A talidomida foi sintetizada em 1954 na Alemanha Ocidental e comercializada em todo o mundo como um sedativo seguro, porém com o aumento da incidência de crianças nascidas com defeitos congênitos, em especial defeitos de redução de membros (DRM) no início dos anos de 1960 foi estabelecida sua teratogênese. Estima-se que 20-50% de todos os bebês expostos a talidomida nasceram afetados por sua embriopatia, somando cerca de 10 mil crianças ao redor do mundo. A maioria dos indivíduos com embriopatia talidomídica (TE) foi avaliada apenas ao nascimento e não se reconhece qual a história natural desta condição. Além disso, os mecanismos moleculares de sua teratogênese nunca foram totalmente elucidados. Pesquisas em animais experimentais sugerem que tal mecanismo pode estar associado à propriedade anti-angiogênica da talidomida. O objetivo desse trabalho foi realizar uma avaliação exploratória da saúde física e psicológica dos indivíduos com TE, a fim de fornecer um melhor entendimento da etiologia da embriopatia, uma vez que não é sabido se a talidomida pode causar efeitos tardios, tais como o agravamento ou antecipação de algumas doenças. Além disso, uma análise de polimorfismos funcionais de genes da via de angiogênese foi realizada nesses sujeitos buscando esclarecer mecanismos fisiopatológicos desta condição. Através de um questionário clínico aplicado a vinte e oito indivíduos com TE, nascidos entre 1959 e 2010, foram avaliadas as anomalias congênitas dos mesmos. Os defeitos de membros foram as anomalias mais frequentemente identificadas (96%), seguidas anomalias em olhos (25%) e orelhas (14%). Vinte e três desses indivíduos responderam a um questionário sobre seu histórico e saúde atual. Todos eram adultos, com idades entre 19 e 55 anos. Quando comparados os dados obtidos com taxas de prevalência da população brasileira, sem anomalias congênitas, identificou-se que esses indivíduos apresentam uma alta prevalência de doenças crônicas (p=0,001), em especial distúrbios psiquiátricos (p=0,011). Uma sugestão de desenvolvimento precoce de doenças cardiovasculares também foi identificada nos casos de TE (p=0,009). Surdez progressiva e perda dentária na adolescência também foram relatadas. Novas análises devem ser realizadas a fim de buscar esclarecer se tais condições podem ter sido causadas ou agravadas pela exposição embrionária a talidomida. Para a avaliação de variantes de possível susceptibilidade genética a TE, foram selecionados dez polimorfismos funcionais em genes que parecem ter sua expressão alterada após a exposição à talidomida (de acordo com estudos experimentais): três no gene NOS2 (rs2779249, rs3833912 e rs2297518), três em PTGS2 (rs689465, rs689466 e rs20417) e quatro em VEGFA (rs699947, rs1570360, rs2010963 e rs3025039). Tais polimorfismos foram genotipados através de PCR em tempo real e PCR convencional em 38 indivíduos com TE e 136 brasileiros sem anomalias congênitas. Não foram identificados alelos ou genótipos de proteção ou de risco para TE nos polimorfismos em NOS2, PTGS2 e VEGFA nos indivíduos avaliados. Adicionalmente, três polimorfismos em NOS3 também foram analisados: duas variantes funcionais (rs2070744 e rs1799983) já anteriormente relacionadas com a TE e o polimorfismo rs61722009, de variação de número de repetições (VNTR). A frequência da variante rs2070744 nos indivíduos com a embriopatia quando comparados ao grupo controle, sem anomalias congênitas, foi estatisticamente diferente (p=0,022). Além disso, foi demonstrada uma interação entre o SNP rs2070744 e o VNTR rs61722009 que corroborou os resultados anteriores e sugeriu que os indivíduos com TE possuem, em maior frequência, alelos que reduzem a expressão de NOS3 a partir de mecanismos de regulação pré-transcricional. Esse achado pode ser de grande contribuição para os estudos da etiologia da TE. As análises e resultados obtidos nesse estudo podem contribuir para complementação dos ensaios em modelos experimentais que vem sido realizados com a talidomida, e esclarecer aspectos moleculares da teratogênese dessa embriopatia. / Thalidomide was synthesized in 1954 in Western Germany and marketed around the world as a safe sedative, although with the increased incidence of children born with congenital anomalies, especially limb reduction defects (LRD) in the beginning of the 1960s, its teratogenesis was established. It is estimated that 20-50% of all babies exposed to thalidomide were born affected by its embryopathy, counting 10 thousand children around the world. The majority of individuals with thalidomide embryopathy (TE) were evaluated only at birth and the natural history of this condition is not known. Besided, the molecular mechanisms of its teratogenesis were never completely elucidated. Researches in animal models suggest that such mechanism may be associated to thalidomide’s antiangiogenic property. The objective of this study was to perform an exploratory evaluation of physical and psychological health in individuals with TE, in order to provide a better understanding of the embryopathy’s etiology, once it is not known if thalidomide may cause late effects, such as aggravation or anticipation of some diseases. Besides, an evaluation of functional polymorphisms in genes of angiogenesis pathway was performed in these subjects looking for a comprehension of phisiopathological mechanisms of this condition. Through a clinical questionnaire applied to twenty-eight individuals with TE, born between 1959 and 2010, their congenital anomalies were evaluated. Limb defects were the anomalies most frequently identified (96%), followed by eyes (25%) and ears (14%). Twenty-three of these individuals answered a questionnaire about their history and current health. All were adults, with ages ranging between 19 and 55 years. When compared the data obtained with prevalence rates in Brazilian population, without congenital anomalies, it was identified that these individuals present a high prevalence of chronic diseases (p=0.001), especially psychological disorders (p=0.011). A suggestion of early development of cardiovascular diseases was also identified in TE cases (p=0.009). Progressive deafness and dental loss in teenage years were also reported. New analysis must be performed in order to clarify if such conditions may have been caused or aggravated by thalidomide’s embryonary exposure. To evaluate variants of possible genetic susceptibility to TE, it was selected ten functional polymorphisms in genes that seem to have their expression altered after thalidomide’s exposure (according to experimental studies): three in NOS2 gene (rs2779249, rs3833912 and rs2297518), three in PTGS2 (rs689465, rs689466 and rs20417) and four in VEGFA (rs699947, rs1570360, rs2010963 and rs3025039). Such polymorphisms were genotyped through conventional PCR or real-time PCR in 38 individuals with TE and 136 Brazilian without congenital anomalies. It was not identified risk or protective alleles or genotypes to TE in the polymorphisms of NOS2, PTGS2 and VEGFA in the individuals evaluated. Additionally, three polymorphisms in NOS3 were also analyzed: two functional variants (rs2070744 and rs1799983) previously related with TE and the polymorphism rs61722009, of variable number of repeats (VNTR). The frequencies of the variant rs2070744 in the individuals with the embryopathy when compared to control group, without congenital anomalies, was statistically different (p=0.022). Besides, it was demonstrated an interaction between the SNP rs2070744 and the VNTR rs61722009 that corroborated the previous results and suggested that the individuals with TE have, in higher frequency, alleles that reduce the NOS3 expression through pre-transcriptional regulation mechanisms. This finding can be of great contribution to the studies of TE etiology. The analysis and obtained results of this study may complement the assays with animal models and thalidomide that are currently being evaluated, and clarify molecular aspects of the teratogenesis of this embryopathy.

