Les cotransporteurs K+-C1" (KCCs) sont exprimés en abondance dans le système nerveux où leur rôle est de maintenir les neurones hypoexcitables. Ds sont représentés par quatre isoformes dont les mécanismes de régulation et propriétés cinétiques diffèrent de façon appréciable. Nous avons récemment démontré que chacun des KCCs peut s'organiser en homooligomères ou hétérooligomères avec d'autres KCCs sans toutefois vérifier si certaines des associations observées menaient à des entités fonctionnelles et si oui, quel comportement elles engendraient. Dans ce travail, nous avons utilisé les ovocytes de xénopes pour caractériser les propriétés du cotransport K+-C1" quand un seul isoforme (KCC2 ou 4) est exprimé ou quand deux isoformes (KCC2 et 4) le sont et ce, après avoir prouvé que ces transporteurs pouvaient exister dans la même cellule neuronale de façon endogène. Nos résultats ont montré que les constantes cinétiques du transport différaient substantiellement entre les ovocytes exprimant KCC2/KCC4 et KCC2 seul, alors qu'elles différaient aussi entre les ovocytes exprimant KCC2/KCC4 et KCC4 seul mais de façon beaucoup moindre. Fait à noter, ces constantes étaient différentes de celles prédites sur la base d'une activité additive provenant de deux transporteurs indépendants et certaines de ces constantes, le coefficient de Hill entre autres, se sont révélées sensibles au Cl" intracellulaire (Cl'i). Ces résultats suggèrent que l'association KCC2-KCC4 dans les neurones mène à la formation d'une entité fonctionnelle avec des caractéristiques uniques et pourraient jouer un rôle intrinsèque dans le contrôle de l'excitabilité. Ils suggèrent aussi que les KCCs réagissent au Cl"; en changeant leur cinétique et que contrairement à la pensée populaire, ils fonctionnent avec deux sites de liaison pour le Cf.

L’hypertension artérielle affecte 40 % des Canadiens et Canadiennes âgés de 56 à 65 ans et correspond à un facteur de risque important pour le développement de maladies cardiovasculaires. Les causes de l’hypertension artérielle sont multifactorielles et le plus souvent difficiles à circonscrire. Elles incluent des facteurs génétiques, comme le dérèglement de certains systèmes de transport ionique dans le rein, et des facteurs environnementaux, comme l’ingestion excessive de sodium par la diète, l’abus d’alcool, la sédentarité, etc. La réabsorption du sodium filtré par le rein est effectuée par des protéines de transport spécialisées. Parmi celles-ci, le cotransporteur Na-K-Cl de type 2 (NKCC2), exprimé uniquement dans l’anse ascendante large de Henle (AAH) du néphron, assure la réabsorption d’environ 20 % du sodium. Ce transporteur est inhibé par les diurétiques de l’anse qui sont utilisés en clinique pour traiter certaines formes d’hypertension. Un changement de l’activité de cette protéine, soit intrinsèque ou lié à celui de certaines enzymes qui agissent sur NKCC2, a aussi été associé à des désordres de la pression artérielle. NKCC2 existe sous trois variants principaux qui sont produits par l’épissage alternatif de l’exon 4. Ces variants d’épissage, nommés NKCC2A, NKCC2B et NKCC2F, sont identiques les uns aux autres à l’exception du segment transmembranaire deux et de la boucle intracellulaire adjacente. Malgré tout, ils ont des caractéristiques, des localisations et des rôles différents le long de l’AAH. NKCC2 est impliqué dans la régulation du volume cellulaire puisqu’il est activé en condition de stress hypertonique. Cette activation serait médiée (du moins en partie) par certains isoformes des kinases with no lysine (WNK) dont WNK1 et WNK3. Toutefois, l’effet de ces kinases sur chaque isoforme n’est pas connu et les mécanismes provoquant l’activation du cotransporteur en réponse au stress hypertonique sont peu définis. Une meilleure connaissance à ce sujet nous permettrait de mieux comprendre comment NKCC2 est régulé et de savoir de quelle manière il pourrait être modulé pour en contrôler l’activité dans un but thérapeutique éventuel. Les objectifs de cette thèse étaient comme suit : 1) déterminer les mécanismes par lesquels les kinases WNK1 et WNK3 régulent chacun des variants de NKCC2 lors du stress hypertonique (chapitre 1) et 2) identifier les résidus de NKCC2 qui permettent la réponse au stress hypertonique et la régulation différentielle par les kinases WNK (chapitre 2). Le modèle des ovocytes de Xenopus laevis a été utilisé à cette fin. Dans le chapitre 1, nous avons montré que le stress hypertonique produisait son effet en augmentant l’abondance de NKCC2A et NKCC2B à la surface cellulaire et que cet effet était mimé par WNK3, mais pas par WNK1. De plus, nous avons montré que WNK3 augmentait le recyclage à la membrane des transporteurs endocytés alors que le stress hypertonique ne produisait pas cette réponse. Enfin, NKCC2F s’est révélé peu sensible au stress hypertonique et à WNK3, suggérant que des résidus lui étant uniques dans l’exon 4 contribuaient à cette réponse différentielle. Dans le chapitre 2, nous nous sommes intéressés aux rôles des résidus divergents entre les variants pour déterminer si l’exon 4 jouait un rôle dans les réponses observées. Par des études de mutagénèse dirigée, nous avons mis en évidence que les résidus en position 230 et 238 avaient un impact sur le trafic cellulaire de NKCC2. En outre, nous avons constaté que les résidus de NKCC2F à ces positions avaient pour effet de favoriser la rétention du transporteur à la membrane cellulaire. En