressing fluorescent proteins in neutrophils or macrophages. The neutrophil functionality was studied by quantifying the recruitment to a wound and the response to a bacterial infection. The telomerase activity was determined by using a specific and quantitative assay based in the amplification of the telomere sequence and called Q-TRAP, and the telomere length was quantified by a whole-mount in situ hybridization with a fluorescent telomeric probe (Q-FISH). The study of gene expression was carried out by RT-PCR and real time PCR, and also by in situ hybridization with RNA probes. Zebrafish were maintained as described in the zebrafish handbook. The experiments performed comply with the Guidelines of the European Union Council (86/609/EU). Experiments and procedures were performed as approved by the Bioethical Committee of the University Hospital “Virgen de la Arrixaca” (Spain) and by the Children's Hospital Boston institutional Animal Care and Use Committee (USA). - Results and conclusions. Firstly, we have adapted the classical dual luciferase reporter assay from cell lines to whole zebrafish embryos/larvae. The result is a rapid and sensitive technique that can be used as a new tool to characterize the minimum promoter region of a gene as well as the in vivo response of inducible promoters to different stimuli. We have illustrated the usefulness of this system for studying both constitutive and inducible promoters. This assay has several advantages compared with the classical in vitro (cell lines) and in vivo (transgenic mice) approaches. Among others, the assay allows a rapid and quantitative measurement of the effects of particular genes or drugs in a given promoter in the context of a whole organism and it can also be used in high throughput screening experiments. We have showed several evidences supporting the zebrafish as a new model to study the role of the telomerase RNA component (TR) in DC, which is an inherited premature disease whose patients usually die of bone marrow failure. In this model, genetic depletion of TR results in impaired myelopoiesis, despite normal development of hematopoietic stem cells (HSCs). Interestingly, the neutropenia caused by TR depletion is independent of telomere length and telomerase activity. Genetic analysis shows that TR modulates the myeloid-erythroid fate decision by controlling the levels of the master myeloid and erythroid transcription factors spi1 and gata1, respectively, through stimulation of gcsf and mcsf. This model of TR deficiency in the zebrafish illuminates the non-canonical roles of TR, and could establish therapeutic targets for DC.
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Uso de la terapia fotodinámica y el chitosan para la inactivación de Candida Albicans en un modelo de experimentación

Saorin Falcon, Pascual 20 January 2016 (has links)
Objetivo El objetivo principal de este estudio fue el de evaluar los efectos de la terapia fotodinámica (TFD) y el chitosan sobre la candidiasis oral en ratones y estudiar el posible efecto positivo sobre el fotosensibilizante azul de metileno usado en este tratamiento. Los objetivos específicos fueron: 1. Comparar la colonización de cándida albicans en tres cepas diferentes de ratones (DBA/2, Balb/c y Swiss) para determinar la más indicada como modelo de experimentación. 2. Valorar la efectividad de la los diferentes tratamientos comparándolos con el grupo control. 3. Analizar macroscópicamente las lenguas de ratones DBA/2 inmunodeprimidos afectados de candidiasis oral con los diferentes tratamientos y compararlo con un grupo control. 4. Estudiar las alteraciones epiteliales microscópicas de las lenguas de ratones DBA/2 inmunodeprimidos afectados de candidiasis oral con los diferentes tratamientos y compararlo con un grupo control. 5. Observar la respuesta inflamatoria microscópica en el tejido conectivo de las lenguas de ratones DBA/2 inmunodeprimidos afectados de candidiasis oral con los diferentes tratamientos y compararlo con un grupo control. Material y método Un total de 41 ratones (n= 37 DBA/2, n=2 Balb/c y n=2 Swiss) fueron utilizados. Para la consecución del primer objetivo específico se incluyeron 6 ratones: - Grupo 1: 2 ratones consanguíneos de la cepa DBA/2. - Grupo 2: 2 ratones consanguíneos de la cepa Balb/c. - Grupo 3: 2 ratones de cruzamiento libre de la cepa Swiss. Un ratón de cada grupo fue inoculado con una solución de Candida Albicans de 109 cels/mL y el otro con una solución de 1010 cels/mL, posteriormente a administrarles fármacos inmunosupresores (dexametasona). Las muestras fueron recogidas mediante frotis bucal para su posterior estudio. Para la consecución del segundo, tercero, cuarto y quinto objetivos específicos fueron incluidos un total de 35 ratones DBA/2. Todos los animales fueron inoculados con una suspensión de 109 células/mL, posteriormente a la administración de inmunosupresores (dexametasona). Los animales fueron divididos en 7 grupos de tratamiento (n=5 animales por grupo) en relación al tratamiento empleado para la candidiasis oral: