Maspina, uma proteína supressora de tumor de 42 kDa, pertence à superfamília das serpinas (inibidores de serina protease), no entanto, seu mecanismo de ação independe da inibição de proteases. Maspina é expressa por epitélio de diferentes órgãos e apresenta regulação diferencial durante a progressão tumoral. Entre suas atividades biológicas, foram descritas a regulação da adesão celular, migração, morte, expressão gênica e resposta ao estresse oxidativo. A localização subcelular de maspina está relacionada a regulação de suas funções biológicas. Estudos clínicos recentes indicam que é a localização nuclear de maspina, ao invés de seus níveis de expressão, correlaciona-se com bons fatores prognósticos e sobrevida global em alguns tipos de câncer, incluindo câncer de mama. No entanto, pouco se sabe sobre como a localização subcelular de maspina é regulada. A maioria dos estudos sobre maspina é conduzido em linhagens de células tumorais, que apresentam uma grande variabilidade no contexto celular. Portanto, é importante usar uma linhagem celular não transformada para esta abordagem. Nesse trabalho investigamos fatores solúveis, interação célula-célula e interação célula-substrato como possíveis reguladores da localização de maspina na célula e as vias de sinalização envolvidas nesta regulação. Usando a linhagem celular epitelial mamária não transformada MCF10A como modelo, observamos por experimentos de imunofluorescência que o Fator de Crescimento Epidermal (EGF) promove a localização nuclear de maspina. EGF também altera a fosforilação da proteína conforme mostram nossos experimentos de 2D-SDS-PAGE e gel contendo Phostag. A fosforilação ocorre em resíduos de serina e a desfosforilação em resíduos de tirosina. À procura por vias de sinalização a jusante de do receptor de EGF envolvidas na regulação da localização subcelular de maspina, identificamos as vias de PI3K e Stat3 . Além disso, a adesão célula-célula parece bloquear a localização nuclear de maspina. Na tentativa de investigar funções celulares relacionadas à regulação de maspina por EGFR, identificamos proteínas que co-imunoprecipitam com maspina após o tratamento com EGF. O agrupamento funcional dessas proteínas sugere que a maspina pode estar envolvida em metabolismo de RNA, adesão celular e citoesqueleto. Desta forma, este trabalho identificou diferentes mecanismos que regulam a localização subcelular de maspina, que dependem da ativação das vias de PI3K e AKT pela via de EGFR. / Maspin, a 42 kDa tumor suppressor protein, belongs to the serpin (serine protease inhibitors) superfamily, however, its mechanism of action does not depend on protease inhibition. Maspin is expressed by epithelium of different organs and presents differential regulation during tumor progression. Among its biological activities, regulation of cell adhesion, migration, death, gene expression and oxidative stress response were described. Subcellular localization of maspin is related to the regulation of its biological functions. Recent clinical studies indicate that nuclear localization of maspin, not its expression levels, correlates with good prognostic factors and overall survival in some types of cancer, including breast cancer. However, little is known about how maspin subcellular localization is regulated. Most studies on maspin are conducted in tumor cell lines, which show great variability in cell context. Therefore, it is important to use a nontransformed cell line for this approach. Here we investigated soluble factors, cell-cell interaction and cell-substrate interaction as possible regulators of maspin subcellular localization and the signaling pathways involved. Using the MCF10A untransformed mammary epithelial cell line as a model system, we observed by immunofluorescence experiments that the Epidermal Growth Factor (EGF) promotes nuclear localization of maspin. EGF also alters the phosphorylation of the protein as observed by 2D-SDSPAGE and gel containing Phos-tag. Phosphorylation occurs on serine residues and dephosphorylation, on tyrosine residues. Looking for signaling pathways downstream of EGF receptor involved in regulation of maspin subcelular localization, we identified the PI3K and STAT3 pathways. On the other hand, cell-cell adhesion seems to block nuclear localization of maspin. In an attempt to investigate cellular functions related to regulation of maspin by EGFR, we identified proteins that co-immunoprecipitate with maspin in EGF-treated cells. The functional grouping of these proteins suggests that maspin may be involved with RNA metabolism, cell adhesion and cytoskeleton. Thus, this study identified different mechanisms that regulate subcellular localization of maspin, which depends on PI3K and STAT3 activation downstream of EGFR pathway.

Maspina (mammary serpin) foi identificada em 1994 como uma serpina (serine protease inhibitor) que apresenta atividade de supressão tumoral. Foi classificada como uma serpina devido à homologia na sequência de aminoácidos, porém, maspina não apresenta atividade de inibição de serina proteases. Entre os efeitos biológicos de maspina estão a modulação da adesão, a inibição do crescimento e a invasão tumoral, a inibição da angiogênese, o efeito pró-apoptótico e o controle da resposta ao stress oxidativo, propriedades que contribuem para supressão tumoral. Esta diversidade de funções se reflete nos inúmeros ligantes de maspina e na sua localização subcelular, já que é encontrada na membrana plasmática, no citoplasma, núcleo e mitocôndrias. A localização subcelular de maspina guarda importante relação com sua função, já que foi demonstrado que sua localização nuclear está correlacionada com bom prognóstico em diversos tumores e seu efeito supressor de tumor foi observado somente quando maspina está localizada no núcleo. Entre os ligantes de maspina estão a HDAC1, IRF6, GST, HSP90 e HSP70, β1 integrina, uPAR e colágeno tipo I e III. O mecanismo molecular envolvido na regulação dessas atividades não foi elucidado, e até o momento, somente um gene e uma proteína de maspina foram descritos, desta forma alterações pós-traducionais devem estar envolvidas na regulação dessas atividades. Com objetivo de verificar se há modificações pós-traducionais em maspina, utilizamos células MCF10A, que expressam grande quantidade dessa proteína, e submetemos seu extrato proteico à separação por gel bidimensional seguido de western blot. Identificamos quatro formas de maspina com a mesma massa molecular (42kDa), mas pontos isoelétricos distintos. Três destas formas são sensíveis ao tratamento com fosfatase ácida, o que sugere que estas sejam fosforiladas. Utilizamos ainda peroxidovanadato de sódio, um potente inibidor de tirosina fosfatase para investigar o papel da fosforilação de maspina em resíduos de tirosina. Através de western blot e imunofluorescência, observamos que o tratamento das células com o inibidor