Thesis (M.Sc.) --University of Adelaide, Dept. of Biochemistry, 1961. / Typewritten.

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Thesis (Ph. D.)--University of Wisconsin--Madison, 1957. / Typescript. Vita. eContent provider-neutral record in process. Description based on print version record. Includes bibliographical references (leaves 48-51).

Orientadores: José Wilson Magalhães Bassani, Pedro Xavier de Oliveira / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Elétrica e de Computação / Made available in DSpace on 2018-08-21T21:15:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 FimNeto_Arnaldo_M.pdf: 1424780 bytes, checksum: 73cab0ac057a4075313d76ce8e26bbbf (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: O vaso dorsal de insetos tem sido proposto como um modelo mais simples para estudar o desempenho do coração em diferentes condições. O vaso dorsal apresenta características semelhantes às encontradas no coração de vertebrados (e.g. atividades cronotrópica e inotrópica dependentes do ambiente iônico e da ação de neurotransmissores), mas os mecanismos envolvidos na sua atividade inotrópica estão pouco explorados. Neste trabalho, desenvolvemos instrumentação e métodos com o objetivo de estudar aspectos da atividade inotrópica in situ do vaso dorsal do coleóptero T. molitor. Foram desenvolvidos dois métodos para estimar a redução do diâmetro luminal do vaso dorsal durante as contrações. Um foi baseado na detecção da "quantidade de luz" emitida por um conjunto de pixels de uma imagem de vídeo do centro do lúmen do vaso, e o outro, na medição do diâmetro do lúmen, como visto na imagem de vídeo. Os métodos se mostraram aplicáveis, mas o último foi menos sensível a variações das condições experimentais. O diâmetro diastólico luminal foi 148,70 ± 5,09 ?m, consistente com dados da literatura. Com a instrumentação desenvolvida, e a partir do controle da frequência de contrações por meio de estimulação elétrica, foi possível estudar o efeito de intervenções inotrópicas. A relação entre a redução de diâmetro (amplitude da contração) e frequência foi negativa (p< 0,05 na faixa de 1,0-2,5 Hz). A incubação do coração com cafeína, que tipicamente depleta a carga de Ca2+ do reticulo sarcoplasmático (RS), produziu um efeito inotrópico negativo, diminuindo a redução sistólica do diâmetro luminal de 56,32 ± 4,85 para 35,05 ± 3,86 % (n = 7, p< 0,05), o que sugere um papel funcional do RS na atividade inotrópica. O aumento da concentração externa de Ca2+ ([Ca2+]o) na faixa de 0,5 a 8,0 mM, durante estimulação elétrica a 1,5 Hz, aumentou significativamente a amplitude das contrações de 43,23 ± 2,51 para 66,60 ± 3,31% do diâmetro luminal (n=7, p< 0,05). Os resultados mostram que ambos [Ca2+]o e carga de Ca2+ do RS são fatores regulatórios importantes da atividade contrátil do vaso dorsal do T. molitor, além de afetar a atividade cronotrópica, como demonstrada previamente no nosso laboratório / Abstract: The dorsal vessel of insects has been proposed as a simplified model to study the performance of the heart. The dorsal vessel shares important features with the vertebrate heart (e.g. chronotropic and inotropic activities affected by the ionic environment and neurotransmitters), but the mechanisms involved in its inotropic activity are not clear yet. In this work, we developed instrumentation and methods aiming at studying the contractile activity of the in situ dorsal vessel of the coleopterum T. molitor. Two methods were developed to estimate the decrease in the dorsal vessel lumen during contractions. One was based on the detection of the "amount of light" emitted by a set of pixels at the center of the dorsal vessel video image, and the other, on the measurement of the luminal width in the dorsal vessel image. The methods were shown to be applicable, but the latter was less sensitive to variations in the experimental conditions. The measured diastolic diameter of the dorsal vessel was 148.70 ± 5.09 ?m, which was consistent with