Grupo 1 (control), Grupo 2 (nistatina), Grupo 3 (TFD), Grupo 4 (chitosan 1,5 mg/mL), Grupo 5 (chitosan 3 mg/mL), Grupo 6 (TFD + chitosan 1,5 mg/mL) y Grupo 7 (TFD + chitosan 3 mg/mL). Resultados Al comparar la colonización cándida albicans en tres cepas diferentes (DBA/2, Balb/c y Swiss) para determinar la más indicada en los modelos de candidiasis oral en ratones inmunodeprimidos, observamos que el mayor número de UFC/mL se produjo en la cepa DBA/2. Al valorar la efectividad de la TFD, nistatina, aplicación tópica de chitosan a 1,5 y 3 mg/mL y el tratamiento combinado de TFD + chitosan tópico a 1,5 y 3 mg/mL y compararlo con un grupo control (a los 3, 5, 7 y 11 días de tratamiento) observamos que el recuento de UFC/mL fue similar en todos los grupos a los 3 y 5 días de finalizar la inoculación. Al finalizar el experimento, todos los grupos de estudio presentaban un recuento de UFC/mL mucho más bajo que el grupo control, con diferencias estadísticamente significativas (p≤0,05). Al analizar macroscópicamente la lengua de los animales al finalizar el experimento sólo observamos la presencia de placas blancas en 2 dorsos linguales de los 35 animales y ambos pertenecían a animales del grupo control. Histológicamente, sólo la presencia de levaduras e hifas en queratina y la espongiosis fueron significativamente más altas en el control que en el resto de los grupos de tratamiento (p=0,024 y p=0,018 respectivamente). Finalmente, la presencia de células inflamatorias en la lámina propia fue menor en los animales tratados con TFD (Grupo 3) que en el resto de grupos, con diferencias estadísticamente significativas (p=0,024). / Objective The main objective of this study was to evaluate the effects of photodynamic therapy (PDT) and chitosan on oral candidiasis in mice and study the possible positive effect on the photosensitizer methylene blue used in this treatment. The specific objectives were: 1. Compare the colonization of Candida albicans in three different strains of mice (DBA / 2, BALB / c and Swiss) to determine the most appropriate as a model of experimentation. 2. Assess the effectiveness of different treatments compared to the control group. 3. Macroscopic analysis of the tongues of immunosuppressed DBA / 2 mice affected with oral candidiasis and different treatments and compared to a control group. 4. To study the microscopic epithelial disruption of the tongues of immunosuppressed DBA / 2 oral mice affected with oral candidiasis and different treatments and compared with a control group. 5. Observe the microscopic inflammatory response in the connective tissue of the tongues of immunosuppressed DBA / 2 mice afeccted with oral candidiasis and different treatments and compared with a control group. Materials and methods A total of 41 mice (n = 37 DBA / 2, n = 2 Balb / c and n = 2 Swiss) were used. To achieve the first specific objective 6 mice were included: - Group 1: 2 inbred mice of the DBA / 2 strain. - Group 2: 2 inbred mice of the Balb / c strain. - Group 3: 2 free crossing mice of Swiss strain. One mouse from each group was inoculated with Candida albicans solution of 109 cells / ml and the other with a solution of 1010 cells / mL, then to administer immunosuppressant drugs (dexamethasone). To achieve the remaining specific objectives were included a total of 35 DBA / 2 mice. All animals were inoculated with a suspension of 109 cells / mL, after the administration of immunosuppressants (dexamethasone). The animals were divided into 7 treatment groups (n = 5) in relation to the treatment used for oral candidiasis: G1 (control), G2 (Nystatin), G3 (TFD), G4 (chitosan 1 , 5 mg / mL), G5 (chitosan 3 mg / mL), G6 (PDT + chitosan 1.5 mg / mL) and G7 (PDT + chitosan 3 mg / mL). Results Comparing candida albicans colonization in three different strains (DBA / 2, BALB / c and Swiss) to determine the most appropriate models of oral candidiasis in immunocompromised mice, we found that the largest number of CFU / mL occurred in the DBA strain /2. In assessing the effectiveness of PDT, nystatin, topical application of chitosan 1.5 and 3 mg / mL and the combined treatment of topical PDT chitosan + 1.5 and 3 mg / mL and compared with a control group, note that the count of CFU / mL was similar in all groups at 3 and 5 days of inoculation end. At the end of the experiment, all the study groups presents a count of CFU / mL much lower than the control group, with statistically significant differences (p ≤ 0.05). In macroscopic analysis of the tongues at the end of the experiment, we observed the presence of white patches on the backs of two tongues of the 35 animals and both belonged to control animals. Histologically, only the presence of yeast and hyphae in keratin and spongiosis were significantly higher in the control than in the other treatment groups (p = 0.024 and p = 0.018 respectively). Finally, the presence of inflammatory cells in the lamina propria was lower in animals treated with PDT (Group 3) than in the other groups, with statistically significant differences (p = 0.024).