resultou no aumento dos níveis celulares de maspina assim como no seu acúmulo no citoplasma. Deste modo, concluímos que existem três diferentes fosfoformas de maspina em células MCF10A e ainda a inibição de tirosinas fosfatases aumentam os níveis de maspina e resultam no acúmulo da proteína no citoplasma. Esses resultados sugerem que a fosforilação pode estar envolvida na localização subcelular de maspina e na regulação dos seus níveis proteicos na célula. / Maspin (mammary serpin) was identified in 1994 as a serpin (serine protease inhibitor) which presents tumor suppressor activity. It was classified as a serpin due to its homology in amino acids sequence; however, maspin doesn\'t exhibit serine protease inhibition activity. Among maspin biological effects are modulation of cell adhesion, inhibition of tumor growth, invasion and angiogenesis, a pro-apoptotic effect and control of oxidative stress response, properties which contribute to tumor suppression. This functional diversity reflects maspin numerous ligands and its subcellular localization, since it is found on the plasma membrane, in the cytoplasm, nucleus and in mitochondria. Maspin subcellular localization is closely related to its function, as its nuclear localization correlates with good prognostic in several tumors and maspin tumor suppressor activity is only observed when it is located in the nucleus. Among maspin ligands are histone H1 deacetylase, IRF6, GST, HSP90 e HSP70, β1 integrin, uPAR and type I and III collagen. The molecular mechanisms involved in the regulation of maspin biological activities are poorly understood. So far, only one gene and one protein have been assigned to maspin, so posttranslational modification should be involved. In order to verify posttranslational modification in maspin, we utilized MCF10A cells, which express great amount of this protein, and we submitted its proteic extract to 2D-SDS-PAGE followed by western blot. We identified four maspin forms with the same molecular mass (42kDa), but different isoelectric point. Three of these forms are sensitive to acidic phosphatase treatment, suggesting that they are phosphorylated maspin forms. We also utilized sodium peroxovanadate, a potent tyrosine phosphatase inhibitor to investigate the role of maspin tyrosine phosphorylation. Through western blot and immunofluorescence analyses, we observed that cell treatment resulted in increase in maspin cellular levels as well as its cytoplasmic accumulation. Thus, we concluded that there are three diferente maspin phosphoforms in MCF10A cells and yet tyrosine phosphatase inhibition increases maspin levels and results in accumulation of the protein in the cytoplasm. These data suggest that phosphorylation may be involved in maspin subcellular localization and regulation of its protein levels in the cell.

Tesis por compendio de publicaciones / Melanoma is the most aggressive form of skin cancer and it is highly resistant to all current modalities of cancer therapy, including cytotoxic drugs as methotrexate (MTX), an antifolate widely used in clinical oncology against many cancer types. Recently, our lab discovered a new melanoma-specific mechanism of MTX resistance by which folate receptor α (FR-α)–mediated endocytotic transport of MTX facilitates melanosomal drug sequestration and cellular export in melanoma cells, thereby reducing the accumulation of MTX in intracellular compartments. That low MTX intracellular concentration is just able to induce cell growth arrest, but not cell death in melanoma cells. Particularly, we found that melanoma treatment with MTX induces cell cycle arrest without inducing apoptosis, activates melanin synthesis and melanosome biogenesis, and accelerates melanosomal export; but the cellular and molecular processes by which MTX mediates all these effects had not been elucidated. The Main Objective of the present PhD Thesis was the identification of the molecular basis of the cell cycle arrest, the activation of melanogenesis and the acceleration of melanosome transport induced by MTX treatment that, collectively, protect melanoma cells against MTX-induced apoptosis. The Secondary Objective, was the development of new therapeutic strategies combining MTX with drugs directed against molecular targets that are key components of the mechanisms of melanoma resistance to MTX. Regarding the Techniques and Instrumentation, we used several experimental models, including melanoma and non melanoma cell lines, an artificial skin melanoma model, and mice melanoma xenografts. We also employed a battery of cell biology techniques (viability, apoptosis and migration assays; electronic and optical microscopy; flow citometry; immunohistochemistry, immunofluorescence, etc.); biochemistry techniques (western blotting, protein immunoprecipitation, mass spectrometry, enzymatic activity determination by UV-VIS espectroscopy, etc.); molecular biology techniques (nucleic acid extraction, PCR, RT-qPCR, chromatin immunoprecipitation, etc.). The Results of the implementation of these techniques were subjected to the appropriate statistical tests and are summarized bellow. Since the ability of cells to delay cell cycle progression and halt DNA synthesis represents a defensive mechanism that spares potential toxicity, firstly we focused on deciphering the molecular basis of the MTX-induced cell cycle arrest. We identified the transcription factor E2F1 and the checkpoint kinase 1 (Chk1) as key mediators of this mechanism of resistance. The results indicated that MTX stimulated the transcriptional activity of E2F1 on the promoters of dihydrofolate reductase (DHFR) and thymidylate synthase (TS), which lead to an increase in the dTTP levels, instead of dTTP depletion as occurs in MTX-sensible cells. Since dTTP is an allosteric inhibitor of ribonucleotide reductase, which is necessary for the synthesis of all the dNTPs, dTTP excess induced DNA replication fork stress that activates the ATR/Chk1 DNA damage signaling pathway. Under these conditions, melanoma cells were protected from apoptosis by arresting their cell cycle in early S-phase. However, abrogation of this checkpoint by CHEK1 silencing or by UCN-01 (7-hydroxystaurosporine)-mediated Chk1 inhibition, rapidly triggered MTX-induced cell death, suggesting that inhibition of Chk1 in combination with this kind of antimetabolite chemotherapy is a viable therapeutic strategy to overcome melanoma resistance. Secondly, we focused on the study of the activation of melanogenesis observed after MTX treatment. Our results showed that Microphthalmia-associated transcription factor (MITF) that normally acts as a master regulator of melanocyte development, function and survival, is responsible for the activation of melanogenesis in melanoma after MTX treatment. In fact, MTX treatment increases the expression of this transcription factor which in turn induces the expression