A talidomida foi sintetizada em 1954 na Alemanha Ocidental e comercializada em todo o mundo como um sedativo seguro, porém com o aumento da incidência de crianças nascidas com defeitos congênitos, em especial defeitos de redução de membros (DRM) no início dos anos de 1960 foi estabelecida sua teratogênese. Estima-se que 20-50% de todos os bebês expostos a talidomida nasceram afetados por sua embriopatia, somando cerca de 10 mil crianças ao redor do mundo. A maioria dos indivíduos com embriopatia talidomídica (TE) foi avaliada apenas ao nascimento e não se reconhece qual a história natural desta condição. Além disso, os mecanismos moleculares de sua teratogênese nunca foram totalmente elucidados. Pesquisas em animais experimentais sugerem que tal mecanismo pode estar associado à propriedade anti-angiogênica da talidomida. O objetivo desse trabalho foi realizar uma avaliação exploratória da saúde física e psicológica dos indivíduos com TE, a fim de fornecer um melhor entendimento da etiologia da embriopatia, uma vez que não é sabido se a talidomida pode causar efeitos tardios, tais como o agravamento ou antecipação de algumas doenças. Além disso, uma análise de polimorfismos funcionais de genes da via de angiogênese foi realizada nesses sujeitos buscando esclarecer mecanismos fisiopatológicos desta condição. Através de um questionário clínico aplicado a vinte e oito indivíduos com TE, nascidos entre 1959 e 2010, foram avaliadas as anomalias congênitas dos mesmos. Os defeitos de membros foram as anomalias mais frequentemente identificadas (96%), seguidas anomalias em olhos (25%) e orelhas (14%). Vinte e três desses indivíduos responderam a um questionário sobre seu histórico e saúde atual. Todos eram adultos, com idades entre 19 e 55 anos. Quando comparados os dados obtidos com taxas de prevalência da população brasileira, sem anomalias congênitas, identificou-se que esses indivíduos apresentam uma alta prevalência de doenças crônicas (p=0,001), em especial distúrbios psiquiátricos (p=0,011). Uma sugestão de desenvolvimento precoce de doenças cardiovasculares também foi identificada nos casos de TE (p=0,009). Surdez progressiva e perda dentária na adolescência também foram relatadas. Novas análises devem ser realizadas a fim de buscar esclarecer se tais condições podem ter sido causadas ou agravadas pela exposição embrionária a talidomida. Para a avaliação de variantes de possível susceptibilidade genética a TE, foram selecionados dez polimorfismos funcionais em genes que parecem ter sua expressão alterada após a exposição à talidomida (de acordo com estudos experimentais): três no gene NOS2 (rs2779249, rs3833912 e rs2297518), três em PTGS2 (rs689465, rs689466 e rs20417) e quatro em VEGFA (rs699947, rs1570360, rs2010963 e rs3025039). Tais polimorfismos foram genotipados através de PCR em tempo real e PCR convencional em 38 indivíduos com TE e 136 brasileiros sem anomalias congênitas. Não foram identificados alelos ou genótipos de proteção ou de risco para TE nos polimorfismos em NOS2, PTGS2 e VEGFA nos indivíduos avaliados. Adicionalmente, três polimorfismos em NOS3 também foram analisados: duas variantes funcionais (rs2070744 e rs1799983) já anteriormente relacionadas com a TE e o polimorfismo rs61722009, de variação de número de repetições (VNTR). A frequência da variante rs2070744 nos indivíduos com a embriopatia quando comparados ao grupo controle, sem anomalias congênitas, foi estatisticamente diferente (p=0,022). Além disso, foi demonstrada uma interação entre o SNP rs2070744 e o VNTR rs61722009 que corroborou os resultados anteriores e sugeriu que os indivíduos com TE possuem, em maior frequência, alelos que reduzem a expressão de NOS3 a partir de mecanismos de regulação pré-transcricional. Esse achado pode ser de grande contribuição para os estudos da etiologia da TE. As análises e resultados obtidos nesse estudo podem contribuir para complementação dos ensaios em modelos experimentais que vem sido realizados com a talidomida, e esclarecer aspectos moleculares da teratogênese dessa embriopatia. / Thalidomide was synthesized in 1954 in Western Germany and marketed around the world as a safe sedative, although with the increased incidence of children born with congenital anomalies, especially limb reduction defects (LRD) in the beginning of the 1960s, its teratogenesis was established. It is estimated that 20-50% of all babies exposed to thalidomide were born affected by its embryopathy, counting 10 thousand children around the world. The majority of individuals with thalidomide embryopathy (TE) were evaluated only at birth and the natural history of this condition is not known. Besided, the molecular mechanisms of its teratogenesis were never completely elucidated. Researches in animal models suggest that such mechanism may be associated to thalidomide’s antiangiogenic property. The objective of this study was to perform an exploratory evaluation of physical and psychological health in individuals with TE, in order to provide a better understanding of the embryopathy’s etiology, once it is not known if thalidomide may cause late effects, such as aggravation or anticipation of some diseases. Besides, an evaluation of functional polymorphisms in genes of angiogenesis pathway was performed in these subjects looking for a comprehension of phisiopathological mechanisms of this condition. Through a clinical questionnaire applied to twenty-eight individuals with TE, born between 1959 and 2010, their congenital anomalies were evaluated. Limb defects were the anomalies most frequently identified (96%), followed by eyes (25%) and ears (14%). Twenty-three of these individuals answered a questionnaire about their history and current health. All were adults, with ages ranging between 19 and 55 years. When compared the data obtained with prevalence rates in Brazilian population, without congenital anomalies, it was identified that these individuals present a high prevalence of chronic diseases (p=0.001), especially psychological disorders (p=0.011). A suggestion of early development of cardiovascular diseases was also identified in TE cases (p=0.009). Progressive deafness and dental loss in teenage years were also reported. New analysis must be performed in order to clarify if such conditions may have been caused or aggravated by thalidomide’s embryonary exposure. To evaluate variants of possible genetic susceptibility to TE, it was selected ten functional polymorphisms in genes that seem to have their expression altered after thalidomide’s exposure (according to experimental studies): three in NOS2 gene (rs2779249, rs3833912 and rs2297518), three in PTGS2 (rs689465, rs689466 and rs20417) and four in VEGFA (rs699947, rs1570360, rs2010963 and rs3025039). Such polymorphisms were genotyped through conventional PCR or real-time PCR in 38 individuals with TE and 136 Brazilian without congenital anomalies. It was not identified risk or protective alleles or genotypes to TE in the polymorphisms of NOS2, PTGS2 and VEGFA in the individuals evaluated. Additionally, three polymorphisms in NOS3 were also analyzed: two functional variants (rs2070744 and rs1799983) previously related with TE and the polymorphism rs61722009, of variable number of repeats (VNTR). The frequencies of the variant rs2070744 in the individuals with the embryopathy when compared to control group, without congenital anomalies, was statistically different (p=0.022). Besides, it was demonstrated an interaction between the SNP rs2070744 and the VNTR rs61722009 that corroborated the previous results and suggested that the individuals with TE have, in higher frequency, alleles that reduce the NOS3 expression through pre-transcriptional regulation mechanisms. This finding can be of great contribution to the studies of TE etiology. The analysis and obtained results of this study may complement the assays with animal models and thalidomide that are currently being evaluated, and clarify molecular aspects of the teratogenesis of this embryopathy.