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Inmunotoxicología producida por metales pesados y caracterización del moco de piel en peces= Heavy metal immunotoxicology and skin mucus in fish

Guardiola Abellán, Francisco Antonio 25 July 2014 (has links)
Durante la presente Tesis Doctoral se han estudiado los efectos inmunotoxicológicos de la exposición mediante baño a arsénico, cadmio y mercurio en la dorada (Sparus aurata L.), la cual es una especie que posee la mayor tasa de producción en la acuicultura mediterránea. Por otra parte, también se han estudiado los parámetros inmunológicos y físico-químicos del moco de la piel de cinco especies de peces teleósteos marinos. En el caso de la dorada los parámetros inmunológicos en el moco se compararon con los presentes en el suero. Por último, se evaluaron los efectos de estos metales pesados en la inmunidad de la mucosa de la piel de la dorada. Por otra parte, los peces ocupan una posición filogenética clave en la evolución de los vertebrados representando el primer grupo animal que tiene un sistema inmunitario innato y adaptativo bien estructurado, en este sentido, el estudio de la inmunología de este grupo de vertebrados tiene un doble interés científico y filogenético básico. En primer lugar, hemos evaluado los efectos de la exposición mediante baño a concentraciones sub-letales de arsénico (As), cadmio (Cd) y mercurio (Hg) en la dorada, con especial énfasis en la respuesta inmunitaria innata. En el caso del As, se observaron alteraciones histológicas en el hígado, así como acumulación de este metal en este órgano después de 30 días de exposición. Los parámetros inmunitarios humorales (niveles de IgM, actividades del complemento y la peroxidasa) no se vieron afectados, mientras que los parámetros innatos celulares del riñón cefálico (peroxidasa, explosión respiratoria y las actividades fagocíticas en los leucocitos) se incrementaron significativamente después de 10 días de exposición en comparación con los peces control. Del mismo modo, con respecto a la exposición a Cd, se observaron alteraciones morfológicas progresivas en el hígado y en el páncreas exocrino que se correlacionaron con la acumulación hepática de Cd, la reducción en la actividad del complemento en el suero y la explosión respiratoria en los leucocitos en un grado significativo después de 10 y 30 días de exposición. La actividad de la peroxidasa en el suero y la fagocitosis de los leucocitos aumentaron en diferentes momentos del muestreo, mientras que los niveles de IgM en el suero y la actividad de la peroxidasa en los leucocitos resultaron inalterados. Finalmente, se confirmaron los efectos toxicológicos del Hg porque los ejemplares de dorada expuestos mediante baño mostraron un aumento de las enzimas antioxidantes en el hígado después de 2 días, alteraciones histopatológicas en el hígado y la piel, así como la sobre-expresión de genes relacionados con el metabolismo de xenobióticos, el estrés celular y la apoptosis en la piel. Además, las actividades del complemento y la peroxidasa en el suero se incrementaron, así como la peroxidasa, la explosión respitaroria y las actividades fagocíticas en los leucocitos de riñón cefálico que se incrementaron en diferentes tiempos de exposición. En segundo lugar, se identificaron y caracterizaron los diferentes mecanismos de defensa humorales constitutivos de la mucosa de la piel de la dorada (Sparus aurata) y se compararon con los presentes en el suero. Por lo tanto, se demostró que el moco de la piel de la dorada contiene niveles más bajos de IgM, niveles similares de lisozima, fosfatasa alcalina y proteasas, y más altos en actividades como la esterasa, peroxidasa y antiproteasa que en el suero. Asimismo, el moco de la piel reveló una fuerte actividad bactericida contra bacterias patógenas de peces testadas en comparación con la actividad encontrada en el suero, mientras que las bacterias no patógenas pueden incluso crecer mejor en la presencia de moco. Además, se evaluaron los mecanismos de defensa humoral y parámetros físico-químicos en el moco de la piel de cinco especies de teleósteos marinos. Se observaron varias correlaciones entre los parámetros como el pH, la conductividad y el potencial redox, así como, entre la densidad y la osmolaridad. Centrándose en la respuesta inmunitaria, los resultados mostraron que mientras que algunas de las actividades inmunitarias fueron muy similares en