Die Photodynamische Therapie (PDT) hat sich zunehmend als vielversprechende Methode zur Behandlung von verschiedenen malignen Neubildungen gezeigt. Die photodynamische Zerstörung der Tumore wird erreicht indem zunächst ein Photosensibilisator entweder lokal oder systemisch appliziert wird und im Anschluss an eine gewisse Inkubationszeit die Tumormasse mittels einer Lichtquelle mit einer spezifischen Wellenlänge durchleuchtet wird. Aufgrund der bevorzugten Anreicherung des Photosensibilisators in Tumorzellen, erlaubt diese Methode eine selektive Abtötung des malignen Tumors, während das umliegende Gewebe weitestgehend verschont wird. Diese Eigenschaften und Anforderungen machen die PDT, insbesondere in den Fällen, wo die chirurgische Enukleation als kurative Option erwogen wird, zu einer attraktiven Therapieoption in der Behandlung von Retinoblastomen (Rb). Die extreme Methode der Enukleation wird noch immer angewendet, wenn die Tumoren nicht ausreichend chemosensibel sind, oder wenn sich die Erkrankung aufgrund von unzureichendem Zugang zu medizinischer Versorgung bereits in einem fortgeschrittenen Stadium befindet. In dieser Studie haben wir zunächst In-Vitro-Untersuchungen mit dem neuen kationischen wasserlöslichen Photosensibilisator Tetrahydroporphyrin-Tetratosylat (THPTS) bezüglich seiner photodynamischen Wirkung auf WERI Rb-1 und Y79-Retinoblastomzellen durchgeführt. Dabei konnten wir zeigen, dass weder die Inkubation mit THPTS ohne anschließende Beleuchtung, noch die alleinige Beleuchtung zu einem signifikanten Effekt auf die Proliferation der Rb-Zellen führte. Die Kombination von THPTS mit anschließender Beleuchtung hingegen führte zu einem maximal zytotoxischen Effekt in den Tumorzellen. Darüber hinaus war die Phototoxizität in normalen Primärzellen des Pigmentepithels der Retina geringer, wodurch ein erhöhter phototoxischer Effekt von THPTS in Krebszellen gegenüber diesem normalen Zelltyp der Retina gezeigt werden konnte. Die vorliegenden Ergebnisse bilden eine ermutigende Grundlage für weiterführende in-vivo-Untersuchungen zum therapeutischen Potential dieses vielversprechenden Photosensibilisators mit der Aussicht auf eine potentiell kurative Therapie des Retinoblastoms unter Erhalt von Augapfel und Visus.

Die Photodynamische Therapie (PDT) hat sich zunehmend als vielversprechende Methode zur Behandlung von verschiedenen malignen Neubildungen gezeigt. Die photodynamische Zerstörung der Tumore wird erreicht indem zunächst ein Photosensibilisator entweder lokal oder systemisch appliziert wird und im Anschluss an eine gewisse Inkubationszeit die Tumormasse mittels einer Lichtquelle mit einer spezifischen Wellenlänge durchleuchtet wird. Aufgrund der bevorzugten Anreicherung des Photosensibilisators in Tumorzellen, erlaubt diese Methode eine selektive Abtötung des malignen Tumors, während das umliegende Gewebe weitestgehend verschont wird. Diese Eigenschaften und Anforderungen machen die PDT, insbesondere in den Fällen, wo die chirurgische Enukleation als kurative Option erwogen wird, zu einer attraktiven Therapieoption in der Behandlung von Retinoblastomen (Rb). Die extreme Methode der Enukleation wird noch immer angewendet, wenn die Tumoren nicht ausreichend chemosensibel sind, oder wenn sich die Erkrankung aufgrund von unzureichendem Zugang zu medizinischer Versorgung bereits in einem fortgeschrittenen Stadium befindet. In dieser Studie haben wir zunächst In-Vitro-Untersuchungen mit dem neuen kationischen wasserlöslichen Photosensibilisator Tetrahydroporphyrin-Tetratosylat (THPTS) bezüglich seiner photodynamischen Wirkung auf WERI Rb-1 und Y79-Retinoblastomzellen durchgeführt. Dabei konnten wir zeigen, dass weder die Inkubation