A talidomida foi sintetizada em 1954 na Alemanha Ocidental e comercializada em todo o mundo como um sedativo seguro, porém com o aumento da incidência de crianças nascidas com defeitos congênitos, em especial defeitos de redução de membros (DRM) no início dos anos de 1960 foi estabelecida sua teratogênese. Estima-se que 20-50% de todos os bebês expostos a talidomida nasceram afetados por sua embriopatia, somando cerca de 10 mil crianças ao redor do mundo. A maioria dos indivíduos com embriopatia talidomídica (TE) foi avaliada apenas ao nascimento e não se reconhece qual a história natural desta condição. Além disso, os mecanismos moleculares de sua teratogênese nunca foram totalmente elucidados. Pesquisas em animais experimentais sugerem que tal mecanismo pode estar associado à propriedade anti-angiogênica da talidomida. O objetivo desse trabalho foi realizar uma avaliação exploratória da saúde física e psicológica dos indivíduos com TE, a fim de fornecer um melhor entendimento da etiologia da embriopatia, uma vez que não é sabido se a talidomida pode causar efeitos tardios, tais como o agravamento ou antecipação de algumas doenças. Além disso, uma análise de polimorfismos funcionais de genes da via de angiogênese foi realizada nesses sujeitos buscando esclarecer mecanismos fisiopatológicos desta condição. Através de um questionário clínico aplicado a vinte e oito indivíduos com TE, nascidos entre 1959 e 2010, foram avaliadas as anomalias congênitas dos mesmos. Os defeitos de membros foram as anomalias mais frequentemente identificadas (96%), seguidas anomalias em olhos (25%) e orelhas (14%). Vinte e três desses indivíduos responderam a um questionário sobre seu histórico e saúde atual. Todos eram adultos, com idades entre 19 e 55 anos. Quando comparados os dados obtidos com taxas de prevalência da população brasileira, sem anomalias congênitas, identificou-se que esses indivíduos apresentam uma alta prevalência de doenças crônicas (p=0,001), em especial distúrbios psiquiátricos (p=0,011). Uma sugestão de desenvolvimento precoce de doenças cardiovasculares também foi identificada nos casos de TE (p=0,009). Surdez progressiva e perda dentária na adolescência também foram relatadas. Novas análises devem ser realizadas a fim de buscar esclarecer se tais condições podem ter sido causadas ou agravadas pela exposição embrionária a talidomida. Para a avaliação de variantes de possível susceptibilidade genética a TE, foram selecionados dez polimorfismos funcionais em genes que parecem ter sua expressão alterada após a exposição à talidomida (de acordo com estudos experimentais): três no gene NOS2 (rs2779249, rs3833912 e rs2297518), três em PTGS2 (rs689465, rs689466 e rs20417) e quatro em VEGFA (rs699947, rs1570360, rs2010963 e rs3025039). Tais polimorfismos foram genotipados através de PCR em tempo real e PCR convencional em 38 indivíduos com TE e 136 brasileiros sem anomalias congênitas. Não foram identificados alelos ou genótipos de proteção ou de risco para TE nos polimorfismos em NOS2, PTGS2 e VEGFA nos indivíduos avaliados. Adicionalmente, três polimorfismos em NOS3 também foram analisados: duas variantes funcionais (rs2070744 e rs1799983) já anteriormente relacionadas com a TE e o polimorfismo rs61722009, de variação de número de repetições (VNTR). A frequência da variante rs2070744 nos indivíduos com a embriopatia quando comparados ao grupo controle, sem anomalias congênitas, foi estatisticamente diferente (p=0,022). Além disso, foi demonstrada uma interação entre o SNP rs2070744 e o VNTR rs61722009 que corroborou os resultados anteriores e sugeriu que os indivíduos com TE possuem, em maior frequência, alelos que reduzem a expressão de NOS3 a partir de mecanismos de regulação pré-transcricional. Esse achado pode ser de grande contribuição para os estudos da etiologia da TE. As análises e resultados obtidos nesse estudo podem contribuir para complementação dos ensaios em modelos experimentais que vem sido realizados com a talidomida, e esclarecer aspectos moleculares da teratogênese dessa embriopatia. / Thalidomide was synthesized in 1954 in Western Germany and marketed around the world as a safe sedative, although with the increased incidence of children born with congenital anomalies, especially limb reduction defects (LRD) in the beginning of the 1960s, its teratogenesis was established. It is estimated that 20-50% of all babies exposed to thalidomide were born affected by its embryopathy, counting 10 thousand children around the world. The majority of individuals with thalidomide embryopathy (TE) were evaluated only at birth and the natural history of this condition is not known. Besided, the molecular mechanisms of its teratogenesis were never completely elucidated. Researches in animal models suggest that such mechanism may be associated to thalidomide’s antiangiogenic property. The objective of this study was to perform an exploratory evaluation of physical and psychological health in individuals with TE, in order to provide a better understanding of the embryopathy’s etiology, once it is not known if thalidomide may cause late effects, such as aggravation or anticipation of some diseases. Besides, an evaluation of functional polymorphisms in genes of angiogenesis pathway was performed in these subjects looking for a comprehension of phisiopathological mechanisms of this condition. Through a clinical questionnaire applied to twenty-eight individuals with TE, born between 1959 and 2010, their congenital anomalies were evaluated. Limb defects were the anomalies most frequently identified (96%), followed by eyes (25%) and ears (14%). Twenty-three of these individuals answered a questionnaire about their history and current health. All were adults, with ages ranging between 19 and 55 years. When compared the data obtained with prevalence rates in Brazilian population, without congenital anomalies, it was identified that these individuals present a high prevalence of chronic diseases (p=0.001), especially psychological disorders (p=0.011). A suggestion of early development of cardiovascular diseases was also identified in TE cases (p=0.009). Progressive deafness and dental loss in teenage years were also reported. New analysis must be performed in order to clarify if such conditions may have been caused or aggravated by thalidomide’s embryonary exposure. To evaluate variants of possible genetic susceptibility to TE, it was selected ten functional polymorphisms in genes that seem to have their expression altered after thalidomide’s exposure (according to experimental studies): three in NOS2 gene (rs2779249, rs3833912 and rs2297518), three in PTGS2 (rs689465, rs689466 and rs20417) and four in VEGFA (rs699947, rs1570360, rs2010963 and rs3025039). Such polymorphisms were genotyped through conventional PCR or real-time PCR in 38 individuals with TE and 136 Brazilian without congenital anomalies. It was not identified risk or protective alleles or genotypes to TE in the polymorphisms of NOS2, PTGS2 and VEGFA in the individuals evaluated. Additionally, three polymorphisms in NOS3 were also analyzed: two functional variants (rs2070744 and rs1799983) previously related with TE and the polymorphism rs61722009, of variable number of repeats (VNTR). The frequencies of the variant rs2070744 in the individuals with the embryopathy when compared to control group, without congenital anomalies, was statistically different (p=0.022). Besides, it was demonstrated an interaction between the SNP rs2070744 and the VNTR rs61722009 that corroborated the previous results and suggested that the individuals with TE have, in higher frequency, alleles that reduce the NOS3 expression through pre-transcriptional regulation mechanisms. This finding can be of great contribution to the studies of TE etiology. The analysis and obtained results of this study may complement the assays with animal models and thalidomide that are currently being evaluated, and clarify molecular aspects of the teratogenesis of this embryopathy.