the values in the literature. With the developed instrumentation, and by controlling the beating rate by electrical stimulation, it was possible to study the effect of inotropic interventions. The relationship between contraction amplitude and stimulation rate was negative (p< 0.05 in the range of 1.0-2.5 Hz). Incubation of the heart with caffeine, which typically depletes the sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ load, produced a negative inotropic effect, decreasing the systolic reduction of luminal diameter from 56.32 ± 4.85 to 35.05 ± 3.86 % (n = 7, p< 0.05), which is suggestive of a functional participation of the SR in the inotropic activity. Increasing the extracellular Ca2+ concentration ([Ca2+]o) in the range of 0.5 - 8.0 mM during electrical stimulation at 1.5 Hz significantly increased contraction amplitude from 43.23 ± 2.51 to 66.60 ± 3.31% of the luminal diameter; (n=7, p< 0.05). The present results show that both [Ca2+]o and the SR Ca2+ load are important factors in the regulation of the contractile activity of the T. molitor dorsal vessel, in addition to their influence on the chronotropic activity, as previously observed in this laboratory / Mestrado / Engenharia Biomedica / Mestre em Engenharia Elétrica

Thesis (M.S.)--Ohio University, November, 2007. / Title from PDF t.p. Includes bibliographical references.

Thesis (Ph. D.)--Ohio State University, 2003. / Title from first page of PDF file. Document formatted into pages; contains xii, 137 p.; also includes graphics. Includes abstract and vita. Advisors: Jerry F. Downhower and Peter W. Pappas, Dept. of Evolution, Ecology, and Organismal Biology. Includes bibliographical references (p. 128-137).

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Les insectes comestibles tels que le ver de farine (Tenebrio molitor) constituent une source protéique émergente en Occident en prévision des défis de sécurité alimentaire reliés à l’augmentation de la population. Le défi majeur étant l’acceptabilité, un des leviers pour contrer cette problématique est d’incorporer les insectes, matrice riche en protéines, sous forme d’ingrédients (concentrés ou isolats protéiques) à des matrices alimentaires complexes faisant déjà partie intégrante des habitudes de consommation. Toutefois, les connaissances sur ce type de protéines non conventionnelles restent à développer. À titre d’exemple, bien que la production de concentrés protéiques d’insectes comestibles comporte certaines étapes clés telles que la délipidation, il n’existe toujours aucune méthode d’extraction officielle. Malgré que diverses méthodes de délipidation aient été étudiées, l’extraction des lipides de la matrice d’insectes par l’hexane est à ce jour la méthode la plus utilisée. Toutefois, son effet sur la modification du profil des protéines et de leurs propriétés fonctionnelles est actuellement inconnu. Par conséquent, l’objectif du mémoire de maîtrise vise à évaluer l’effet d’une délipidation à l’hexane sur le profil protéique du ver de farine, sa solubilité et son pouvoir moussant. Les résultats ont montré que l’étape de délipidation permettait d’augmenter la teneur protéique des ingrédients d’insectes. Ils ont aussi montré que les profils protéiques des ingrédients bruts (non délipidés) et délipidés étaient similaires, peu importe le traitement appliqué. Cependant, certaines différences spécifiques (e.x. hexamerine 2) entre les protéines majeures des différents extraits ont été identifiées. De plus, il a été observé que l’étape d’extraction des lipides diminuait la solubilité des protéines des extraits près du point isoélectrique et augmentait drastiquement le pouvoir moussant des ingrédients. Par conséquent, la délipidation à l’hexane intégrée dans le processus de production d’ingrédients de T. molitor semble essentielle afin d’augmenter leur teneur protéique et d’améliorer certaines de leurs fonctionnalités. / There is a growing interest in the use of insects such as mealworms (Tenebrio molitor) as