mit THPTS ohne anschließende Beleuchtung, noch die alleinige Beleuchtung zu einem signifikanten Effekt auf die Proliferation der Rb-Zellen führte. Die Kombination von THPTS mit anschließender Beleuchtung hingegen führte zu einem maximal zytotoxischen Effekt in den Tumorzellen. Darüber hinaus war die Phototoxizität in normalen Primärzellen des Pigmentepithels der Retina geringer, wodurch ein erhöhter phototoxischer Effekt von THPTS in Krebszellen gegenüber diesem normalen Zelltyp der Retina gezeigt werden konnte. Die vorliegenden Ergebnisse bilden eine ermutigende Grundlage für weiterführende in-vivo-Untersuchungen zum therapeutischen Potential dieses vielversprechenden Photosensibilisators mit der Aussicht auf eine potentiell kurative Therapie des Retinoblastoms unter Erhalt von Augapfel und Visus.:Inhaltsverzeichnis Einleitung 1 Hintergrund und Bedeutung 1 Pathophysiologie 2 Diagnostik und Symptome 3 Klassifizierung 4 Therapie und Prognose 5 Enukleation 5 Perkutane Radiotherapie 6 Brachytherapie 6 Intravenöse Chemotherapie 6 Intraarterielle Chemotherapie 6 Laser-gestützte Verfahren 7 Photodynamische Therapie 7 Mechanismus 7 Eigenschaften von Photosensibilisatoren 8 THPTS-PDT 9 Fragestellung 9 THPTS-PDT on Human Retinoblastoma Cell Lines 11 Zusammenfassung 24 Einleitung 24 Methode 25 Zellkultur primärer humaner Pigmentepithelzellen der Retina (RPE) 25 Photodynamische Therapie von Retinoblastomzellen und RPE-Zellen 25 Clearance von THPTS 25 Real-Time RT-PCR 25 Immunzytochemie und Live-Videoaufnahmen 26 Ergebnisse 26 Effekt der THPTS-PDT auf Retinoblastom-Zelllinien 26 Effekt in Abhängigkeit von Dosis und Einwirkzeit 26 Wirkung der THPTS-PDT auf nicht-maligne Netzhautzellen im Vergleich zu Rb-Zellen 27 Verstoffwechselung von THPTS 27 Genexpression 27 Immunzytochemie und Live-Videoaufnahmen 28 Subzelluläre Anreicherung von THPTS 28 Diskussion 28 ii Literaturverzeichnis vi Anhang x Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit x Wissenschaftliche Publikationen xi

So far, glioblastomas cannot be cured by standard therapy and have an extremely poor median survival of about 15 months. The photodynamic therapy (PDT) with next generation photosensitizers, reaching a higher therapeutic depth, might offer a new, adjuvant treatment strategy in brain cancer therapy. Here, we investigated the effect of THPTS-PDT combined with ionizing irradiation (IR) on glioblastoma cells in vitro and in vivo. Results: THPTS colocalized to mitochondria and was not found in the nucleus. THPTS (2–20 μg/ml)-PDT significantly reduced the proliferation, metabolic activity and clonogenic survival and induced cell death mainly through apoptosis and autophagy. THPTS-PDT combined with IR decreased the clonogenicity significantly compared to single treatments. THPTS (≤ 300 μg/ml) alone showed no dark toxicity. The maximum therapeutic depth of THPTS-PDT in C6 glioblastomas was 13 mm. Materials and Methods: Three human glioblastoma cell lines (U-87 MG, A-172, DBTRG-05MG) were incubated with THPTS (1–300 μg/ml) 3–24 hours before laser treatment (760 nm, 30 J/cm²). THPTS localization and effects on metabolic activity, proliferation, cell death mechanisms and long-term reproductive survival were assessed. IR was conducted on an X-ray unit (0.813 Gy/min). Results were verified in vivo on a subcutaneous C6 glioblastoma model in Wistar rats. Conclusions: This study demonstrated efficient THPTS-PDT in glioblastoma cells, in vitro and in vivo. The combinatorial effects of THPTS-PDT and IR are of specific clinical interest as enhanced eradication of infiltrating glioblastoma cells in the tumor surrounding tissue might possibly reduce the commonly occurring local relapses.