of melanocytic differentiation genes driving melanin production and melanosome biogenesis as tyrosinase (TYR). The increased TYR expression in response to MTX-mediated MITF activation provided an opportunity to design a two step strategy consisting in the combination of MTX with a prodrug that our group had previously designed to be activated by TYR. This prodrug is a compound called 3-O-(3,4,5-trimethoxybenzoyl)-(-)-epicatechin (TMECG) that inhibits the enzyme DHFR with high affinity. The combination of MTX and TMECG was able to induce depletion of thymidine pools, double-strand DNA breaks, and highly efficient E2F1-mediated apoptosis in vitro and in vivo. Recently, it has been recognized that MITF acts as a melanoma rheostat in determining tumor subpopulation identity. In melanomas, reduced MITF expression leads to G1 arrested, invasive cells with stem-like properties including the ability to initiate tumors with high efficiency. By contrast, elevated MITF leads to activation of differentiation genes. In between, intermediate levels of MITF allow the proliferation of melanoma cells. Consequently, tumors comprise a mix of MITF-positive and negative melanoma cells. Therefore, the increase of MITF expression by MTX treatment would drive heterogeneous populations of tumor cells to a differentiated and less invasive phenotype and, at the same time, would sensitize these differentiated cells to the TYR-processed prodrug TMECG in a cell-specific fashion. In a different approach, we explored the molecular basis of the activation of the transport of melanosomes observed after MTX treatment with the aim of designing a therapeutic strategy driven to block the MTX export within melanosomes. We identified a new MTX-activated molecular pathway involved in the export of melanosomes, in which the motor protein MyosinVa (MyoVa) plays a key role. Our results demonstrated that melanoma treatment with MTX leads to Akt2-dependent MyoVa phosphorylation, which enhances its ability to interact with melanosomes and accelerates their exportation. Due to these findings, we designed a combined therapy driven to block this MyoVa/Akt2 pathway. Because UCN-01 is also a potent inhibitor of PDK1, which activates Akt by phosphorylation, we hypothesized that the inhibition of this Akt2 phosphorylation by UCN-01 may result in the disruption of MTX stimulated melanosome transport. In fact, MTX/UCN-01 combined therapy prevented MTX export by blocking melanosome transport and was able to induce a highly efficient E2F1-mediated apoptosis in culture and in vivo. In summary, we observed that the combination of MTX and UCN-01 may represent a therapeutic option for the treatment of this evasive disease / El melanoma es el tipo de cáncer de piel más agresivo y muestra una alta resistencia frente a todas las terapias anticancerígenas disponibles en la actualidad, incluyendo agentes citotóxicos como el metotrexato (MTX), un antifolato ampliamente utilizado en oncología clínica. Recientemente, nuestro laboratorio ha descubierto un nuevo mecanismo de resistencia al MTX específico de las células de melanoma por el cual, la endocitosis de esta droga mediada por el receptor de fólico α (FR-α) conduce al secuestro del MTX en los melanosomas y a su expulsión al exterior celular, reduciendo así la acumulación de esta droga en los compartimentos intracelulares. Esta baja concentración de MTX en el interior celular es capaz únicamente de inducir un arresto del crecimiento, pero no de inducir la muerte de las células de melanoma. Por tanto, se sabía que el tratamiento con MTX es capaz de inducir arresto del ciclo celular sin inducir apoptosis, de activar la síntesis de melanina y la biogénesis de melanosomas, y de acelerar el transporte de melanosomas, pero los mecanismos celulares y moleculares por los cuales el MTX mediaba estos efectos era desconocido. El Objetivo Principal de esta Tesis Doctoral fue la identificación de las bases moleculares del arresto del ciclo celular, de la activación de la melanogénesis y de la aceleración del transporte melanosomal inducidos por el tratamiento con MTX que, en conjunto, protegen a las células de melanoma de la apoptosis inducida por el MTX. El Objetivo Secundario fue el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas combinando el MTX con agentes dirigidos frente a dianas moleculares clave en los mecanismos de resistencia. En cuanto a las Técnicas e Instrumentación, se emplearon como modelos experimentales varias líneas celulares de melanoma y de otros tipos de cáncer, un modelo de melanoma de piel artificial y un modelo de xenoinjerto de melanoma en ratón. Además, empleamos una batería de técnicas de biología celular (ensayos de viabilidad, apoptosis y migración; microscopía óptica y electrónica; inmunohistoquímica; inmunoflorescencia, etc.); técnicas de bioquímica (western blot, inmunoprecipitación de proteínas, espectrometría de masas, determinación de actividad enzimática mediante espectroscopía UV-VIS, etc.); técnicas de biología molecular (extracción de ácidos nucleicos, PCR, RT-qPCR, inmunoprecipitación de cromatina, etc.) Los Resultados de la implementación de las citadas técnicas fueron sometidos a las pruebas estadísticas apropiadas y se resumen a continuación: Dado que se ha descrito que la capacidad de las células de detener la síntesis de ADN constituye un mecanismo de defensa que evita posibles daños, en primer lugar nos centramos en descifrar las bases moleculares del arresto del ciclo celular inducido por el MTX. Así, identificamos al factor de transcripción E2F1 y a la quinasa Chk1 como mediadores de este mecanismo de resistencia. Nuestros resultados demostraron que el tratamiento con MTX estimulaba la actividad transcripcional de E2F1 sobre los promotores de los genes de la dihidrofolato reductasa (DHFR) y la timidilato sintasa (TS). Esto conducía a un incremento en los niveles de dTTP, en lugar de a una depleción de dTTP, como ocurre en células sensibles al MTX. Puesto que el dTTP es un inhibidor alostérico de la ribonucleótido reductasa que es necesaria para la síntesis de todos los dNTPs, este exceso de dTTP inducía un estrés en las horquillas de replicación capaz de activar la vía de señalización del daño al ADN mediada por ATR/Chk1. En estas condiciones, las células de melanoma evitan la apoptosis mediante el arresto de su ciclo celular al inicio de la fase S. Sin embargo, la eliminación de este checkpoint mediante el silenciamiento genético de CHEK1 o mediante la inhibición de esta quinasa con UCN-01 (7-hidroxistaurosporina) tras el tratamiento con MTX desencadena rápidamente la muerte celular, sugiriendo que la inhibición de Chk1 en combinación con este tipo de antimetabolitos es una estrategia terapéutica eficaz para vencer la resistencia del melanoma. En segundo lugar, nos centramos en el estudio de la activación de la melanogénesis por el MTX. Nuestros resultados