los peces estudiados, otras, tales como las actividades de la proteasa, antiproteasa, fosfatasa alcalina, esterasa y peroxidasa variaron dependiendo de las especies de peces. Por último, se investigó si los parámetros de la inmunidad innata de las mucosas de la piel determinados en la dorada se ven afectados o no por los metales pesados ensayados anteriormente. De este modo, se detectaron algunos cambios en la composición del moco y en las funciones inmunitarias después de la exposición a estos metales. En general, el perfil de carbohidratos sufrió pequeñas variaciones y la mayoría de las actividades enzimáticas se incrementaron después de la exposición. Curiosamente, el Hg provocó los incrementos más importantes en la mucosa de la piel, mientras que los perfiles de proteínas obtenidos por SDS-PAGE y HPLC mostraron poca variación en el moco de la dorada después de la exposición a estos metales. En conclusión, estos resultados podrían ser útiles para una mejor comprensión de los efectos de la exposición a metales pesados en el sistema inmunitario de la dorada y como podrían afectar a la biología marina, la acuicultura o a los consumidores humanos. Por otra parte, el estudio de la función y el comportamiento de la inmunidad de las mucosas en la piel, como un componente clave del sistema inmunitario innato, podría ayudar a comprender la resistencia de los peces, así como la presencia y distribución de los patógenos y la magnitud de las infecciones y el uso de los parámetros como biomarcadores en la toxicología de los peces, los cuales serían los aspectos de mayor importancia para la acuicultura / During the present PhD Thesis, we have studied the immunotoxicological effects of waterborne exposure to arsenic, cadmium and mercury in the gilthead seabream (Sparus aurata L.), which is a species with the highest rate of production in Mediterranean aquaculture. Furthermore, the immunological and physico-chemical parameters of the skin mucus from five marine teleost fish species have been also studied. In the case of gilthead seabream the immunological parameters in mucus were compare with those present in serum. Finally, the effects of these heavy metals in the skin mucosal immunity of gilthead seabream were evaluated. Moreover, fish occupy a key phylogenetic position in the evolution of vertebrates representing the first animal group that has a well structured innate and adaptive immune system; in this sense, the study of the immunology of this group of vertebrates has a dual basic scientific and phylogenetic interest. Firstly, we have evaluated the effects of waterborne exposure to sub-lethal concentrations of arsenic (As), cadmium (Cd) and mercury (Hg) in the teleost fish gilthead seabream, with special emphasis in the innate immune response. In the case of As, we observed histological alterations in the liver as well as As-accumulation in this organ after 30 days of exposure. The humoral immune parameters (seric IgM, complement and peroxidase activities) were not affected while the cellular innate parameters of head-kidney (leucocyte peroxidase, respiratory burst and phagocytic activities) were significantly increased after 10 days of exposition compared to the control fish. Similarly, regarding Cd exposure, it was observed progressive deleterious morphological alterations in liver and exocrine pancreas that correlated with the hepatic Cd-accumulation, reduction in the serum complement activity and leucocyte respiratory burst to a significant extent after 10 and 30 days of exposure. The serum peroxidase activity and leucocyte phagocytosis were increased at different sampling times while serum IgM levels and leucocyte peroxidase activity resulted unaltered. Finally, toxicological effects were confirmed for Hg because waterborne-exposed seabream specimens showed increased liver antioxidant enzymes after 2 days, histopathological alterations in the liver and skin as well as up-regulation of the expression of genes related to xenobiotic metabolism, cellular stress and apoptosis in the skin. Further, serum complement and peroxidase activities were increased, as well as head-kidney leucocyte peroxidase, respiratory burst and phagocytic activities were increased in different exposure time. Secondly, different constitutive humoral defence mechanisms of the skin mucus of gilthead seabream (Sparus aurata) were identified and characterized and compared with those present in