Abstract The heart adapts to hemodynamic overload with cardiac hypertrophy. Initially the increase in heart mass normalizes wall stress and permits normal cardiac function. In the long term pathological growth is associated with increased heart size, loss of functional myocytes and fibrotic replacement, heart dilatation and cardiac dysfunction, which can ultimately lead to heart failure. Vasoactive peptides participate in the regulation of cardiac contractility in an auto/paracrine way, but the peptidergic signaling pathways are largely unknown. The present study aimed to characterize the signaling mechanisms mediating the positive inotropic effect of endothelin-1 (ET-1) and the effects of prolactin releasing peptide (PrRP) on cardiac contractility in the isolated perfused rat heart preparation. The study demonstrated that mitogen-activated protein kinases (MAPK) have opposing roles in the regulation of cardiac contractility stimulated by ET-1. Extracellular signal-regulated kinase 1/2 (ERK1/2) mediated positive inotropic response to ET-1 was found to be counterbalanced by p38-MAPK. In addition, the effect of ET-1 was partly dependent on enhanced NADPH oxidase reactive oxygen species (ROS) generation, which activated the ERK1/2 pathway. In contrast, β-adrenergic inotropic effect was limited by stimulation of ROS production via negating phospholamban phosphorylation. The positive inotropic effect of ET-1 was counterbalanced by guanylyl cyclase (GC)-cGMP-protein kinase G (PKG) pathway and neuronal nitric oxide synthase (nNOS). PrRP was found to exert a direct positive inotropic effect which was independent of cAMP and was suppressed by concurrent activation of protein kinase Cα (PKCα) and protein phosphatase 1 (PP1), and dephosphorylation of phospholamban. In conclusion, in the present study signaling pathways in the acute regulation of cardiac contractility stimulated by ET-1 were characterized. The results suggest that the positive inotropic effect of ET-1 is mediated by ROS and ERK1/2 while p38-MAPK counterbalances the effect of ET-1. In addition, GC-cGMP-PKG pathway and nNOS modulate the response to ET-1. The study also established the previously unknown cardiac effects of PrRP. The findings provide a better understanding of molecular mechanisms involved in the regulation of cardiac contractility, and may indicate potential targets for novel therapeutic interventions. / Tiivistelmä Sydänlihaksen lisääntynyt mekaaninen kuormitus esimerkiksi verenpainetaudin tai sydäninfarktin yhteydessä voi johtaa sydämen kammion seinämän paksuuntumiseen eli hypertrofiaan. Hypertrofia auttaa sydäntä sopeutumaan lisääntyneeseen työmäärään, mutta se on myös sydän- ja verisuonitautitapahtumien riskitekijä. Pitkään jatkuva kuormitus johtaa usein sydämen pumppausvoiman heikkenemiseen ja sydämen vajaatoimintaan. Sydän tuottaa useita paikallisesti vaikuttavia vasoaktiivisia tekijöitä, jotka osallistuvat sydämen supistuvuuden säätelyyn. Väitöskirjatutkimuksessa tutkittiin signaalinvälitysjärjestelmiä, jotka osallistuvat endoteliini-1:n (ET-1) sydämen supistusvoimaa lisäävän eli positiivisen inotrooppisen vaikutuksen muodostumiseen sekä selvitettiin prolaktiinia vapauttavan peptidin (PrRP) vaikutuksia sydämen supistusvoimaan käyttämällä koemallina eristettyä, perfusoitua rotan sydäntä. Väitöskirjatyön tutkimustulokset osoittivat, että mitogeeni-aktivoituvat proteiinikinaasit (MAPK) ERK1/2 ja p38-MAPK osallistuvat ET-1:n inotrooppisen vaikutuksen säätelyyn. ERK1/2 välitti, ja p38-MAPK rajoitti ET-1:n lisäämää supistusvoiman kasvua. NADPH-oksidaasin tuottamat reaktiiviset happiradikaalit välittivät sydämessä ET-1:n inotrooppista vaikutusta ja ERK1/2 fosforylaatiota. Toisaalta NADPH-oksidaasin tuottamat happiradikaalit rajoittivat β-adrenergisen agonistin inotrooppista vaikutusta. Guanylaattisyklaasi (GC)-cGMP-proteiinikinaasi G (PKG) -järjestelmä ja neuronaalinen typpioksidisyntaasi (nNOS) vaimensivat ET-1:n lisäämää sydämen supistusvoiman kasvua. PrRP lisäsi sydämen inotropiaa syklisestä AMP:stä riippumattomalla tavalla, mutta vasteen säätelyyn havaittiin osallistuvan proteiinikinaasi C ja proteiinifosfataasi 1. Väitöskirjatutkimuksessa saatiin uutta tietoa solunsisäisistä viestinvälitysjärjestelmistä, jotka osallistuvat sydämen supistusvoimaan säätelyyn. Havaintojen perusteella ET-1:n positiivisen inotrooppisen vaikutuksen muodostumista välittävät reaktiiviset happiradikaalit ja ERK1/2, kun taas p38-MAPK rajoittaa vastetta. Lisäksi GC-cGMP-PKG -järjestelmä ja nNOS osallistuvat ET-1:n vaikutusten säätelyyn. Tutkimuksessa havaittiin myös, että PrRP vaikuttaa sydämen supistuvuuteen. Solutason mekanismien yksityiskohtien tunteminen voi mahdollistaa tulevaisuudessa sydän- ja verisuonisairauksien, kuten sydämen hypertrofian ja vajaatoiminnan, hoitomenetelmien tehostumisen ja mahdollisesti uudentyyppisten hoitomenetelmien kehittämisen.