demostraron que el factor de transcripción MITF (Microphthalmia-associated transcription factor) que, en melanocitos normales actúa como un regulador clave del desarrollo, función y supervivencia, era el responsable de la activación de la melanogénesis tras el tratamiento con MTX. De hecho, el MTX incrementa la expresión de este factor de transcripción el cual, a su vez, induce la expresión de genes implicados en la diferenciación melanocítica que conducen a la producción de melanina, como la enzima tirosinasa (TYR), y a la biogénesis de melanosomas. Este aumento en la expresión de TYR en respuesta a la activación de MITF mediada por MTX nos permitió diseñar una estrategia terapéutica basada en la combinación de MTX con una prodroga activada por TYR que había sido sintetizada previamente en nuestro laboratorio. Esta prodroga es el compuesto denominado 3-O-(3,4,5-trimetoxibenzoil)-(-)-epicatequina (TMECG), capaz de inhibir a la enzima DHFR con una alta afinidad. La combinación MTX/TMECG fue capaz de inducir el agotamiento de las reservas de timidina, roturas de doble cadena en el ADN y la apoptosis mediada por E2F1 con una alta eficacia, tanto in vitro como in vivo. Recientemente se ha descrito que MITF actúa como un reóstato en melanoma, determinando la identidad de las distintas subpoblaciones tumorales. Según este modelo, bajos niveles de MITF dan lugar a células arrestadas en G1, altamente invasivas con propiedades de célula madre, incluyendo una alta capacidad de iniciar tumores. Por el contrario, niveles elevados de MITF conducen a la activación de genes de diferenciación. Entre ambos, niveles intermedios de MITF permiten la proliferación de las células de melanoma. En consecuencia, los tumores suponen una mezcla de células con distintos niveles de MITF. Por tanto, el aumento de la expresión de MITF por el tratamiento con MTX conduciría a las poblaciones heterogéneas de células tumorales hacia un fenotipo común, diferenciado y menos invasivo, y, al mismo tiempo, sensibilizaría a estas células diferenciadas a una prodroga activada por TYR como el TMECG. En una aproximación diferente, estudiamos las bases moleculares de la activación del transporte de melanosomas inducida por el tratamiento con MTX. En este sentido, identificamos una nueva vía molecular implicada en la exportación de melanosomas en la que juega un papel esencial la proteína motora Miosina Va (MyoVa). Nuestros resultados demostraron que el tratamiento del melanoma con MTX conduce a una fosforilación de MyoVa mediada por Akt2 que incrementa la capacidad de esta proteína de interaccionar con los melanosomas y acelera su exportación. En vista de estos hallazgos, diseñamos una terapia combinada encaminada a bloquear la activación del transporte mediada por esta vía. Dado que se ha descrito que el UCN-01 es un potente inhibidor de PDK1, la cual activa a Akt por fosforilación, diseñamos una terapia de MTX combinado con UCN-01 para bloquear el transporte melanosomal. Efectivamente, la terapia combinada MTX/UCN-01 logró evitar la exportación de MTX mediante el bloqueo del transporte melanosomal y fue capaz de inducir la apoptosis mediada por E2F1 con una alta eficiencia tanto in vitro como in vivo.

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Este fato deve resultar em alterações metabólicas nas plantas e, por consequência, impactar o setor florestal brasileiro. Os cloroplastos são as organelas-chave na fixação do CO2 e início do particionamento do carbono nas plantas. Alterações na disponibilidade de CO2 podem afetar o metabolismo dessas organelas. O objetivo do presente trabalho foi avaliar se o cultivo de plantas jovens de Eucalyptus urograndis em ambiente enriquecido com CO2 resulta em alterações no proteoma cloroplastidial. Para tanto, primeiramente foram avaliados diferentes métodos de isolamento de cloroplastos quanto aos seguintes parâmetros: morfologia dos cloroplastos observada em microscopia de luz (1); rendimento protéico após isolamento plastidial (2); grau de contaminação por proteínas não cloropastidiais (3); e abundância em número de proteínas identificadas e já descritas como plastidiais (4). Após a definição da melhor metodologia para obtenção do proteoma cloroplastidial, mudas de Eucalyptus urograndis de aproximadamente três meses de idade foram cultivadas sob concentrações atmosféricas controladas de CO2 (400 e 1000 ppm) durante dez semanas. A avaliação do proteoma plastidial, por buscas restringentes contra um banco de dados de sequências protéicas de Eucalyptus grandis, resultou na identificação de 816 proteínas em E. urograndis, das quais 80% já haviam sido descritas como plastidiais. O mapeamento in silico de vias metabólicas resultou na identificação de todas as proteínas envolvidas no ciclo de Calvin-Benson, além da detecção de um aumento discreto, porém significativo na abundância de enzimas-chave: PGK, GAPDH, FBA, FBPase, SBPase e RPI. Embora a avaliação da eficiência quântica do fotossitema II tenha indicado ausência de alteração fotossintética, as plantas tratadas com 1000 ppm de CO2 apresentaram fechamento estomático em resposta à condição ambiental imposta, além da diminuição na área do tecido vascular foliar. Esta é a primeira caracterização do proteoma cloroplastidial do gênero Eucalyptus, cujos resultados indicam que a atmosfera enriquecida com CO2 causou respostas na espécie, incluindo um aumento na abundância de proteínas envolvidas na fixação de carbono. Os resultados apresentados aqui podem auxiliar na compreensão das respostas bioquímicas estimuladas por um aumento na concentração atmosférica de CO2 em plantas do tipo C3, além de contribuir para programas de melhoramento que visem obter plantas adaptadas às condições climáticas futuras. / Carbon dioxide (CO2) emissions from human activities have increased since the industrial revolution. Global projections indicate that there will be a significant increase in the atmospheric concentration of this gas in the coming years. This fact can result in metabolic changes in plants and, consequently, affect the Brazilian forest sector. Chloroplasts are key organelles in carbon fixation and early carbon partitioning in plants. Changes in the availability of CO2 may affect the metabolism of these organelles. The goal of the present study was to assess whether the cultivation of seedlings of Eucalyptus urograndis under a CO2 enriched environment could result in changes in the chloroplast proteome. For this purpose, different chloroplast isolation methods were evaluated to the following parameters: chloroplast morphology observed in bright-field microscopy (1); protein yield after plastid isolation (2); degree of contamination by non-plastidic proteins (3); and abundance in the number of identified proteins described as plastidic (4). After determining the best methodology for the isolation of the chloroplast proteome, E. urograndis seedlings