an alternative protein source in many Western countries in anticipation of the food security challenges related to the worldwide population growth. Nevertheless, food neophobia represents the major challenge which negatively affects the social acceptability of this alternative food resource. It was suggested that the integration of edible insects as food ingredients (protein concentrate or isolate) in different food formulations could enhance the consumer acceptability. However, the knowledge surrounding this unconventional protein source is scarce. For instance, while the defatting process of edible insects represents the first step to produce protein ingredients, there is still no official defatting method. Multiple defatting methods have been explored in the literature. The most efficient method for lipid removal from the solid insect matrix remains conventional solvent extraction with hexane. However, its impact on protein profiles and techno-functionality is still unclear. Consequently, the aims of this work were to compare the protein profile of hexane-defatted and non-hexane-defatted T. molitor meals and protein extracts and to evaluate hexane’s impact on protein solubility and foaming properties. Results showed that hexane-defatting of T. molitor meal increased the total protein content of the insect ingredients. Profiles for major proteins were similar between hexane-defatted and non-defatted samples. However, some specific differences (e.g. hexamerin 2) were observed and characterized by proteomic tools. The defatting step reduced the solubility of T. molitor protein extracts near the isoelectric point, and drastically increased the foaming capacity of the hexane-defatted fractions. Consequently, we conclude that the hexane-defatting step is essential to produce high-value added T. molitor ingredients with increased protein content and improved functionality.

No lúmen do intestino médio da larva de Tenebrio molitor existem 4 &#946;-glicosidases (denominadas 1, 2, 3a e 3b), que não estão presentes na comida do animal. Elas foram purificadas usando-se técnicas de eletroforese e cromatografias de troca iônica e interação hidrofóbica. A &#946;-Glicosidase 1 (Mr 59.000) é instável a 30°C mas é estabilizada na presença do substrato. Ela praticamente não tem atividade sobre galactosídeos e cliva di- e oligossacarídeos. A enzima possui apenas 1 sítio ativo que apresenta 4 subsítios para ligação de glicose. Seu papel fisiológico deve ser o da clivagem de oligo- e principalmente dissacarídeos. A &#946;-Glicosidase 2 (Mr 67.000) é muito instável a 30°C e hidrolisar com maior eficiência galactosídeos sintéticos, cliva muito mal lactose e é incapaz de clivar glucosídeos. Ela apresenta dois sítios ativos sendo que um deles cliva MU&#946;Dgal e lactose, que é ativado por Triton X-100, enquanto o outro não é ativado pelo detergente e hidrolisa NP&#946;Dgal e NP&#946;Dfuc. O papel fisiológico para esta enzima não está claro, mas imagina-se que ela esteja envolvida na digestão de galcatolipídeos. As &#946;-Glicosidases 3a e 3b (Mr 59.000) parecem ser isoformas, uma vez que elas têm parâmetros cinéticos semelhantes, perfis de eluição, de peptídeos gerados por clivagem proteolítica, em HPLC idênticos e a mesma seqüência de aminoácidos para um peptídeo interno comum. Um anticorpo específico produzido contra a &#946;-Glicosidase 3a reconhece a &#946;-Glicosidase 3b, mas não reconhece as &#946;-Glicosidases 1 e 2. Dois clones foram obtidos usando esse anticorpo para selecionar uma biblioteca de cDNA obtida dos rnRNAs do intestino médio de Tenebrio molitor. O resultado final mostrou um cDNA de 1.570 pb codificando para uma proteína madura de 485 aminoácidos. As proteínas codificadas pelos dois cDNAs têm somente 4 aminoácidos de diferentes e podem corresponder às &#946;-Glicosidases 3a e 3b. As seqüências mostraram uma alta similaridade com proteínas da família 1 de glicosídeo hidrolases e codificam todos os peptídeos seqüenciados a partir da clivagem