Abstract Cardiovascular diseases are the leading causes of death in the developed countries and their incidence is not expected to decrease in the future. There is a lifetime risk of one in five of developing heart failure, which still has poor prognosis and current treatments only cover part of the pathophysiology behind this syndrome. Pathological processes contributing to heart failure include cardiac hypertrophy and remodeling, which involves neurohumoral activation, reactivation of fetal genes, impaired Ca2+ cycling, increased apoptosis, and increased fibrosis. Intracellular signalling pathways and transcription factors mediating the response to various extracellular stresses have a key role in the regulation of myocardial remodeling and they are investigated in order to develop new approaches for the treatment of heart failure. The aim of this thesis was to elucidate roles of mitogen-activated protein kinases (MAPKs) and transcription factor GATA-4 in the regulation of cardiomyocyte function in cell cultures, and in hearts ex vivo and in vivo. The main findings were that (i) Inhibition of p38α MAPK enhanced function of sarco/endoplasmic reticulum Ca2+ -ATPase and thus cardiac contractility by increasing phosphorylation of protein phosphatase inhibitor-1 and phospholamban, (ii) p38 MAPK isoforms p38α and p38β regulated promoter activity of B-type natriuretic peptide via distinct pathways, (iii) p38α and p38β MAPKs also had different effects on gene expressions related to fibrosis and hypertrophy, and (iv) p38 and ERK1/2 MAPKs mediated stretch-induced activation of GATA-4 by phosphorylation at Ser 105. GATA-4 also seems to be regulated by ubiquitination. This study provides novel data of p38 MAPK and GATA-4 in the regulation of cardiomyocyte function. Inhibition of p38α MAPK could be beneficial in the treatment of heart failure. Also GATA-4 is a potential target for treatment of cardiovascular diseases. / Tiivistelmä Sydän- ja verisuonisairaudet ovat yleisin kuolinsyy länsimaissa, eikä niiden ilmaantuvuus tule vähenemään lähitulevaisuudessa. Elinikäinen riski sairastua sydämen vajaatoimintaan on 20 %, ja sydämen vajaatoiminnan ennuste on edelleen huono. Nykyisillä hoitomuodoilla voidaan puuttua vain osittain sydämen vajaatoiminnan patofysiologisiin mekanismeihin. Sydämen vajaatoiminnan kehittymiseen liittyvät sydänlihaksen liikakasvu ja uudelleenmuovautumisprosessi, johon liittyy neurohumoraalinen aktivaatio, sikiöaikaisten geenien uudelleenilmentyminen, häiriöt solunsisäisessä Ca2+-viestinnässä sekä lisääntynyt ohjelmoitu solukuolema ja sidekudoksen muodostuminen sydämeen. Solunsisäisillä viestinvälitysketjuilla sekä transkriptiotekijöillä, jotka vastaavat solunulkoisten ärsykkeiden välittämisestä solun sisällä, on keskeinen rooli edellämainittujen prosessien säätelyssä. Uusien lähestymistapojen kehittäminen sydämen vajaatoiminnan hoitoon edellyttää myös solunsisäisen viestinvälityksen ja geenien säätelyn mekanismien selvittämistä. Tämän väitöstyön tavoite oli selvittää p38 mitogeeniaktivoituvan proteiinikinaasin (p38 MAPK) ja transkriptiotekijä GATA-4:n merkitystä sydämen vajaatoiminnan patogeneesissä soluviljelymalleissa. Päälöydöksiä olivat: (i) p38α MAPK -isoformin estäminen paransi kalsiumia solulimakalvostoon pumppaavan SERCA2a:n toimintaa ja sydänlihassolun supistumiskykyä lisäämällä fosfolambaanin ja proteiinifosfataasi-inhibiittori-1:n fosforylaatiota. (ii) p38 MAPK isoformit p38α ja p38β säätelivät B-tyypin natriureettisen peptidin geenin promoottorialuetta erillisten reittien kautta. (iii) p38α ja p38β isoformit vaikuttivat myös eri tavoin sydämen sidekudoksen muodostumiseen ja hypertrofiaan liittyvien geenien ilmentymiseen. (iv) p38 ja ERK1/2 välittävät venytyksen aiheuttaman GATA-4:n aktivaation fosforyloimalla seriini-105 fosforylaatiopaikan. Lisäksi GATA-4:n toimintaa säädellään ubiquitinaation avulla. Tämä tutkimus tuo uutta tietoa p38 MAPK:n ja GATA-4:n rooleista sydämen vajaatoiminnan kehittymisessä. p38α-isoformin toiminnan estäminen voisi olla hyödyllinen hoitomuoto sydämen vajaatoiminnassa. Myös GATA-4 on potentiaalinen lääkehoidon kohde sydänsairauksien hoidossa.