As células pluripotentes induzidas (iPSC) apresentam um grande potencial terapêutico, mas seu uso é dependente da capacidade de encontrar estratégias para suprimir o seu potencial tumorigênico. No entanto, esse risco diminui com a utilização de células num estado mais diferenciado. O uso dos fatores de transcrição OCT4, SOX2, KLF4, c-MYC e NANOG para induzir iPSC demonstraram a já conhecida importância desses genes para manter o estado pluripotente. Portanto, a hipótese do presente trabalho é que a presença desses genes seriam os responsáveis pelos teratomas formados a partir das iPSC. P19 é uma linhagem de teratocarcinoma amplamente utilizada como modelo de iPSC, uma vez que apresenta células de carcinoma embrionário (semelhantes as células tronco embrionárias, mas malignas), além de ter a capacidade de se diferenciar em células derivadas dos três folhetos embrionários. Teratocarcinomas são um dos tumores testiculares de células germinativas (TCGT) mais comuns e também um dos tumores sólidos mais curáveis. Entretanto, uma pequena parcela dos pacientes apresentam resistência ao tratamento com cisplatina ou etoposídeo. Nosso objetivo foi avaliar a importância dos fatores comumente utilizados nas iPSC tanto na indução de teratomas quanto na sua contribuição na resistência de TCGT. Desse modo, silenciamos (KD), separadamente, os fatores nas células P19 e, após a confirmação do silenciamento, caracterizamos as células quanto a sua capacidade de formar teratoma. Nossos resultados mostraram que todas as células KD foram capazes de formar tumores, mas apenas a redução de OCT4 e SOX2 geraram tumores mais diferenciados, apresentando células derivadas de todas as camadas germinativas. Os resultados in vitro demonstraram que apenas KLF4 e c-MYC KD aumentaram a sensibilidade à cisplatina sozinha ou combinada com etoposídeo. Células OCT4 KD apresentaram resistência semelhante as células controle, e SOX2 KD respondeu somente à combinação, enquanto que NANOG apenas à cisplatina. Assim, nossos resultados sugerem que análise KLF4 e c-MYC pode ser útil para detectar uma possível resistência ao tratamento em TCGT. / Induced pluripotent cells (iPSC) have a great potential for therapeutic use, which is dependent on the ability to abolish their tumorigenic potential. However, this risk decreases with the use of cells in a more differentiated state. The use of OCT4, SOX2, KLF4, c-MYC and NANOG to induce iPSC demonstrated the already known importance of these genes to maintain stemness. Therefore, our working hypothesis is that the presence of these genes is responsible for iPSC-derived teratomas. P19 teratocarcinoma cell line is widely used as an iPSC model, since it presents embryonic carcinoma cells (similar to embryonic stem cells, but are malignant), besides having the capacity to differentiate into cells derived from the three embryonic germ layers. Teratocarcinomas are one of the most common type of testicular germ cell tumors (TGCT), and also the most curable solid tumors. However, a small proportion of patients present resistance to cisplatin or etoposide. Our aim was to evaluate the importance of the transcriptions factor commonly used to induce iPSC in the induction of teratoma and also their contribution in the resistance induction. Therefore, we separately knocked down (KD) the transcription factors in P19 cells and after the silencing confirmation we characterized them for their capacity to form a mature teratoma. Our results showed that all KD cells were able to form tumors, but only reduction of OCT4 and SOX2 generated a more differentiated tumor, presenting cells from all embryonic germ layers. In vitro results showed that only the absence of KLF4 and c-MYC increased sensitivity for cisplatin alone or combined with etoposide. OCT4 KD results were similar to control cells, and SOX2 KD only responded to combination, while NANOG to cisplatin. Taken together, our results suggest that KLF4 and c- MYC analysis might be helpful to detect possible TGCT treatment resistance.

A talidomida é um fármaco que foi sintetizado pela primeira vez em 1954. Poucos anos após sua síntese já era amplamente utilizada para uma série de indicações. No início da década de 1960, a alta incidência de bebês nascidos com defeitos de redução de membros foi correlacionada com o uso de talidomida por mulheres grávidas. Em torno de 20-50% dos embriões expostos à talidomida foram afetados e desenvolveram as malformações características da embriopatia por talidomida (TE). Atualmente sabe-se que o background genético dos indivíduos tem um papel importante nessa suscetibilidade, entretanto, os fatores associados à maior suscetibilidade e aqueles relacionados a diferentes fenótipos dentro da TE não são totalmente conhecidos. Algumas síndromes genéticas têm fenótipos muito semelhantes aos visualizados na TE, sendo a TE considerada uma fenocópia destas síndromes. As principais são: Síndrome de Roberts, Síndrome de Duane de raio radial – também chamada Síndrome de Okihiro –, e Síndrome de Holt-Oram, causadas por mutações nos genes ESCO2, SALL4 e TBX5, respectivamente. A análise das bases moleculares e patogênese de síndromes genéticas de fenótipo similar a embriopatias causadas por fármacos (fenocópias) tem ajudado na compreensão de alguns mecanismos teratogênicos. O objetivo desse trabalho foi investigar a contribuição dos três genes acima citados na suscetibilidade à TE e seu papel nas diferentes anomalias congênitas e doenças observadas nos indivíduos afetados. Os éxons e regiões flanqueadoras (UTRs e cerca de 50 pb dos íntrons adjacentes) desses três genes foram sequenciados em 29 indivíduos afetados pela TE e as variantes encontradas foram avaliadas através de preditores funcionais in silico. Quarenta e uma variantes foram identificadas, 11 (27%) no gene ESCO2, 14 (34%) no gene SALL4 e 16 (39%) no gene TBX5. Inserções e deleções estavam presentes apenas no gene ESCO2. Duas das variantes identificadas, uma em ESCO2 e uma em TBX5, não estavam descritas previamente em bancos de dados genômicos. Doze (29%) eram variantes genéticas raras (<0,01). As frequências alélicas e genotípicas das variantes foram determinadas na nossa amostra e comparadas com dados da população européia do Projeto 1000 Genomas. Não foram identificados alelos ou genótipos que conferissem risco ou proteção para a TE. As frequências foram significativamente diferentes entre os dois grupos apenas para uma variante 3'UTR (rs62498042) do gene ESCO2 (p<0,001), entretanto, não há relatos na literatura do papel funcional dessa variante ou de sua associação com aumento da susceptibilidade para alguma doença. A análise in silico que realizamos sugeriu possível alteração de splicing devido à presença dessa variante. Algumas variantes aqui identificadas foram previamente avaliadas em doenças cardiovasculares e malformações cardíacas. Nós comparamos a frequência dessas variantes em indivíduos com TE que apresentavam alguma anomalia cardíaca ou doença cardiovascular e aqueles que não apresentavam tais condições; entretanto, não houve associação entre a presença das variantes e risco aumentado para alguma anomalia cardíaca ou doença cardiovascular. Análises in silico foram realizadas a fim de avaliar o potencial de todas as variantes encontradas para alterações funcionais nas proteínas, alterações no splicing e em sítios de ligação de fatores de transcrição e miRNAs. Muitas variantes foram consideradas como tendo tal potencial, especialmente de afetar o splicing, entretanto, não foi possível estabelecer o papel dessas variantes no decaimento do mRNA desses genes, na formação de isoformas alternativas ou ainda na diminuição da expressão dos genes. Alguns resultados devem ser melhor explorados através de ensaios funcionais para determinar o papel das variantes na atividade das