about three months old were grown under CO2 controlled atmospheric concentrations (400 and 1000 ppm) for ten weeks. Evaluation of the plastid proteome, using stringent search against a protein sequence database from Eucalyptus grandis, resulted in the identification of 816 proteins in E. urograndis, from which 80% were already described as plastidic. In silico metabolic pathway mapping resulted in the identification of all proteins involved in the Calvin-Benson cycle and detection of a slight but significant increase in the abundance of key enzymes: PGK, GAPDH, FBA, FBPase, SBPase, and RPI. Although the assessment of the quantum efficiency of photosystem II suggested the absence of changes in the photosynthesis rate, plants treated with 1000 ppm of CO2 presented stomatal closure in response to the imposed environmental condition. A decreased area of the leaf vascular tissue was also detected in young leaves. This is the first characterization of chloroplast proteome of the genus Eucalyptus. Our results indicate that the CO2 enriched atmosphere stimulated metabolic responses, including an increase in the abundance of proteins involved in carbon fixation. Results showed here will assist on the understanding of the biochemical responses stimulated by an increase in the atmospheric CO2 concentration in C3-type plants, and contribute to breeding programs that aim to obtain plants adapted to future climate conditions. / FAPESP: 2014/07454-0

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:20:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TeseDMNJ.pdf: 1396596 bytes, checksum: c40f8c60cc5a4bb8964cfe0ce5adc332 (MD5) Previous issue date: 2004-12-07 / Universidade Federal de Minas Gerais / Down syndrome (DS) is the most common congenital disease occurring in approximately 1 out of 700 live births. In addition to the full HC21 trisomy, rare individuals with clinically recognized DS have only a partial trisomy, carrying a region common to all patients dubbed as Down Syndrome Critical Region (DSCR). Several genes contained in this portion of the HC21 are probably related to the DS phenotypes. In an attempt to characterize some of the DSCR genes, heterologous expression and subcellular localization analyses were performed for the genes DCRB (DSCR4), c21orf45, c21orf59, c21orf83-2, c21orf 95 and c21orf101. Analyses of the recombinant proteins produced in Escherichia coli showed that most of them remained in the insoluble fraction. DCRB was expressed as a soluble protein in E. coli Rosetta (DE3), purified and subjected to assays for secondary structure analyses. Also, deletion and site directed mutagenesis as well as the production of polyclonal antisera against DCRB were performed. Subcellular localization analyses revealed that the proteins DCRB, c21orf45, c21orf59 and c21orf83-2 were distributed in the cytoplasm of mammalian cells and that c21orf95 and c21orf101 resided in the nucleus. Considering the lack of information concerning these proteins encoded in the DSCR our results allowed a insight into some of the proteins provably involved in Down syndrome. / A Síndrome de Down (SD) é o distúrbio genético mais freqüente em humanos, sendo detectado em média um caso a cada 700 nascimentos. Esta anomalia é decorrente principalmente da trissomia total do cromossomo 21 porém, em alguns casos, ocorre a trissomia parcial deste cromossomo o que possibilitou a definição de uma região comum a todos os portadores denominada Região Crítica da Síndrome de Down (DSCR). Nesta região encontram-se vários genes que possivelmente estão relacionados às características fenotípicas apresentadas pelos indivíduos portadores. Entre eles estão os genes estudados neste trabalho: DCRB ou DSCR4 e as ORFS c21orf45, c21orf59, c21orf83-2, c21orf 95 e c21orf101. Com o objetivo de contribuir para os estudos realizados com genes localizados na DSCR foram realizadas a expressão heteróloga em E. coli e a localização subcelular das proteínas codificadas pelos genes descritos acima. Assim, os experimentos de expressão heteróloga em E. coli demonstraram que as proteínas expressas encontram-se na forma insolúvel para a maioria das condições testadas, entretanto foi possível a expressão de uma pequena fração solúvel da c21orf45, c21orf59 e da DCRB quando utilizou-se células da linhagem Rosetta (DE3) o que permitiu que a última proteína fosse purificada em condições nativas e que ensaios iniciais de estrutura secundária fossem realizados. Experimentos de deleção e mutação sítio dirigida também foram realizados com esta proteína assim como a produção de anticorpos policlonais. Estudos da localização subcelular revelaram que quatro das proteínas analisadas (DCRB, c21orf45, c21orf59 e c21orf83-2) são citoplasmáticas enquanto que duas (c21orf95 e c21orf101) são nucleares. Considerando a escassez de informações a respeito dos genes localizados na DSCR, esses resultados vem contribuir para o conhecimento das proteínas possivelmente envolvidas com a Síndrome de Down.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:21:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DissPAP.pdf: 4902893 bytes, checksum: 7182a23d47adb7621d018819e69efbfe (MD5) Previous issue date: 2003-10-17 / Down Syndrome (DS) is the major cause of mental retardation with a high incidence among human beings. Main features in DS include facial and dermatological features, congenital heart defects as well as immunological, gastrointestinal and endocrine abnormalities. Among a variety of cancer, a 20 fold increased risk of developing leukemia in younger people and an increased risk of testicular cancer is noticeable in DS patients. Most DS patients carry a complete trisomy of chromosome 21, but patients carrying a partial trisomy have also been observed. Analyses of partial trisomy of chromosome 21 have helped determining the minimal regions potentially associated with DS features. The DSCR2 gene located in the so-called Down Syndrome Critical Region 2 (DCR-2) codes a 32.8-kDa leucine-rich protein comprised of 34% hydrophobic amino acid residues. Little is known about the DSCR2 protein characteristics but many assumptions have been made according to in silico predictions. In this work, we used immunocytochemical and fluorescence assays to investigate the subcellular location of the protein encoded by the DSCR2 gene in transfected cells. It was previously suggested that DSCR2 was located in the plasma membrane as an integral protein. Interestingly, we observed this protein in the endoplasmic reticulum of cells. We also studied whether the location of DSCR2 truncated forms had different subcellular distribution and our observations indicate that it is probably not inserted in inner membranes once the fragments lacking the predicted transmembrane helices remained in the ER. We suggest that DSCR2 is located in the cytoplasmic side of endoplasmic reticulum by indirect interaction