the serum. Thus, it was demonstrated that gilthead seabream skin mucus contains lower levels of IgM, similar levels of lysozyme, alkaline phosphatase and proteases, and higher esterase, peroxidase and antiprotease activities than serum. Skin mucus revealed stronger bactericidal activity against tested fish pathogen bacteria compared to the serum activity, whilst non-pathogen bacteria can even grow better in the presence of mucus. In addition, humoral defence mechanisms and physico-chemical parameters in the skin mucus of five species of teleosts were evaluated. Several correlations were observed between parameters as pH, conductivity and redox potential, as well as, density and osmolarity. Focusing on the immunological response, results showed that while some immune activities were very similar in the studied fish other such as protease, antiprotease, alkaline phosphatase, esterase and peroxidase activities varied depending on the fish species. Finally, we investigated whether the skin mucus innate immune parameters determined in the gilthead seabream are affected or not by the heavy metals assayed above. Thus, some changes in the mucus composition and immune functions after heavy metal exposure were detected. Overall, carbohydrate profile suffered little changes and most of the enzymatic activities were increased after exposition. Interestingly, Hg evoked the most important increments in the skin mucus and protein profiles obtained by SDS-PAGE and HPLC showed little variations in the seabream mucus after exposure to heavy metals. In conclusions, these results could be useful for better understanding the effects of exposition to heavy metals in the seabream immune system and as could interfere with fish biology, aquaculture management or human consumers. Moreover, the study of the role and behaviour of the mucosal immunity in skin, as a key component of the innate immune system, could help to understand the fish resistance as well as the presence and distribution of pathogens and magnitude of infections and use of parameters as biomarkers in fish toxicology, which would be aspects of major importance for the aquaculture industry.
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Caracterização da fosforilação de maspina no desenvolvimento da glândula mamária murina e a correlação com sua localização subcelular. / Characterization of maspin phosphorylation in the development of the murine mammary gland and the correlation with subcellular localization.

Silva, Magna Magalhães 10 September 2015 (has links)
Maspina é uma proteína supressora de tumor e metástase e sua localização subcelular está relacionada ao prognóstico do câncer de mama. Nosso grupo mostrou em MCF-10A que quando fosforilada maspina se acumula no citoplasma. Porém, esta correlação ainda não foi relatada in vivo. Aqui investigamos a expressão, fosforilação e localização subcelular de maspina ao longo do desenvolvimento da glândula mamária murina. Maspina foi detectada no estágio mais tardio da gestação, na lactação e na involução. Os níveis de fosforilação de maspina são maiores no período de lactação do que na involução. Interessantemente, a porcentagem de células que apresenta maspina no núcleo é maior na fase de involução do que na fase de lactação Estes dados mostram que a correlação entre níveis de fosforilação de maspina e localização subcelular também é observada in vivo e que esses processos são reguladas ao longo do desenvolvimento na glândula mamária murina. / Maspin is a protein with tumor and metastasis suppressing activity and its subcellular localization is related to breast cancer prognosis. Using MCF-10A cells as a model system, our group demonstrated a correlation between maspin phosphorylation and cytoplasmic accumulation. Here we investigated maspin expression, phosphorylation levels and subcellular localization in vivo during the murine mammary gland development. Maspin was detected in late pregnancy, during lactation and involution. Maspin phosphorylation levels is higher during lactation than during involution. Interestingly, the percentage of cells which present nuclear maspin is higher in the involution than in lactation. These data show that the correlation between maspin phosphorylation and subcellular localization is also observed in vivo and these processes are regulated during murine mammary gland development.

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