Les gangliosides représentent une classe de glycosphingolipides porteurs d’un ou plusieurs résidus d’acide sialique. Alors que les tissus sains adultes expriment principalement des gangliosides de la série-a, l’expression des gangliosides complexes des séries b- et c- est limitée au système nerveux central. Une augmentation d’expression de ces gangliosides complexes est cependant observée sous certaines conditions physiopathologiques, notamment dans les cancers d’origine neuro-ectodermique. Ainsi, le GD3 et le GD2 sont des marqueurs oncofœtaux du mélanome et du neuroblastome où ils favorisent la prolifération, la migration et la différenciation cellulaires, ainsi que l’angiogenèse. L’objectif de ma thèse a été de déterminer l’influence des gangliosides complexes dans la progression et l’agressivité du cancer du sein. A cet effet, nous avons établi un modèle dérivant des cellules de cancer du sein MDA-MB-231 qui expriment la GD3 synthétase. Ces cellules expriment des gangliosides des séries b- et c- à leur surface, principalement le GD2, et se caractérisent par une augmentation de la migration et des capacités de prolifération en absence de facteurs de croissance. Ce phénotype prolifératif a été confirmé in vivo par des expériences de xénogreffes chez des souris immunodéficientes. Nous avons pu démontrer que l’expression de la GD3 synthétase renforce l’agressivité des cellules MDA-MB-231 par un mécanisme d’activation spécifique du récepteur c-Met et des voies de signalisation cellulaire MEK/ERK et PI3K/Akt. Les derniers résultats indiquent que le disialoganglioside GD2 joue un rôle essentiel dans la spécificité d’activation du récepteur c-Met dans les cellules MDA-MB-231. / Gangliosides define a class of glycosphingolipids with one or more sialic acid residues. Whereas normal human tissues mainly express a-series gangliosides deriving from GM3, the expression of complex gangliosides from b- and c-series is limited to the central nervous system and developing tissues during embryogenesis. However, an increase of complex gangliosides expression is observed in several pathological conditions including neuro-ectoderm-derived cancers. Thus, GD3 and GD2 are oncofetal markers of melanoma and neuroblastoma where they promote tumor progression by mediating cell proliferation, migration, adhesion and angiogenesis. The goal of my thesis was to determine the effect of complex gangliosides on breast cancer progression and aggressiveness. For that propose, we have established a cellular model deriving from MDA-MB-231 breast cancer cells expressing the GD3 synthase. The GD3 synthase expression induces the accumulation of b- and c-series gangliosides (mainly GD2) at the cell surface together with an increased migration and the acquisition of a proliferative phenotype in absence of growth factors. GD3 synthase expression also induces an increased tumor growth of MDA-MB-231 cells in severe combined immunodeficiency mice. We have clearly demonstrated that GD3 synthase expression induces the specific and constitutive activation of c-Met receptor and subsequent activation of MEK/ERK and PI3K/Akt transduction pathways. Altogether, these results clearly demonstrate the involvement of the disialoganglioside GD2 in MDA-MB-231 cell proliferation via the constitutive activation of c-Met.