with the ER membrane or with another protein. / A Síndrome de Down (SD) é a aneuploidia mais freqüente e a principal causa de retardo mental na população humana. Os portadores apresentam, além das características faciais e dermatológicas típicas, cardiopatias e anomalias imunológicas, gastrointestinais e endócrinas. Há também um risco de desenvolvimento de leucemia 20 vezes maior que o normal em crianças portadoras da síndrome. Embora essa anomalia seja principalmente resultante da trissomia do cromossomo 21, há casos em que apenas uma região deste aparece em triplicata. Esses casos permitiram mapear uma região crítica comum a todos os portadores da síndrome. O gene DSCR2, localizado na Região Crítica da Síndrome de Down 2 (DCR-2), codifica uma proteína de 32,8 kDa rica em leucina e composta de uma alta porcentagem de resíduos hidrofóbicos. Experimentalmente, pouco se sabe sobre as características desta proteína, mas muitas possibilidades foram levantadas baseadas em sua seqüência de aminoácidos. Neste trabalho, foi estudada a localização subcelular da proteína DSCR2 em células de mamíferos. Estudos anteriores propuseram que a DSCR2 atuaria como uma proteína integral da membrana plasmática. Entretanto, em experimentos com células de mamíferos, nós observamos a proteína DSCR2 no retículo endoplasmático das células. Formas truncadas, construídas com o intuito de entender esta distribuição celular da DSCR2, apresentaram o mesmo padrão de fluorescência da proteína íntegra. Este resultado nos levou a concluir que esta proteína não está inserida na membrana do retículo endoplasmático, uma vez que a ausência dos domínios transmembranas preditos não alterou a sua distribuição subcelular. Desta forma, nós sugerimos que a DSCR2 se localiza associada ao retículo endoplasmático não como uma proteína integral de membrana, mas por algum tipo de interação indireta com a membrana ou com outras proteínas.

Orientador: Marcelo Menossi Teixeira / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-11T15:42:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Vicentini_Renato_D.pdf: 5901500 bytes, checksum: 7c8fe505e4c1675900f96c6643895d32 (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: As células de plantas são altamente organizadas e muitos processos biológicos estão associados com estruturas subcelulares específicas. A localização subcelular é uma característica chave das proteínas, visto que está relacionada com a função biológica. A determinação da localização subcelular usando a predição é uma estratégia altamente desejável, principalmente porque as abordagens experimentais demandam um tempo considerável. Com o objetivo de desenvolver um método para melhorar a predição de localização subcelular, diversos algoritmos foram integrados visando à exploração ótima do potencial de cada um. O desempenho com 90% de exatidão deste novo método foi claramente superior a todos os métodos utilizados em sua criação. Usando esta estratégia foi realizada a primeira análise em larga escala da localização subcelular do proteoma de cana-de-açúcar (com 11.882 proteínas preditas), sendo encontrado que a maioria das proteínas estão localizadas em quatro compartimentos: núcleo (44%), citoplasma (19%), mitocôndria (12%), e extracelular (11%). Adicionalmente foi observado que cerca de 19% das proteínas são localizadas em múltiplos compartimentos. Outros resultados foram capazes de identificar um conjunto de proteínas de cana-de-açúcar que podem apresentar duplo direcionamento pelo uso de variações na extremidade amino. Utilizando expressão transiente em células da epiderme de cebola, foi investigada a localização subcelular de 96 proteínas de cana com fusão a proteína GFP. As construções contendo fusão amino- e carboxi-terminal dos genes foram expressas, e a localização das proteínas de fusão foi detectada por microscopia de fluorescência. É relatado também a caracterização do gene ScBAK1, um receptor do tipo quinase com repetições ricas em leucina, que apresenta similaridade de seqüência com o gene brassinosteroid insensitive1-associated receptor kinase1. Foi mostrado que transcritos desse gene se acumulam em níveis muito mais altos nas células da bainha do feixe vascular do que nas células do mesófilo, e que a fusão ScBAK1-GFP é localizada na membrana plasmática. Essa distribuição espacial e esse padrão de expressão indicam que a ScBAK1 pode estar potencialmente envolvida em cascatas de sinalização celular intermediadas por altos níveis de açúcar na folha. Ainda considerando estudos de localização subcelular, é conhecido que seqüências de nucleotídeos que flanqueiam o códon de início da tradução afetam a eficiência traducional dos mRNA, e podem indicar a presença de sítios de inicio de tradução (TIS) alternativos. O multi-direcionamento pode ser um reflexo da variabilidade traducional destas outras formas da proteína. Neste estudo foi desenvolvido um método computacional para investigar o uso de TISs alternativos na síntese de novas variantes protéicas que podem apresentar localização subcelular diferente. Visando contribuir para o nosso entendimento da complexidade do genoma da cana-de-açúcar, foi empregada uma análise em larga escala dos TIS nesta espécie. Também é demonstrado que os transcritos com expressão induzida apresentam um forte TIS quando comparados com os reprimidos, e que os transcritos constitutivos possuem uma alta freqüência de TIS alternativos. O mesmo ocorre para os genes com altas taxas evolutivas, e transcritos específicos de folhas e entrenós, levantando a hipótese de que esses genes possam codificar diferentes polipeptídeos / Abstract: Plant cells are highly organized and many biological processes are associated with specialized subcellular structures. Subcellular localization is a key feature of proteins, since it is related to biological function. The determination of subcellular localization using computational prediction is a highly desirable strategy because experimental approaches are time-consuming. In order to develop a method for the enhanced prediction of subcellular localization, the outputs of some prediction tools were integrated so as to optimally exploit the potential of each one. The prediction performance (with 90%of accuracy) of this new method was clearly superior to all the methods used to create the predictor. Using this method, the first in silico genome-wide subcellular localization analysis was performed for sugarcane (with 11,882 predicted proteins). It was found that most of the proteins are localized to four compartments: nucleus (44%), cytosol (19%), mitochondria (12%), and secretory destination (11%). It is also shown that about 19%of the proteins are localized to multiple compartments, and that a potential set of sugarcane proteins can show dual targeting by use of N-truncated form of proteins. The subcellular localization of 96 sugarcane proteins fused with GFP