das &#946;-Glicosidases 3a e 3b purificadas. Através de imunocitolocalização usando o anticorpo que reconhece as &#946;-Glicosidases 3a e 3b, foi mostrado que essas são secretadas na parte posterior do intestino médio por uma via exocítica. Essas enzimas tem quatro subsítios para a ligação da glicose e podem hidrolisar di- e oligossacarídeos, alquil glicosídeos e glicosídeos tóxicos de plantas. Experimentos de competição entre substratos, mostraram que elas têm só um sítio ativo responsável para a hidrólise de todos os substratos. Seu papel deve ser principalmente a digestão intermediária de hemiceluloses e celulose. / In the midgut lumen of Tenebrio molitor larvae there are 4 &#946;-glycosidases (named 1, 2, 3a and 3b), not present in the animal food. They were purified with electrophoresis, ion exchange and hydrophobic chromatographies. &#946;-glycosidase 1 (relative molecular weight - Mr 59,000) is unstable at 30°C but is stabilized by substrates. The enzyme hydrolyses di- and oligoglucosides and has a residual activity against galactosides. It has 4 subsites for glucose binding in the active site and its physiological role is the hydrolysis of oligo- and mainly disaccharides. &#946;-glycosidase 2 (Mr 67,000) is unstable at 30°C and hydrolyses efficiently only synthetic galactosides, has poor activity against lactose and is unable to use glucosides as substrates. This enzyme has two active sites. One of them is activated by Triton X-100 and hydrolyses MU&#946;Dgal. The other active site is not activated by the detergent and act upon NP&#946;Dgal and NP&#946;Dfuc. The physiological role ofthis enzyme may be the digestion of galactolipids. The &#946;-glycosidases 3a and 3b (Mr 59,000) are likely isoforms, since they have similar kinetic parameters, identical HPLC peptide elution patterns after proteolytic cleavage and the same amino acid sequence of an internal peptide. A specific antibody raised against &#946;-glycosidase 3a recognizes &#946;-glycosidase 3b, but not &#946;-glycosidase 1 and 2. Two clones were obtained screening a cDNA library, trom Tenebrio molitor midgut mRNA, with this antibody. The final result showed a cDNA of 1,570 pb coding for 485 amino acids in mature protein. The protein sequences showed high similarity with family 1 glycoside hydrolases and have the same amino acid sequence determined for peptides obtained after proteolytic hydrolysis of &#946;-glycosidase 3a and 3b. The immunocytolocalization with this antibody showed that &#946;-glycosidase 3a and 3b are secreted by exocytosis of small vesicles present in posterior midgut. These enzymes have four subsites for glucose binding and can hydrolyse di- and oligosaccharides, alkyl glucosides and toxic plant glucosides. Substrate competition experiments showed that they have only one active site responsible for the hydrolysis of all substrates. Their role may be mainly the intermediate digestion of hemicelluloses and cellulose.

No lúmen do intestino médio da larva de Tenebrio molitor existem 4 &#946;-glicosidases (denominadas 1, 2, 3a e 3b), que não estão presentes na comida do animal. Elas foram purificadas usando-se técnicas de eletroforese e cromatografias de troca iônica e interação hidrofóbica. A &#946;-Glicosidase 1 (Mr 59.000) é instável a 30°C mas é estabilizada na presença do substrato. Ela praticamente não tem atividade sobre galactosídeos e cliva di- e oligossacarídeos. A enzima possui apenas 1 sítio ativo que apresenta 4 subsítios para ligação de glicose. Seu papel fisiológico deve ser o da clivagem de oligo- e principalmente dissacarídeos. A &#946;-Glicosidase 2 (Mr 67.000) é muito instável a 30°C e hidrolisar com maior eficiência galactosídeos sintéticos, cliva muito mal lactose e é incapaz de clivar glucosídeos. Ela apresenta dois sítios ativos sendo que um deles cliva MU&#946;Dgal e lactose, que é ativado por Triton X-100, enquanto o outro não é ativado pelo detergente e hidrolisa NP&#946;Dgal e NP&#946;Dfuc. O papel fisiológico para esta enzima