La GD3 synthétase (GD3S) est une enzyme capable de synthétiser le ganglioside GD3, contrôlant ainsi la biosynthèse des gangliosides des séries b et c. Ces gangliosides sont principalement exprimés au cours de l’embryogenèse, dans le cerveau adulte, ainsi que dans certaines tumeurs. En particulier, le GD3 et le GD2 sont des marqueurs du mélanome et du neuroblastome, où ils jouent un rôle clef dans la progression tumorale. Une surexpression du gène codant la GD3S a également été observée dans les tumeurs de sein négatives pour le récepteur aux œstrogènes (ER-). Afin de déterminer le rôle de la GD3S dans la progression du cancer du sein, un modèle de cellules de cancer du sein MDA-MB-231 surexprimant la GD3S a été créé au laboratoire. Ces cellules se caractérisent par une prolifération et une migration accrues, dues à l’activation du récepteur c-Met. Dans le cadre de ma thèse, nous avons d’abord montré que le ganglioside GD2 induisait spécifiquement l’activation de c-Met et la prolifération des cellules GD3S+. Ensuite, nous avons étudié les mécanismes moléculaires responsables de la surexpression de ST8SIA1 dans les tumeurs ER-. Nous avons caractérisé le promoteur core essentiel à la transcription de ST8SIA1 dans les cellules de cancer du sein et nous avons montré que l’œstradiol réprime à la fois l’expression des ARNm de la GD3S et le promoteur core uniquement dans les cellules de cancer du sein exprimant le récepteur ERα. Ces résultats suggèrent que la forte expression de ST8SIA1 dans les tumeurs de sein ER-, suite à la perte de signalisation par ERα, pourrait augmenter l’expression des gangliosides tels que le GD2, et ainsi contribuer à l’agressivité de ce sous-type de tumeur. / The GD3 synthase (GD3S) is an enzyme that synthesizes the ganglioside GD3 from GM3. It is therefore the key enzyme for the biosynthesis of b- and c-series gangliosides. Essentially expressed during embryogenesis and in the adult brain, the expression of these gangliosides increases in several diseases including neuro-ectoderm derived cancer. In particular, GD3 and GD2 are oncofetal markers in melanoma and neuroblastoma, where they play a key role in tumor progression. Clinical studies have also showed a high expression of GD3S in Estrogen Receptor negative (ER-) breast tumors. In order to determine the role of GD3S in breast cancer progression, we have previously induced GD3S over-expression in MDA-MB-231 breast cancer cell line. The resulting GD3S+ cells displayed an increased migration and proliferative phenotype that directly proceed from the constitutive activation of c-Met receptor. During my thesis, we first demonstrated that GD2 is directly involved in the constitutive activation of c-Met in absence of the ligand HGF/SF. Secondly, we have undertaken the study of the molecular mechanisms responsible for ST8SIA1 over-expression in ER- tumors. We characterized the core promoter, essential for ST8SIA1 transcription in breast cancer cells and we showed that estradiol represses both GD3S mRNA expression and the core promoter only in ERα expressing breast cancer cells. Altogether, these results suggest that high expression of GD3S in ER negative tumours, due to the loss of ERα signalling, could increase complex gangliosides such as GD2 at the cell surface, and possibly enhance the aggressiveness of this tumour subtype.

Les microorganismes ont développé une résistance accrue aux antibiotiques. Les aminoacyl-ARNt synthétases (aaRS) bactériennes sont essentielles pour la biosynthèse des protéines, car elles permettent de jumeler les acides aminés à leurs ARNt complémentaires. L’inhibition des aminoacyl-ARNt synthétases, telle que la glutamyl- ARNt synthétase (GluRS) dans cette étude, a été identifiée comme une stratégie valable dans la quête de nouveaux antibiotiques. Ainsi, afin de développer un antibiotique efficace et sans toxicité pour l’humain, l’écart évolutif entre les GluRS bactériennes et humaines orthologues a été évalué. Le design rationnel de nouveaux inhibiteurs pour une protéine spécifique se base sur plusieurs critères : les caractéristiques structurales du site actif, l’analogie avec des molécules reconnues pour interagir avec le site actif, le niveau de difficulté lors de la synthèse, conformité aux critères de similitudes aux drogues actives existantes, etc... La caractérisation du site actif permet d’identifier les acides aminés qui interagissent avec les inhibiteurs connus, ainsi que ceux qui pourraient potentiellement participer aux interactions avec un nouvel inhibiteur. Cette étape préliminaire permet déjà d’identifier les caractéristiques principales qui seront vitales pour le design de nouveaux inhibiteurs efficaces chez les enzymes bactériennes et inefficaces chez les enzymes orthologues humaines. Une nouvelle série d’inhibiteurs potentiels a donc été établie et testée in silico à l’aide de l’arrimage moléculaire. Cette approche computationnelle permet de prédire comment les molécules vont s’assembler, ainsi que d’identifier les facteurs qui déterminent la spécificité de l’interaction. Les avantages de cette approche sont multiples. Entre autres, une grande rapidité d’exécution et une faible ressource informatique permettent d’effectuer un criblage à haut débit de banques virtuelles de molécules. Les meilleurs candidats provenant du design rationel et aussi d’un criblage virtuel de plus de 48000 composés sont présentés.