proteínas, no mecanismo molecular de desenvolvimento de anomalias congênitas e na teratogênese da talidomida. / Thalidomide is a drug that was first synthesized in 1954. Following its release on to the market, thalidomide was already widely used for a diverse number of indications. The high incidence of babies being born with limb reduction defects in early 1960s was related with the use of thalidomide by pregnant women. Around 20-50% of the embryos exposed to thalidomide were affected and developed the characteristic malformations of thalidomide embryopathy (TE). Currently is known that the genetic background of the individuals plays an important role in this susceptibility; however, the factors associated with higher susceptibility and those related to different phenotypes are not fully known. Some phenotypes observed in TE are very similar to characteristics seen in some genetic syndromes. Because of that, TE is considered a phenocopy of these syndromes. The main syndromes that TE is phenocopy are: Roberts Syndrome, Duane Radial Ray Syndrome (also known as Okihiro Syndrome) and Holt-Oram Syndrome, caused by mutations in ESCO2, SALL4 and TBX5 genes, respectively. The analysis of the molecular bases of syndromes of similar phenotype to embryopathy cause by drugs (phenocopies) has helped in the understanding of teratogenic mechanisms. The aim of this study was to investigate the contribution of these three genes in TE susceptibility and theirs role in different congenital anomalies and diseases seen in affected individuals. The exons and flanking regions (UTRs and 50pb of adjacents introns) of these genes were sequenced by next generation sequencing in 29 individuals affected by TE and the variants found were evaluated through bioinformatic tools in silico. Forty-one variants were identified, 11 (27%) in ESCO2, 14 (34%) in SALL4 and 16 (39%) in TBX5. Insertions and deletions were present only in ESCO2 gene. Two of the identified variants, one in ESCO2 and on in TBX5, were not previously described in genomic databases. Twelve variants (29%) were rare (<0.01). The allelic and genotypic frequencies of our sample were determined and compared with data from the European population of 1000 Genomes Project. No allele or genotype was related to risk or protection for TE. The frequencies were significantly different between the two groups for only one 3'UTR variant (rs62498042) found in ESCO2 gene (p <0.001). However, there are no reports on literature of the functional role of this variant or its association with increased susceptibility to some disease. In silico analyses here performed suggested splicing changes due this variant presence. Some variants here identified have been previously evaluated in cardiovascular diseases and cardiac malformations. We compared the frequency of these variants in individuals with TE that presented some cardiac anomaly or cardiovascular disease and those that did not present such conditions; however, there was no association between these variants and increased risk for these conditions. In silico analyses were performed in order to evaluate the potential of the variants for functional alterations in proteins, changes in splicing sites, transcription factors binding sites and miRNA interaction sites. Many variants were considered to have such potential, especially of splicing changes; however, it was not possible to establish the role of the variants in decay of these genes mRNA, or in alternative isoforms formation or in the decrease of these genes expression. Some variants should be further investigated. Functional analyses would be useful to investigate the role of the variants in the proteins activities, in the molecular mechanism of congenital anomalies development and in thalidomide teratogenesis.

As células pluripotentes induzidas (iPSC) apresentam um grande potencial terapêutico, mas seu uso é dependente da capacidade de encontrar estratégias para suprimir o seu potencial tumorigênico. No entanto, esse risco diminui com a utilização de células num estado mais diferenciado. O uso dos fatores de transcrição OCT4, SOX2, KLF4, c-MYC e NANOG para induzir iPSC demonstraram a já conhecida importância desses genes para manter o estado pluripotente. Portanto, a hipótese do presente trabalho é que a presença desses genes seriam os responsáveis pelos teratomas formados a partir das iPSC. P19 é uma linhagem de teratocarcinoma amplamente utilizada como modelo de iPSC, uma vez que apresenta células de carcinoma embrionário (semelhantes as células tronco embrionárias, mas malignas), além de ter a capacidade de se diferenciar em células derivadas dos três folhetos embrionários. Teratocarcinomas são um dos tumores testiculares de células germinativas (TCGT) mais comuns e também um dos tumores sólidos mais curáveis. Entretanto, uma pequena parcela dos pacientes apresentam resistência ao tratamento com cisplatina ou etoposídeo. Nosso objetivo foi avaliar a importância dos fatores comumente utilizados nas iPSC tanto na indução de teratomas quanto na sua contribuição na resistência de TCGT. Desse modo, silenciamos (KD), separadamente, os fatores nas células P19 e, após a confirmação do silenciamento, caracterizamos as células quanto a sua capacidade de formar teratoma. Nossos resultados mostraram que todas as células KD foram capazes de formar tumores, mas apenas a redução de OCT4 e SOX2 geraram tumores mais diferenciados, apresentando células derivadas de todas as camadas germinativas. Os resultados in vitro demonstraram que apenas KLF4 e c-MYC KD aumentaram a sensibilidade à cisplatina sozinha ou combinada com etoposídeo. Células OCT4 KD apresentaram resistência semelhante as células controle, e SOX2 KD respondeu somente à combinação, enquanto que NANOG apenas à cisplatina. Assim, nossos resultados sugerem que análise KLF4 e c-MYC pode ser útil para detectar uma possível resistência ao tratamento em TCGT. / Induced pluripotent cells (iPSC) have a great potential for therapeutic use, which is dependent on the ability to abolish their tumorigenic potential. However, this risk decreases with the use of cells in a more differentiated state. The use of OCT4, SOX2, KLF4, c-MYC and NANOG to induce iPSC demonstrated the already known importance of these genes to maintain stemness. Therefore, our working hypothesis is that the presence of these genes is responsible for iPSC-derived teratomas. P19 teratocarcinoma cell line is widely used as an iPSC model, since it presents embryonic carcinoma cells (similar to embryonic stem cells, but are malignant), besides having the capacity to differentiate into cells derived from the three embryonic germ layers. Teratocarcinomas are one of the most common type of testicular germ cell tumors (TGCT), and also the most curable solid tumors. However, a small proportion of patients present resistance to cisplatin or etoposide. Our aim was to evaluate the importance of the transcriptions factor commonly used to induce iPSC in the induction of teratoma and also their contribution in the resistance induction. Therefore, we separately knocked down (KD) the transcription factors in P19 cells and after the silencing confirmation we characterized them for their capacity to form a mature teratoma. Our results showed that all KD cells were able to form tumors, but only reduction of OCT4 and SOX2 generated a more differentiated tumor, presenting cells from all embryonic germ layers. In vitro results showed that only the absence of KLF4 and c-MYC increased sensitivity for cisplatin alone or combined with etoposide. OCT4 KD results were similar to control cells, and SOX2 KD only responded to combination, while NANOG to cisplatin. Taken together, our results suggest that KLF4 and c- MYC analysis might be helpful to detect possible TGCT treatment resistance.