não está claro, mas imagina-se que ela esteja envolvida na digestão de galcatolipídeos. As &#946;-Glicosidases 3a e 3b (Mr 59.000) parecem ser isoformas, uma vez que elas têm parâmetros cinéticos semelhantes, perfis de eluição, de peptídeos gerados por clivagem proteolítica, em HPLC idênticos e a mesma seqüência de aminoácidos para um peptídeo interno comum. Um anticorpo específico produzido contra a &#946;-Glicosidase 3a reconhece a &#946;-Glicosidase 3b, mas não reconhece as &#946;-Glicosidases 1 e 2. Dois clones foram obtidos usando esse anticorpo para selecionar uma biblioteca de cDNA obtida dos rnRNAs do intestino médio de Tenebrio molitor. O resultado final mostrou um cDNA de 1.570 pb codificando para uma proteína madura de 485 aminoácidos. As proteínas codificadas pelos dois cDNAs têm somente 4 aminoácidos de diferentes e podem corresponder às &#946;-Glicosidases 3a e 3b. As seqüências mostraram uma alta similaridade com proteínas da família 1 de glicosídeo hidrolases e codificam todos os peptídeos seqüenciados a partir da clivagem das &#946;-Glicosidases 3a e 3b purificadas. Através de imunocitolocalização usando o anticorpo que reconhece as &#946;-Glicosidases 3a e 3b, foi mostrado que essas são secretadas na parte posterior do intestino médio por uma via exocítica. Essas enzimas tem quatro subsítios para a ligação da glicose e podem hidrolisar di- e oligossacarídeos, alquil glicosídeos e glicosídeos tóxicos de plantas. Experimentos de competição entre substratos, mostraram que elas têm só um sítio ativo responsável para a hidrólise de todos os substratos. Seu papel deve ser principalmente a digestão intermediária de hemiceluloses e celulose. / In the midgut lumen of Tenebrio molitor larvae there are 4 &#946;-glycosidases (named 1, 2, 3a and 3b), not present in the animal food. They were purified with electrophoresis, ion exchange and hydrophobic chromatographies. &#946;-glycosidase 1 (relative molecular weight - Mr 59,000) is unstable at 30°C but is stabilized by substrates. The enzyme hydrolyses di- and oligoglucosides and has a residual activity against galactosides. It has 4 subsites for glucose binding in the active site and its physiological role is the hydrolysis of oligo- and mainly disaccharides. &#946;-glycosidase 2 (Mr 67,000) is unstable at 30°C and hydrolyses efficiently only synthetic galactosides, has poor activity against lactose and is unable to use glucosides as substrates. This enzyme has two active sites. One of them is activated by Triton X-100 and hydrolyses MU&#946;Dgal. The other active site is not activated by the detergent and act upon NP&#946;Dgal and NP&#946;Dfuc. The physiological role ofthis enzyme may be the digestion of galactolipids. The &#946;-glycosidases 3a and 3b (Mr 59,000) are likely isoforms, since they have similar kinetic parameters, identical HPLC peptide elution patterns after proteolytic cleavage and the same amino acid sequence of an internal peptide. A specific antibody raised against &#946;-glycosidase 3a recognizes &#946;-glycosidase 3b, but not &#946;-glycosidase 1 and 2. Two clones were obtained screening a cDNA library, trom Tenebrio molitor midgut mRNA, with this antibody. The final result showed a cDNA of 1,570 pb coding for 485 amino acids in mature protein. The protein sequences showed high similarity with family 1 glycoside hydrolases and have the same amino acid sequence determined for peptides obtained after proteolytic hydrolysis of &#946;-glycosidase 3a and 3b. The immunocytolocalization with this antibody showed that &#946;-glycosidase 3a and 3b are secreted by exocytosis of small vesicles present in posterior midgut. These enzymes have four subsites for glucose binding and can hydrolyse di- and oligosaccharides, alkyl glucosides and toxic plant glucosides. Substrate competition experiments showed that they have only one active site responsible for the hydrolysis of all substrates. Their role may be mainly the intermediate digestion of hemicelluloses and cellulose.