Les aminoacyl-ARNt synthetases (aaRS) sont des enzymes clés dans le mécanisme de biosynthèse des protéines. Chacun des membres de cette famille d'enzymes reconnaît et lie les éléments d'identités propres à chaque acide ribonucléique de transfert (ARNt) permettant ainsi leur aminoacylation par un acide aminé spécifique. Une fois l'ARNt correctement chargé, celui-ci peut lier un facteur protéique (EF-Tu pour les aminoacyl-ARNt élongateurs) qui le conduit au ribosome pour la biosynthèse des protéines. Plus particulièrement la glutamyl-ARNt synthetase (GluRS) d'Escherichia coli est une protéine capable d'estérifier l'ARNtGIU par un résidu glutamate. Cette enzyme monomérique est subdivisée en 5 domaines structuraux, chacun capable de lier une portion de l'ARNt qui lui est propre. La région formant la boucle d'anticodon de l'ARNtG'u est reconnue par les domaines 4 et 5 séparés par une charnière, et situés en C-terminal de l'enzyme. L'étude d'une GluRS tronquée, délétée de son domaine 5, a montré l'importance de ce domaine sur l'activité catalytique de cette enzyme. Afin de comprendre les mécanismes mis en place entre ces deux derniers domaines lors de la liaison du substrat ARNtGly, des variants protéiques visant à altérer les interactions existant entre les domaines 4 et 5 et la charnière ont été synthétisés, et leur constantes catalytiques mesurées. L'étude du simple variant, substitué au niveau du second résidu chargé de la charnière de la GluRS de E. coli a montré l'importance de ce dernier dans les interactions mises en place entre le domaine 5 et la charnière. Par ailleurs l'altération des constantes cinétiques (en comparaison avec les valeurs trouvées pour l'enzyme sauvage), de double et triple variants, substitués au niveau des résidus chargés trouvés sur la charnière séparant les domaines 4 et 5, ont révélé l'importance de certain de ces résidus dans les interactions existant entre ces deux domaines.

L'enzyme glutamyl-queuosine-ARNt synthétase, présente chez plusieurs bactéries et codée par le gène yadB chez Escherichia coli, catalyse la formation de glutamylqueuosine- ARNtAsp. Le rôle de cet aminoacyl-ARNt est inconnu, mais la cotranscription de yadB et de dksA suggère une implication dans la réponse générale au stress. yadB a été remplacé dans une souche de Escherichia coli [delta]lac par lacZ, sans modification des éventuels éléments transcriptionnels de yadB. L'activité [béta]-galactosidase a été utilisée comme rapporteur pour déterminer le niveau d'expression de yadB dans diverses conditions de croissance et de stress. Les différences phénotypiques entre les souches sauvage et [delta]yadB ont été investiguées. Nous avons découvert que yadB est un gène non-essentiel chez Escherichia coli. Sa faible expression suggère un rôle dans le métabolisme basal de la cellule. Cette expression est sensiblement plus élevée pendant la phase stationnaire de croissance. Aucune différence phénotypique n'a été découverte entre les souches sauvage et [delta]yadB.

L'enzyme étudiée est la glutamyl-ARNt synthetase (GluRS) de la bactérie Escherichia coli. Son activité consiste principalement à charger l'acide glutamique sur l'ARNtGlu. Cette GluRS se compose de 5 domaines structuraux, dont les deux derniers (#4 et 5) situés dans la partie C-terminale ont été acquis durant l'évolution et sont responsables de la reconnaissance de la boucle de l'anticodon de l'ARNtGlu. Le domaine 4 est lié au domaine 5 par une charnière mobile (4-5) permettant à ce dernier de s'incliner et de s'adapter à l'anticodon de l'ARNtGlu (Nureki et al., 1995). Cette GluRS bactérienne, qui joue un rôle essentiel dans la biosynthèse des protéines, est considérée comme une nouvelle cible de l'antibiothérapie grâce à l'existence d'analogues du glutamyl-AMP qui inhibent plus des GluRS bactériennes que la GluRS cytopiasmique des mammifères (Balg et al., 2007). La première partie de ce projet consiste à étudier le rôle de la charnière 4-5 sur l'activité de la GluRS en produisant par mutagenèse dirigée du gène gltX de E. coli des variants E366A, E455R et D333A, altérés dans les résidus qui pourraient influencer les orientations relatives des domaines 4 et 5. Les propriétés cinétiques de ces variants dans la réaction de formation du glutamyl-ARNt montrent qu'il n'y a pas d'effet majeur de ces substitutions sur les Km sauf pour D333A. La constante de spécificité de l'enzyme sauvage reste plus grande que celle des variants ce qui suggère que la flexibilité de la charnière n'est pas grandement affectée par la substitution d'un seul de ces résidus. Accidentellement, un variant double charnière (#dc) a été obtenu dont le Km pour l'ARNtGlu est 7,7 fois plus grand que celui de la GluRS sauvage, et dont la constante de spécificité est 15 fois plus faible. Ce résultat suggère que la longueur de la charnière a peut-être autant d'influence que la nature de ces résidus pour le bon fonctionnement de la GluRS. La deuxième étape du projet est de tester l'hypothèse selon laquelle la flexibilité de la charnière 4-5 de la GluRS est importante pour l'activité catalytique de cette enzyme. Des formes tronquées de ces variants ne contenant que les 2 derniers domaines 4 et 5 ont été surproduites et purifiées pour la mesure de la flexibilité de la charnière 4-5 par résonance magnétique nucléaire (RMN). Une analyse préliminaire de la GluRS tronquée sauvage par RMN a montré qu'elle est bien repliée. Notre étude structure-fonction de la charnière 4-5 facilitera le design rationnel de nouveaux inhibiteurs plus efficaces de la GluRS. Ceux-ci pourraient être des composés de départ (« lead compounds ») pour la conception d'un nouvel antibiotique.