A talidomida é um fármaco que foi sintetizado pela primeira vez em 1954. Poucos anos após sua síntese já era amplamente utilizada para uma série de indicações. No início da década de 1960, a alta incidência de bebês nascidos com defeitos de redução de membros foi correlacionada com o uso de talidomida por mulheres grávidas. Em torno de 20-50% dos embriões expostos à talidomida foram afetados e desenvolveram as malformações características da embriopatia por talidomida (TE). Atualmente sabe-se que o background genético dos indivíduos tem um papel importante nessa suscetibilidade, entretanto, os fatores associados à maior suscetibilidade e aqueles relacionados a diferentes fenótipos dentro da TE não são totalmente conhecidos. Algumas síndromes genéticas têm fenótipos muito semelhantes aos visualizados na TE, sendo a TE considerada uma fenocópia destas síndromes. As principais são: Síndrome de Roberts, Síndrome de Duane de raio radial – também chamada Síndrome de Okihiro –, e Síndrome de Holt-Oram, causadas por mutações nos genes ESCO2, SALL4 e TBX5, respectivamente. A análise das bases moleculares e patogênese de síndromes genéticas de fenótipo similar a embriopatias causadas por fármacos (fenocópias) tem ajudado na compreensão de alguns mecanismos teratogênicos. O objetivo desse trabalho foi investigar a contribuição dos três genes acima citados na suscetibilidade à TE e seu papel nas diferentes anomalias congênitas e doenças observadas nos indivíduos afetados. Os éxons e regiões flanqueadoras (UTRs e cerca de 50 pb dos íntrons adjacentes) desses três genes foram sequenciados em 29 indivíduos afetados pela TE e as variantes encontradas foram avaliadas através de preditores funcionais in silico. Quarenta e uma variantes foram identificadas, 11 (27%) no gene ESCO2, 14 (34%) no gene SALL4 e 16 (39%) no gene TBX5. Inserções e deleções estavam presentes apenas no gene ESCO2. Duas das variantes identificadas, uma em ESCO2 e uma em TBX5, não estavam descritas previamente em bancos de dados genômicos. Doze (29%) eram variantes genéticas raras (<0,01). As frequências alélicas e genotípicas das variantes foram determinadas na nossa amostra e comparadas com dados da população européia do Projeto 1000 Genomas. Não foram identificados alelos ou genótipos que conferissem risco ou proteção para a TE. As frequências foram significativamente diferentes entre os dois grupos apenas para uma variante 3'UTR (rs62498042) do gene ESCO2 (p<0,001), entretanto, não há relatos na literatura do papel funcional dessa variante ou de sua associação com aumento da susceptibilidade para alguma doença. A análise in silico que realizamos sugeriu possível alteração de splicing devido à presença dessa variante. Algumas variantes aqui identificadas foram previamente avaliadas em doenças cardiovasculares e malformações cardíacas. Nós comparamos a frequência dessas variantes em indivíduos com TE que apresentavam alguma anomalia cardíaca ou doença cardiovascular e aqueles que não apresentavam tais condições; entretanto, não houve associação entre a presença das variantes e risco aumentado para alguma anomalia cardíaca ou doença cardiovascular. Análises in silico foram realizadas a fim de avaliar o potencial de todas as variantes encontradas para alterações funcionais nas proteínas, alterações no splicing e em sítios de ligação de fatores de transcrição e miRNAs. Muitas variantes foram consideradas como tendo tal potencial, especialmente de afetar o splicing, entretanto, não foi possível estabelecer o papel dessas variantes no decaimento do mRNA desses genes, na formação de isoformas alternativas ou ainda na diminuição da expressão dos genes. Alguns resultados devem ser melhor explorados através de ensaios funcionais para determinar o papel das variantes na atividade das proteínas, no mecanismo molecular de desenvolvimento de anomalias congênitas e na teratogênese da talidomida. / Thalidomide is a drug that was first synthesized in 1954. Following its release on to the market, thalidomide was already widely used for a diverse number of indications. The high incidence of babies being born with limb reduction defects in early 1960s was related with the use of thalidomide by pregnant women. Around 20-50% of the embryos exposed to thalidomide were affected and developed the characteristic malformations of thalidomide embryopathy (TE). Currently is known that the genetic background of the individuals plays an important role in this susceptibility; however, the factors associated with higher susceptibility and those related to different phenotypes are not fully known. Some phenotypes observed in TE are very similar to characteristics seen in some genetic syndromes. Because of that, TE is considered a phenocopy of these syndromes. The main syndromes that TE is phenocopy are: Roberts Syndrome, Duane Radial Ray Syndrome (also known as Okihiro Syndrome) and Holt-Oram Syndrome, caused by mutations in ESCO2, SALL4 and TBX5 genes, respectively. The analysis of the molecular bases of syndromes of similar phenotype to embryopathy cause by drugs (phenocopies) has helped in the understanding of teratogenic mechanisms. The aim of this study was to investigate the contribution of these three genes in TE susceptibility and theirs role in different congenital anomalies and diseases seen in affected individuals. The exons and flanking regions (UTRs and 50pb of adjacents introns) of these genes were sequenced by next generation sequencing in 29 individuals affected by TE and the variants found were evaluated through bioinformatic tools in silico. Forty-one variants were identified, 11 (27%) in ESCO2, 14 (34%) in SALL4 and 16 (39%) in TBX5. Insertions and deletions were present only in ESCO2 gene. Two of the identified variants, one in ESCO2 and on in TBX5, were not previously described in genomic databases. Twelve variants (29%) were rare (<0.01). The allelic and genotypic frequencies of our sample were determined and compared with data from the European population of 1000 Genomes Project. No allele or genotype was related to risk or protection for TE. The frequencies were significantly different between the two groups for only one 3'UTR variant (rs62498042) found in ESCO2 gene (p <0.001). However, there are no reports on literature of the functional role of this variant or its association with increased susceptibility to some disease. In silico analyses here performed suggested splicing changes due this variant presence. Some variants here identified have been previously evaluated in cardiovascular diseases and cardiac malformations. We compared the frequency of these variants in individuals with TE that presented some cardiac anomaly or cardiovascular disease and those that did not present such conditions; however, there was no association between these variants and increased risk for these conditions. In silico analyses were performed in order to evaluate the potential of the variants for functional alterations in proteins, changes in splicing sites, transcription factors binding sites and miRNA interaction sites. Many variants were considered to have such potential, especially of splicing changes; however, it was not possible to establish the role of the variants in decay of these genes mRNA, or in alternative isoforms formation or in the decrease of these genes expression. Some variants should be further investigated. Functional analyses would be useful to investigate the role of the variants in the proteins activities, in the molecular mechanism of congenital anomalies development and in thalidomide teratogenesis.

