京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(理学) / 甲第19921号 / 理博第4221号 / 新制||理||1606(附属図書館) / 33007 / 京都大学大学院理学研究科生物科学専攻 / (主査)教授 友永 雅己, 准教授 後藤 幸織, 教授 平井 啓久 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Science / Kyoto University / DFAM

Das Cyanobakterium Synechococcus elongatus PCC 7942 besitzt eine circadiane Uhr, die aus nur drei Proteinen besteht: KaiA, KaiB und KaiC. Durch 24stündige Phosphorylierungs- und ATPase-Zyklen des KaiC wird u. a. die globale Genaktivität gesteuert. Der Anteil circadian regulierter Gene sowie die Zahl und Organisation der kai-Gene scheinen in Cyanobakterien stark zu variieren. Um die Komponenten eines potenziell komplexeren Kai-Systems zu untersuchen, wurde in der vorliegenden Arbeit Synechocystis sp. PCC 6803 als Modell ausgewählt. In dessen Genom werden ein KaiA- sowie jeweils drei divergierte KaiB- und KaiC-Proteine kodiert. Durch in vitro Studien konnte die Aktivität von KaiC1 und KaiC3 erstmals charakterisiert werden: KaiC1 zeigte eine KaiA-abhängige Kinase-Aktivität und bildet mit KaiA und KaiB1 vermutlich einen „Standard-Oszillator“. KaiC3 wies die typischen Kinase-, ATP-Synthase- und ATPase-Aktivitäten des KaiC aus Synechococcus auf. Deren Ausprägung erschien jedoch modifiziert. Ferner wurde die zeitliche und räumliche intrazelluläre Verteilung des KaiA sowie der KaiC-Proteine aufgeklärt. Die Kai-Proteine verhielten sich insgesamt abweichend von den Homologen aus Synechococcus, was das Fehlen einer circadianen Rhythmik unter den gewählten Wachstumsbedingungen erklärt. Angesichts kontroverser Diskussionen über die molekularen Details der Assemblierung von KaiC und KaiB aus Synechococcus wurde in einem ergänzenden Projekt demonstriert, dass die gesteigerte Phosphorylierung des KaiC bei 4°C zur Bildung stabiler KaiC-KaiB-Komplexe führt. Die dabei etablierte Methode erlaubt Untersuchungen der KaiC-KaiB-Interaktion unter Verwendung der Wildtyp-Proteine. / The cyanobacterium Synechococcus elongatus PCC 7942 harbors a circadian clock consisting of only three proteins: KaiA, KaiB and KaiC. 24hour phosphorylation and ATPase cycles of KaiC control global gene activity. The number of circadian regulated genes as well as the number and organization of kai-genes seem to vary strongly among cyanobacteria. To analyze the components of a probably more complex Kai-system, Synechocystis sp. PCC 6803 was chosen as a model in the present study. Its genome encodes one KaiA- and each three KaiB and KaiC proteins. The activity of KaiC1 and KaiC3 was – for the first time - characterized by in vitro studies: KaiC1 displayed a KaiA-dependent kinase activity and builds a ,standard oscillator‘ together with KaiA and KaiB1. KaiC3 displayed the typical kinase, ATP synthase and ATPase activities of KaiC from Synechococcus. However, the characteristics of the activities appeared to be modified. Moreover, the temporal and spatial intracellular distribution of KaiA and the KaiC proteins was elucidated. Altogether, the Kai proteins performed different from their Synechococcus homologs, explaining the lack of circadian rhythms under the chosen growth conditions. In view of the controversial discussions about the assembly of KaiC and KaiB from Synechococcus, an additional project was set up to demonstrate that increased auto-phosphorylation of KaiC at 4 °C leads to the formation of stable KaiC-KaiB-complexes. In this context, a protocol was established that allows to analyse KaiC-KaiB interactions using wild-type proteins.