were evaluated using transient expression in onion epidermal cells. Constructs containing the Nand C-terminal fusion of genes encoding both endogen and GFP proteins were transiently expressed, and the localization of the fusion proteins were detected by fluorescent microscopy. It was reported the characterization of ScBAK1, a sugarcane leucine-rich repeat receptor-like kinase, with sequence similarity to brassinosteroid insensitive1-associated receptor kinase1. We have found that ScBAK1 transcripts accumulated at higher levels in bundle-sheath than in mesophyll cells. ScBAK1-GFP fusions were localized to the plasma membrane. This spatial distribution and expression pattern indicates that ScBAK1 might be potentially involved in cellular signaling cascades mediated by high levels of sugar in this organ. The nucleotide sequence flanking the translation initiation codon affects the translational efficiency of eukaryotic mRNAs, and may indicate the presence of an alternative translation initiation site (TIS) to produce proteins with different properties. Multi-targeting may reflect the translational variability of these other protein forms. In this study it was also developed a computational method to investigate the usage of alternative TISs for the synthesis of new protein variants that might have different subcellular localization. To contribute to our understanding of the genome complexity of sugarcane, we undertook a genome wide TIS analysis in sugarcane data. It is demonstrated that up-regulated transcripts show a stronger TIS when compared with the down-regulated, and that ubiquitous transcripts have a high frequency of alternative TIS in the next downstream AUG codon. The same occurs for fast-evolving genes, and leaf and internodes specific transcripts, that may encode different polypeptides by N-terminal polymorphism / Doutorado / Genetica Vegetal e Melhoramento / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Maspina (mammary serpin) foi identificada em 1994 como uma serpina (serine protease inhibitor) que apresenta atividade de supressão tumoral. Foi classificada como uma serpina devido à homologia na sequência de aminoácidos, porém, maspina não apresenta atividade de inibição de serina proteases. Entre os efeitos biológicos de maspina estão a modulação da adesão, a inibição do crescimento e a invasão tumoral, a inibição da angiogênese, o efeito pró-apoptótico e o controle da resposta ao stress oxidativo, propriedades que contribuem para supressão tumoral. Esta diversidade de funções se reflete nos inúmeros ligantes de maspina e na sua localização subcelular, já que é encontrada na membrana plasmática, no citoplasma, núcleo e mitocôndrias. A localização subcelular de maspina guarda importante relação com sua função, já que foi demonstrado que sua localização nuclear está correlacionada com bom prognóstico em diversos tumores e seu efeito supressor de tumor foi observado somente quando maspina está localizada no núcleo. Entre os ligantes de maspina estão a HDAC1, IRF6, GST, HSP90 e HSP70, β1 integrina, uPAR e colágeno tipo I e III. O mecanismo molecular envolvido na regulação dessas atividades não foi elucidado, e até o momento, somente um gene e uma proteína de maspina foram descritos, desta forma alterações pós-traducionais devem estar envolvidas na regulação dessas atividades. Com objetivo de verificar se há modificações pós-traducionais em maspina, utilizamos células MCF10A, que expressam grande quantidade dessa proteína, e submetemos seu extrato proteico à separação por gel bidimensional seguido de western blot. Identificamos quatro formas de maspina com a mesma massa molecular (42kDa), mas pontos isoelétricos distintos. Três destas formas são sensíveis ao tratamento com fosfatase ácida, o que sugere que estas sejam fosforiladas. Utilizamos ainda peroxidovanadato de sódio, um potente inibidor de tirosina fosfatase para investigar o papel da fosforilação de maspina em resíduos de tirosina. Através de western blot e imunofluorescência, observamos que o tratamento das células com o inibidor resultou no aumento dos níveis celulares de maspina assim como no seu acúmulo no citoplasma. Deste modo, concluímos que existem três diferentes fosfoformas de maspina em células MCF10A e ainda a inibição de tirosinas fosfatases aumentam os níveis de maspina e resultam no acúmulo da proteína no citoplasma. Esses resultados sugerem que a fosforilação pode estar envolvida na localização subcelular de maspina e na regulação dos seus níveis proteicos na célula. / Maspin (mammary serpin) was identified in 1994 as a serpin (serine protease inhibitor) which presents tumor suppressor activity. It was classified as a serpin due to its homology in amino acids sequence; however, maspin doesn\'t exhibit serine protease inhibition activity. Among maspin biological effects are modulation of cell adhesion, inhibition of tumor growth, invasion and angiogenesis, a pro-apoptotic effect and control of oxidative stress response, properties which contribute to tumor suppression. This functional diversity reflects maspin numerous ligands and its subcellular localization, since it is found on the plasma membrane, in the cytoplasm, nucleus and in mitochondria. Maspin subcellular localization is closely related to its function, as its nuclear localization correlates with good prognostic in several tumors and maspin tumor suppressor activity is only observed when it is located in the nucleus. Among maspin ligands are histone H1 deacetylase, IRF6, GST, HSP90 e HSP70, β1 integrin, uPAR and type I and III collagen. The molecular mechanisms involved in the regulation of maspin biological activities are poorly understood. So far, only one gene and one protein have been assigned to maspin, so posttranslational modification should be involved. In order to verify posttranslational modification in maspin, we utilized MCF10A cells, which express great amount of this protein, and we submitted its proteic extract to 2D-SDS-PAGE followed by western blot. We identified four maspin forms with the same molecular mass (42kDa), but different isoelectric point. Three of these forms are sensitive to acidic phosphatase treatment, suggesting that they are phosphorylated maspin forms. We also utilized sodium peroxovanadate, a potent tyrosine phosphatase inhibitor to investigate the role of maspin tyrosine phosphorylation. Through western blot and immunofluorescence analyses, we observed that cell treatment resulted in increase in maspin cellular levels as well as its cytoplasmic accumulation. Thus, we concluded that there are three diferente maspin phosphoforms in MCF10A cells and yet tyrosine phosphatase inhibition increases maspin levels and results in accumulation of the protein in the cytoplasm. These data suggest that phosphorylation may be involved in maspin subcellular localization and regulation of its protein levels in the cell.