As células pluripotentes induzidas (iPSC) apresentam um grande potencial terapêutico, mas seu uso é dependente da capacidade de encontrar estratégias para suprimir o seu potencial tumorigênico. No entanto, esse risco diminui com a utilização de células num estado mais diferenciado. O uso dos fatores de transcrição OCT4, SOX2, KLF4, c-MYC e NANOG para induzir iPSC demonstraram a já conhecida importância desses genes para manter o estado pluripotente. Portanto, a hipótese do presente trabalho é que a presença desses genes seriam os responsáveis pelos teratomas formados a partir das iPSC. P19 é uma linhagem de teratocarcinoma amplamente utilizada como modelo de iPSC, uma vez que apresenta células de carcinoma embrionário (semelhantes as células tronco embrionárias, mas malignas), além de ter a capacidade de se diferenciar em células derivadas dos três folhetos embrionários. Teratocarcinomas são um dos tumores testiculares de células germinativas (TCGT) mais comuns e também um dos tumores sólidos mais curáveis. Entretanto, uma pequena parcela dos pacientes apresentam resistência ao tratamento com cisplatina ou etoposídeo. Nosso objetivo foi avaliar a importância dos fatores comumente utilizados nas iPSC tanto na indução de teratomas quanto na sua contribuição na resistência de TCGT. Desse modo, silenciamos (KD), separadamente, os fatores nas células P19 e, após a confirmação do silenciamento, caracterizamos as células quanto a sua capacidade de formar teratoma. Nossos resultados mostraram que todas as células KD foram capazes de formar tumores, mas apenas a redução de OCT4 e SOX2 geraram tumores mais diferenciados, apresentando células derivadas de todas as camadas germinativas. Os resultados in vitro demonstraram que apenas KLF4 e c-MYC KD aumentaram a sensibilidade à cisplatina sozinha ou combinada com etoposídeo. Células OCT4 KD apresentaram resistência semelhante as células controle, e SOX2 KD respondeu somente à combinação, enquanto que NANOG apenas à cisplatina. Assim, nossos resultados sugerem que análise KLF4 e c-MYC pode ser útil para detectar uma possível resistência ao tratamento em TCGT. / Induced pluripotent cells (iPSC) have a great potential for therapeutic use, which is dependent on the ability to abolish their tumorigenic potential. However, this risk decreases with the use of cells in a more differentiated state. The use of OCT4, SOX2, KLF4, c-MYC and NANOG to induce iPSC demonstrated the already known importance of these genes to maintain stemness. Therefore, our working hypothesis is that the presence of these genes is responsible for iPSC-derived teratomas. P19 teratocarcinoma cell line is widely used as an iPSC model, since it presents embryonic carcinoma cells (similar to embryonic stem cells, but are malignant), besides having the capacity to differentiate into cells derived from the three embryonic germ layers. Teratocarcinomas are one of the most common type of testicular germ cell tumors (TGCT), and also the most curable solid tumors. However, a small proportion of patients present resistance to cisplatin or etoposide. Our aim was to evaluate the importance of the transcriptions factor commonly used to induce iPSC in the induction of teratoma and also their contribution in the resistance induction. Therefore, we separately knocked down (KD) the transcription factors in P19 cells and after the silencing confirmation we characterized them for their capacity to form a mature teratoma. Our results showed that all KD cells were able to form tumors, but only reduction of OCT4 and SOX2 generated a more differentiated tumor, presenting cells from all embryonic germ layers. In vitro results showed that only the absence of KLF4 and c-MYC increased sensitivity for cisplatin alone or combined with etoposide. OCT4 KD results were similar to control cells, and SOX2 KD only responded to combination, while NANOG to cisplatin. Taken together, our results suggest that KLF4 and c- MYC analysis might be helpful to detect possible TGCT treatment resistance.

A talidomida é um fármaco que foi sintetizado pela primeira vez em 1954. Poucos anos após sua síntese já era amplamente utilizada para uma série de indicações. No início da década de 1960, a alta incidência de bebês nascidos com defeitos de redução de membros foi correlacionada com o uso de talidomida por mulheres grávidas. Em torno de 20-50% dos embriões expostos à talidomida foram afetados e desenvolveram as malformações características da embriopatia por talidomida (TE). Atualmente sabe-se que o background genético dos indivíduos tem um papel importante nessa suscetibilidade, entretanto, os fatores associados à maior suscetibilidade e aqueles relacionados a diferentes fenótipos dentro da TE não são totalmente conhecidos. Algumas síndromes genéticas têm fenótipos muito semelhantes aos visualizados na TE, sendo a TE considerada uma fenocópia destas síndromes. As principais são: Síndrome de Roberts, Síndrome de Duane de raio radial – também chamada Síndrome de Okihiro –, e Síndrome de Holt-Oram, causadas por mutações nos genes ESCO2, SALL4 e TBX5, respectivamente. A análise das bases moleculares e patogênese de síndromes genéticas de fenótipo similar a embriopatias causadas por fármacos (fenocópias) tem ajudado na compreensão de alguns mecanismos teratogênicos. O objetivo desse trabalho foi investigar a contribuição dos três genes acima citados na suscetibilidade à TE e seu papel nas diferentes anomalias congênitas e doenças observadas nos indivíduos afetados. Os éxons e regiões flanqueadoras (UTRs e cerca de 50 pb dos íntrons adjacentes) desses três genes foram sequenciados em 29 indivíduos afetados pela TE e as variantes encontradas foram avaliadas através de preditores funcionais in silico. Quarenta e uma variantes foram identificadas, 11 (27%) no gene ESCO2, 14 (34%) no gene SALL4 e 16 (39%) no gene TBX5. Inserções e deleções estavam presentes apenas no gene ESCO2. Duas das variantes identificadas, uma em ESCO2 e uma em TBX5, não estavam descritas previamente em bancos de dados genômicos. Doze (29%) eram variantes genéticas raras (<0,01). As frequências alélicas e genotípicas das variantes foram determinadas na nossa amostra e comparadas com dados da população européia do Projeto 1000 Genomas. Não foram identificados alelos ou genótipos que conferissem risco ou proteção para a TE. As frequências foram significativamente diferentes entre os dois grupos apenas para uma variante 3'UTR (rs62498042) do gene ESCO2 (p<0,001), entretanto, não há relatos na literatura do papel funcional dessa variante ou de sua associação com aumento da susceptibilidade para alguma doença. A análise in silico que realizamos sugeriu possível alteração de splicing devido à presença dessa variante. Algumas variantes aqui identificadas foram previamente avaliadas em doenças cardiovasculares e malformações cardíacas. Nós comparamos a frequência dessas variantes em indivíduos com TE que apresentavam alguma anomalia cardíaca ou doença cardiovascular e aqueles que não apresentavam tais condições; entretanto, não houve associação entre a presença das variantes e risco aumentado para alguma anomalia cardíaca ou doença cardiovascular. Análises in silico foram realizadas a fim de avaliar o potencial de todas as variantes encontradas para alterações funcionais nas proteínas, alterações no splicing e em sítios de ligação de fatores de transcrição e miRNAs. Muitas variantes foram consideradas como tendo tal potencial, especialmente de afetar o splicing, entretanto, não foi possível estabelecer o papel dessas variantes no decaimento do mRNA desses genes, na formação de isoformas alternativas ou ainda na diminuição da expressão dos genes. Alguns resultados devem ser melhor explorados através de ensaios funcionais para determinar o papel das variantes na atividade das proteínas, no mecanismo molecular de desenvolvimento de anomalias congênitas e na teratogênese da talidomida. / Thalidomide is a drug that was first synthesized in 1954. Following its release on to the market, thalidomide was already widely used for a diverse number of indications. The high incidence of babies being born with limb reduction defects in early 1960s was related with the use of thalidomide by pregnant women. Around 20-50% of the embryos exposed to thalidomide were affected and developed the characteristic malformations of thalidomide embryopathy (TE). Currently is known that the genetic background of the individuals plays an important role in this susceptibility; however, the factors associated with higher susceptibility and those related to different phenotypes are not fully known. Some phenotypes observed in TE are very similar to characteristics seen in some genetic syndromes. Because of that, TE is considered a phenocopy of these syndromes. The main syndromes that TE is phenocopy are: Roberts Syndrome, Duane Radial Ray Syndrome (also known as Okihiro Syndrome) and Holt-Oram Syndrome, caused by mutations in ESCO2, SALL4 and TBX5 genes, respectively. The analysis of the molecular bases of syndromes of similar phenotype to embryopathy cause by drugs (phenocopies) has helped in the understanding of teratogenic mechanisms. The aim of this study was to investigate the contribution of these three genes in TE susceptibility and theirs role in different congenital anomalies and diseases seen in affected individuals. The exons and flanking regions (UTRs and 50pb of adjacents introns) of these genes were sequenced by next generation sequencing in 29 individuals affected by TE and the variants found were evaluated through bioinformatic tools in silico. Forty-one variants were identified, 11 (27%) in ESCO2, 14 (34%) in SALL4 and 16 (39%) in TBX5. Insertions and deletions were present only in ESCO2 gene. Two of the identified variants, one in ESCO2 and on in TBX5, were not previously described in genomic databases. Twelve variants (29%) were rare (<0.01). The allelic and genotypic frequencies of our sample were determined and compared with data from the European population of 1000 Genomes Project. No allele or genotype was related to risk or protection for TE. The frequencies were significantly different between the two groups for only one 3'UTR variant (rs62498042) found in ESCO2 gene (p <0.001). However, there are no reports on literature of the functional role of this variant or its association with increased susceptibility to some disease. In silico analyses here performed suggested splicing changes due this variant presence. Some variants here identified have been previously evaluated in cardiovascular diseases and cardiac malformations. We compared the frequency of these variants in individuals with TE that presented some cardiac anomaly or cardiovascular disease and those that did not present such conditions; however, there was no association between these variants and increased risk for these conditions. In silico analyses were performed in order to evaluate the potential of the variants for functional alterations in proteins, changes in splicing sites, transcription factors binding sites and miRNA interaction sites. Many variants were considered to have such potential, especially of splicing changes; however, it was not possible to establish the role of the variants in decay of these genes mRNA, or in alternative isoforms formation or in the decrease of these genes expression. Some variants should be further investigated. Functional analyses would be useful to investigate the role of the variants in the proteins activities, in the molecular mechanism of congenital anomalies development and in thalidomide teratogenesis.