Le rôle des gangliosides complexes di- ou trisialylés (GD3, GD2, GT3) dans le développement des cancers d’origine neuro-ectodermique (mélanome, neuroblastome) a été clairement démontré. Ces gangliosides sont également surexprimés dans 50% des carcinomes mammaires canalaires infiltrants et l’expression de la GD3 synthétase (GD3S) contrôlant leur biosynthèse, est augmentée dans les tumeurs de sein ER-négatives, avec une diminution de la survie des patientes. Notre laboratoire a montré que l’expression de la GD3S dans les cellules cancéreuses de sein MDA-MB-231 induit une augmentation de la migration et de la prolifération en conditions de sevrage, liée à une activation constitutive du récepteur c-Met et des voies de signalisation intracellulaires Erk/MAPK et PI3K/Akt par le GD2. Nous avons développé un autre modèle cellulaire dérivant des cellules cancéreuses mammaires MCF-7 sur-exprimant la GD3S. Ces cellules accumulent principalement les gangliosides GD1b et GT3. Nous avons pu montrer une augmentation de la migration mais aucun effet sur la prolifération n’a été observé. L’analyse en spectrométrie de masse des glycosphingolipides a montré que les MCF-7 expriment des quantités élevées de globosides et de faibles quantités de gangliosides par rapport aux cellules MDA-MB-231. Dans les cellules MCF7 GD3S+, nous avons démontré que la GD3S était capable de synthétiser du GT3 à partir du GD3, mais également des gangliosides inhabituels tétra- et penta-sialylés. Nos résultats montrent que les cellules cancéreuses mammaires présentent des profils gangliosidiques différents et que la modification du phénotype cellulaire induite par l'expression de la GD3S dépend du type cellulaire. / The role of di- and trisialylated complex gangliosides (GD3, GD2 and GT3) in the development of neuro-ectoderm derived cancers (melanoma, neuroblastoma) has been clearly demonstrated. Complex gangliosides are also over-expressed in 50% of breast invasive ductal carcinomas and the expression of the GD3 synthase (GD3S) that controls their biosynthesis, is increased in ER-negatives breast cancer tumors, associated with a decreased overall survival of the patients. Our lab has previously demonstrated that GD3S expression in MDA-MB-231 breast cancer cells induced an increase of the cell migration and proliferation in serum-free conditions, associated to a constitutive GD2-dependent constitutive activation of c-Met receptor and Erk/MAPK et PI3K/Akt signaling pathways. We have developed another cellular model deriving from MCF-7 breast cancer cells, over-expressing the GD3S. These cells mainly express GD1b and GT3 gangliosides. We have shown the increased migration of MCF7 GD3S+, but no effect on the proliferation was observed. Mass spectrometry analysis of total glycosphingolipids has shown that MCF-7 cells express a high level of globosides and a low level of gangliosides compared to MDA-MB-231 cells. In MCF7 GD3S+ cells, we demonstrated that the GD3S was able to synthesize GT3 from GD3, but also other unusual tetra- and penta-sialylated gangliosides. Our results show that breast cancer cell lines express different gangliosidic profiles and that the modification of the cellular phenotype resulting from the expression of the GD3S is depending on the cell type.

Les prostaglandins (PGs) sont des régulateurs importants de la physiologie humaine et médient, entre autres, l'inflammation, diverses fonctions vasculaires ainsi que la reproduction. Elles sont également impliquées dans de multiples désordres gynécologiques. L'objectif principal de notre laboratoire est d'étudier l'implication des PGs en reproduction humaine. Pour ce faire, des lignées cellulaires immortalisées de l'endomètre humain ont été créées. Dans mon projet de recherche, j'ai caractérisé ces lignées et analysé les processus de biosynthèse des PGs dans les cellules d'endomètre humain. L'expression des enzymes de biosynthèse et des protéines a également été étudiée dans le tissu provenant de biopsies de femmes souffrant de ménorragies. Cela nous a permis d'observer l'expression des PGs synthases dans l'endomètre de femmes souffrant d'hyperménorrhées et de quantifier l'expression d'une nouvelle PGF synthase dans l'endomètre humain. Les résultats de ces travaux devraient faciliter la mise en place de nouvelles études en reproduction et permettre de mieux comprendre l'impact des PGs chez la femme.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.