Orientador: Edi Lúcia Sartorato / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-23T15:12:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DeMoraes_VanessaCristineSousa_D.pdf: 4935241 bytes, checksum: ce8c385da6e3872d30f08426c629d34d (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: O alargamento do aqueduto vestibular (EVA) é uma malformação da orelha interna que pode ser identificado por tomografia computadorizada ou ressonância magnética. O EVA é um dos principais sinais clínicos da Síndrome de Pendred (PDS), uma doença genética com padrão de herança autossômico recessivo causada na maioria dos casos por mutações no gene SLC26A4. Além de EVA, o bócio e defeito na organificação do iodeto na tireóide são achados clínicos típicos da PDS. Por sua vez, mutações no gene SLC26A4 têm também sido observadas em indivíduos com surdez não sindrômica associada ao EVA. Recentemente os genes FOXI1 e KCNJ10 também foram implicados na PDS. O gene FOXI1 é um fator de transcrição do gene SLC26A4. Medições electrofisiológicas mostraram que a alteração da pendrina, proteína codificada pelo gene SLC26A4, em modelos animais levava indivíduos à surdez pela falta do potencial endococlear devido à perda de expressão de canais potássio. Sendo atribuído ao gene KCNJ10 a função de manutenção do potencial endococlear. Desta maneira, o presente estudo teve como objetivo avaliar a ocorrência de mutações nos genes SLC26A4, FOXI1 e KCNJ10 em 60 indivíduos brasileiros portadores de perda auditiva sensorioneural, associada ou não a alterações no aqueduto vestibular. Foram encontradas 14 diferentes alterações no gene SLC26A4, das quais 3 ainda não haviam sido descritas na literatura (P142L, G149R e C282Y) e 4 já haviam sido descritas, porém ainda não haviam sido caracterizadas funcionalmente (T193I, Q413R, L445W e R776C). Dessa forma, foi realizada a análise funcional e a co-localização celular da proteína Pendrina com estas 7 variações alélicas. Não foi encontrada nenhuma evidência de contribuição digênica relacionada ao gene FOXI1 e/ou KCNJ10, uma vez que nenhum paciente desta casuística com alteração no gene SLC26A4 apresentou mutações nesses genes. Além disso, no grupo composto por 30 indivíduos surdos que não apresentam EVA, ficou evidente que o rastreamento do gene SLC26A4 não foi suficiente para explicar a perda auditiva nesses pacientes, uma vez que foram encontradas apenas alterações em um alelo do gene. Por outro lado, no grupo formado por 30 indivíduos surdos que apresentam EVA, o rastreamento do gene SLC26A4 possibilitou o esclarecimento do diagnóstico etiológico da perda auditiva em 5 pacientes que apresentaram mutações nos dois alelos do gene SLC26A4 / Abstract: Enlargement of the vestibular aqueduct (EVA) is a malformation of the inner ear that can be identified by computed tomography or magnetic resonance imaging. EVA is the main feature of Pendred syndrome (PDS), a genetic disease with autosomal recessive inheritance pattern, in most cases caused by mutations in the SLC26A4 gene. Besides EVA, goiter and defective organification of iodide in the thyroid are other typical clinical signs of PDS. In turn, SLC26A4 gene mutations have been also observed in patients with non-syndromic deafness associated with EVA. Recently the genes FOXI1 and KCNJ10 were also implicated in the PDS. The FOXI1 gene is a transcription factor of SLC26A4 gene. Electrophysiological measurements in animal models showed that the mutated pendrin, the protein encoded by the SLC26A4 gene, led individuals to deafness by the lack of endocochlear potential due to loss of expression of potassium channels. Being assigned to the KCNJ10 gene the maintenance of endocochlear potential. Thus, the present study aimed to evaluate the occurrence of mutations in SLC26A4, and KCNJ10 FOXI1 genes in 60 Brazilian patients with sensorineural hearing loss, with or without changes in the vestibular aqueduct. We found 14 different mutations in SLC26A4 gene, of which 3 had not yet been described in the literature (P142L, G149R and C282Y) and 4 had already been described, but had not been characterized functionally yet (T193I, Q413R, L445W and R776C). Thus, we performed the functional analysis and cellular co-localization of Pendrin protein with these 7 allelic variants. We found no evidence of digenic contribution related to FOXI1 and/or KCNJ10 genes, since no patient in with mutations in SLC26A4 gene showed mutations in these genes. In addition, the screening of SLC26A4 gene in 30 deaf individuals with no EVA was not sufficient to explain the hearing loss in these patients, since mutations were found only in one allele of the gene. On the other hand, the screening of SLC26A4 gene in 30 deaf individuals with EVA allowed the elucidation of the etiology of hearing loss in 5 patients with mutations in both alleles of this gene / Doutorado / Genetica Animal e Evolução / Doutora em Genética e Biologia Molecular

Maspina é uma proteína supressora de tumor e metástase e sua localização subcelular está relacionada ao prognóstico do câncer de mama. Nosso grupo mostrou em MCF-10A que quando fosforilada maspina se acumula no citoplasma. Porém, esta correlação ainda não foi relatada in vivo. Aqui investigamos a expressão, fosforilação e localização subcelular de maspina ao longo do desenvolvimento da glândula mamária murina. Maspina foi detectada no estágio mais tardio da gestação, na lactação e na involução. Os níveis de fosforilação de maspina são maiores no período de lactação do que na involução. Interessantemente, a porcentagem de células que apresenta maspina no núcleo é maior na fase de involução do que na fase de lactação Estes dados mostram que a correlação entre níveis de fosforilação de maspina e localização subcelular também é observada in vivo e que esses processos são reguladas ao longo do desenvolvimento na glândula mamária murina. / Maspin is a protein with tumor and metastasis suppressing activity and its subcellular localization is related to breast cancer prognosis. Using MCF-10A cells as a model system, our group demonstrated a correlation between maspin phosphorylation and cytoplasmic accumulation. Here we investigated maspin expression, phosphorylation levels and subcellular localization in vivo during the murine mammary gland development. Maspin was detected in late pregnancy, during lactation and involution. Maspin phosphorylation levels is higher during lactation than during involution. Interestingly, the percentage of cells which present nuclear maspin is higher in the involution than in lactation. These data show that the correlation between maspin phosphorylation and subcellular localization is also observed in vivo and these processes are regulated during murine mammary gland development.