Até pouco tempo, o conhecimento da contaminação dos ecossistemas aquáticos, estava restrito a metais e agrotóxicos, sendo pouca ênfase dada a produtos farmacêuticos, que, apesar de serem encontrados em concentrações de nanogramas a microgramas, podem causar efeitos letais e induzir malformações nos organismos. Estudos ecotoxicológicos têm sido realizados para identificar os efeitos destas substâncias, contudo, os dados são insuficientes, principalmente no que se refere a efeitos subletais e de toxicidade em espécies de ambientes tropicais e subtropicais. Efeitos letais e subletais, como crescimento e reprodução, são determinados através de ensaios ecotoxicológicos agudos e crônicos, sendo as malformações dificilmente evidenciadas por estes ensaios. Diante disto, pesquisadores vêm desenvolvendo metodologias mais refinadas, como por exemplo, a exposição direta de embriões a produtos químicos em ensaios de teratogênese. Para Cladocera estes ensaios são restritos. O objetivo deste trabalho foi estudar os efeitos letais e subletais de um antimicrobiano, Triclosan, através de ensaios de ecotoxicidade com Daphnia similis, Ceriodaphnia. dubia e C. silvestrii. A fim de se estimar com maior rigor os efeitos em ambientes tropicais e subtropicais, os ensaios foram realizados com água natural como água de diluição, com e sem fotoperíodo. Também foram realizados ensaios em água Milli- Q água reconstituída, sem fotoperíodo de modo a observar a toxicidade do produto sem interferentes externos. Estágio do desenvolvimento embrionário de D. similis, C. dubia e C. silvestrii foram identificado de modo a otimizar os ensaios de teratogênese. Para o estudo da toxicidade, foram realizados ensaios de ecotoxicidade aguda com D. similis, C. dubia e C. silvestrii e ensaios crônicos com D.similis e C. silvestrii. Para a classificação dos estágios do desenvolvimento embrionário, ovos foram cultivados in vivo a temperatura de 20°C (D. similis) e 25°C (C. dubia e silvestrii), observados a cada hora, até o desenvolvimento completo do organismo. Posteriormente, as condições dos ensaios de teratogênese foram estabelecidas sendo realizados com D. similis. A CE50 48H de Triclosan para D.similis e C. silvestrii em água natural reconstituída com fotoperíodo foi de 0,23 e 0,10 mg.L-1, respectivamente, e de 0,13 mg.L-1para C. silvestrii, sem fotoperíodo. Para os ensaios com água Milli-Q reconstituída, sem fotoperíodo, os valores de CE50;48H para D. similis, C. dubia e C. silvestrii foram de 0, 22; 0,09 e 0,08 mg.L-1, respectivamente. O CEO para D. similis foi de 0,1 mg.L-1 e a o valor de IC50 relativo às malformações das neonatas nos testes crônicos foi de 0,057 mg.L-1. Para C.silvestrii o CEO foi de 0,04 mg.L-1, não sendo evidenciadas malformações nas neonatas. Sete estágios foram observados no desenvolvimento embrionário dos cladoceros com duração (horas) de 34 (±3) para C. dubia, 36(±2) para C. silvestrii e de 51 (±5) para D. similis. O valor de IC50 para malformação nos ensaios de teratogênese (exposição direta de embriões) para D. similis foi de 0,075 mg.L-1, próximo ao obtido nos ensaios crônicos / Until recently, the knowledge of contamination on aquatic ecosystems was restricted to metals and pesticides, with little emphasis on pharmaceuticals. Despite being found in concentrations of nanograms to micrograms per litre, these compounds can cause lethal and development defects on living organisms. Ecotoxicological studies have been performed to identify effects of these substances. However, the data available is not sufficient, especially for species in tropical and sub-tropical environments. Lethal and sublethal effects, such as growth and reproduction, are determined through acute and chronic toxicity tests, but developmental effects are hardly evaluated in these tests. Thus, researchers have been developing refined methods, such as the direct exposure of embryos to chemicals in tests of teratogenisis. These tests are restricted to Cladocera. The purpose of study was to evaluate lethal and sublethal effects of an antimicrobial compound, Triclosan (5-chloro-2[2,4-dichloro-phenol) to Daphnia similis, Ceriodaphnia dubia and C. silvestrii. Acute toxicity tests with Daphnina similis and Ceriodaphnia silvestrii were conducted with natural reconstituted water, with and without photoperiod, aiming to estimate more rigorous effects in tropical and subtropical environments. Acute toxicity tests were conducted with reconstituted water (Milli-Q) without photoperiod to observe the toxicity of Triclosan without external interferences. Embryonic stages of development in D. similis, C. dubia and C. silvestrii were identified to optimize teratogenesis tests. Acute toxicity testes were performed with D. similis, C. dubia, C. silvestrii and cronic toxicity testes with D. similis and C. silvestrii. Eggs were cultivated \"in vivo\" at temperature of 20°C (D. similis) and 25°C (C. dubia and C. silvestrii), and observed every hour until full development. Subsequently, the conditions of the teratogenisis tests were established and tests were performed with D. similis. The EC50,48H of Triclosan for D.similis and C. silvestrii in natural reconstituted water with photoperiod was 0.23 and 0.10 mg.L-1, respectively, and 0.13 mg.L-1 for C. silvestrii, without photoperiod. The EC50;48H values to D. similis, C. dubia and C. silvestrii for the tests with reconstituted water (Milli-Q) without photoperiod, were: 0.218, 0.088 and 0.083 mg.L-1, respectively. The CEO for D. similis was 0.1 mg.L-1 and the IC50 value (malformation) for neonates was 0.057 mg.L-1. The CEO was 0.04 mg.L-1 for C.silvestrii, not being verified malformations in neonates. Seven stages were observed in the embryonic development of cladocerans with duration (hours) of 51 (± 5) to D. similis, 34 (± 3) to C. dubia and 36 (± 2) to C. silvestrii. The IC50 value (malformation) in the teratogenesis test was 0.075 mg.L-1 to D. similis, which is close to the value obtained for chronic toxicity.