somme, l’ensemble de ces travaux permettent de mieux comprendre les mécanismes de régulation du cotransporteur NKCC2 par le stress hypertonique et par la voie des kinases WNK. À la partie variable de NKCC2, l’exon 4, nous avons identifié un nouveau rôle qui est de participer à la régulation du trafic cellulaire du transporteur. Grâce à cette connaissance, nous saurons désormais que des stratégies d’intervention pour contrôler l’activité de NKCC2 pourraient miser sur la modification du nombre de transporteurs au site d’expression. / High blood pressure affects 40% of Canadians aged 56 to 65 and is a major risk factor for cardiovascular diseases. The causes of high blood pressure are multifactorial and are often difficult to circumscribe. They include genetic factors, such as abnormalities in the function of renal ion transporters, and environmental factors, such as excessive dietary sodium intake, alcohol abuse, sedentary lifestyle, etc. In the kidney, the ultrafiltered NaCl load is reabsorbed by specialized ion transport systems. Of these systems, the Na-K-Cl cotransporter type 2 (NKCC2), is confined to the thick ascending loop of Henle (TALH) of the nephron where it reabsorbs approximatively 20% of the ultrafiltered NaCl load. This transporter is inhibited by loop diuretics that are used clinically to treat certain types of hypertension. A change in the activity of NKCC2, either intrinsic or secondary to the effect of regulatory enzymes, has also been associated with blood pressure disorders. NKCC2 exists as three main variants that are produced through the alternative splicing of exon 4. These splice variants, named NKCC2A, NKCC2B, and NKCC2F, are identical to each other except for the residue composition of transmembrane segment 2 and the following connecting segment. Yet, they have different characteristics and roles along the TALH. NKCC2 is involved in cell volume regulation as it is activated by cell shrinkage. This activation is mediated (at least in part) by certain isoforms of the with no lysine (WNK) kinases including WNK1 and WNK3. However, the effect of these kinases on each of the splice variants is not known and the mechanisms that underlie the response to cell shrinkage are poorly defined. A better knowledge in these regards would allow us to better understand how NKCC2 is regulated and how it could be acted upon optimally towards maximal clinical benefits. The objectives of this thesis were as follows: 1) to determine the mechanisms by which WNK1 and WNK3 regulate each of the NKCC2 variant under hypertonic stress (Chapter 1) and 2) to identify residues in NKCC2 that sustain the response to cell shrinkage and differential regulation by the WNK kinases (chapter 2). The oocyte model of Xenopus laevis was used for this purpose. In Chapter 1, we showed that cell shrinkage produced its effect by increasing the abundance of NKCC2A and NKCC2B at the cell surface and that this effect was mimicked by WNK3, but not by WNK1. In addition, we showed that WNK3 increased membrane recycling of endocytosed transporters while cell shrinkage failed to produce such a response. Finally, NKCC2F was found to be insensitive to cell shrinkage and WNK3, suggesting that specific residues that are unique to this variant in exon 4 contributed to this differential response In Chapter 2, we looked at the roles of divergent residues between the variants to determine whether exon 4 played a role in the observed responses. Using mutagenic studies, we showed that residues at positions 230 and 238 played a major role in NKCC2 trafficking. In addition, we found that the residues of NKCC2F at these positions had the effect of promoting carrier retention at the cell membrane In sum, our findings have allowed us to better understand the mechanisms through which NKCC2 is regulated during cell shrinkage and by the WNK kinase-dependent pathway. Our findings have also allowed us to identify a new role for exon 4 in NKCC2 trafficking. With this gain of knowledge, we have found that strategies aimed at controlling the activity of NKCC2 could be based on altering the number of transporters at the cell surface.

Le présent mémoire propose l'élaboration d'une nouvelle méthodologie de synthèse de molécules ayant un potentiel diurétique, et ciblant plus particulièrement les cotransporteurs cations-chlorures, responsables du mouvement couplé des ions sodium et/ou potassium avec celui du chlorure dans plusieurs types de cellules dont celles des néphrons. La première partie est consacrée à une description de la chimie combinatoire, aux travaux antérieurs effectués dans notre laboratoire en chimie combinatoire sur support solide et à une introduction sur les sulfamides, les médicaments diurétiques et les transporteurs membranaires du rein. Le deuxième chapitre est consacré à la synthèse, à l'analyse et aux tests d'activité biologique effectués sur les molécules synthétisées. Le troisième chapitre traite de la synthèse et de la caractérisation de molécules de départ pouvant permettre la synthèse d'une gamme de produits au potentiel diurétique possédant des groupements fonctionnels encore plus diversifiés. Finalement, le quatrième et dernier chapitre traite de nos travaux effectués dans le but de synthétiser sur support solide des molécules au potentiel diurétique dans le but d'utiliser les énormes possibilités offertes par la chimie combinatoire et la synthèse rapide en parallèle. [Synthèse combinatoire ]