Die photodynamische Therapie (PDT) ist eine minimalinvasive, zielgerichtete Therapie solider Tumore, die mit geringen Nebenwirkungen einhergeht. Unter dieser Behandlung zeigen sich ablative Effekte, Gefäßokklusionen und eine Immunstimulationen. Das Wirkprinzip besteht in der Photoaktivierung von nicht-toxischen, lichtreaktiven Photosensibilisatoren (PS), die durch Energieabgabe zur Bildung von Singulettsauerstoff führen, welcher reaktive Sauerstoffspezies bildet. Diese Produkte schädigen die Tumorzellen durch schnelle Inaktivierung lokal und lösen dadurch Apoptose- und Nekroseprozesse aus, wodurch Damage associated molecular patterns freigesetzt werden können. Diese Arbeit beschäftigt sich mit den Effekten der untersuchten PDT auf die Immunzellpopulationen im Harnblasenkarzinom. In der Therapie maligner Hanblasentumore ist kein Standardverfahren der PDT etabliert. Tetrahydroporphyrin-Tetratosylat (THPTS) als PS mit seinem Absorbtionsmaximum im nahen Infrarotbereich (760nm) ermöglicht eine Gewebepenetration von bis zu 15mm und damit die Therapie muskelinvasiver Tumore. Sicherheit und Effektivität durch eine signifikante Reduktion der Tumormasse sind an einem orthotopen Rattenharnblasenmodell, welches der vorliegenden Arbeit als Untersuchungsmaterial dient, nachgewiesen. Der Wirkpfeiler der Immunreaktion wurde im Vorfeld lichtmikroskopisch eruiert. Ziele der Arbeit Die vorgestellte Promotion soll eine Charakterisierung der primären lokalen adaptiven Immunreaktion durch die THPTS-PDT im Harnblasenkarzinom eines orthotopen Rattenmodells vornehmen. Methodik Die Harnblasengewebeschnitte stammen aus den Vorarbeiten der Forschungsgruppe. Als Versuchstiere wurden weibliche F344 Fischerratten verwendet, die einer Inzuchtlinie entstammen und sich als ein immunkompetentes orthotopes Harnblasenmodell eignen. Zur Bildung des Harnblasenkarzinoms wurden AY-27 Urothelkarzinomzellen verwendet. Zur Tumorinokulation wurden die Urothelkarzinomzellen transurethral in die Harnblase der Fischerratten instilliert. So bildeten sich innerhalb von zehn Tagen multifokale Harnblasenkarzinome unterschiedlicher Invasionstiefe. Am zehnten Tag erfolgte die THPTS-PDT. Die lokal behandelte Gruppe (LAG) erhielt den Wirkstoff transurethral. Bei der systemisch behandelten Gruppe (SAG) wurde der Wirkstoff i.v. verabreicht. Die Kontrollgruppe (COG) erhielt Phosphat-gepufferte Saline transurethral. Daraufhin wurden die Gruppen mithilfe einer Glasfaser mit einem 760nm-Laser bestrahlt. Nach 14d wurden die Tiere getötet und die Harnblasen entnommen. Es konnten Schnitte von insgesamt n=26 Ratten untersucht werden: nicht-bestrahlte Kontrollgruppe (COG, n=9), lokale Applikation von THPTS (LAG, n=8), systemische Applikation von THPTS (n=4). Das Gewebe wurde immunhistochemisch für die Fluoreszenzmikrokopie nach einem standardisierten Protokoll gefärbt. Dazu erfolgte das Entparaffinieren und die Antigendemaskierung mittels basischen Puffers im Dampfgarer und Dimethylsulfoxid-Triton X-100-Tris-buffered-Saline. Es wurde mit bovinem Serumalbumin und Ziegen-Normalserum für 2h geblockt und mit den Primärantikörpern zur Doppelmarkierung über Nacht inkubiert. Die genutzten Primärantikörperkombinationen sind CD45/CD3, CD3/CD8, CD3/CD4 und CD19. Danach wurden fluoreszierende oder biotinylierte Sekundärantikörper genutzt, wobei letztere wiederum mit fluoreszierendem Streptavidin gekoppelt wurden. Schließlich erfolgte die Kernmarkierung mittels Diamino-Phenylindol (DAPI). Zu jeder Färbung wurde eine Negativkontrolle angefertigt. Die Antikörper wurden in Gewebe mit erhöhter Expression der Zielepitope etabliert und daraufhin auf das Rattenharnblasengewebe übertragen sowie für die Doppelimmunfluoreszenz kombiniert. Die Bildaufnahmen erfolgten mithilfe des konfokalen Laser-Scanning-Mikroskops mit einem Plan- Apochromat 40x/0.95 Luft-Objektiv. Jede Aufnahme besteht aus vier Kanälen entsprechend der genutzten Laser: 405nm für die Kerne, 488nm für die Mausantikörper, 561nm für die Kaninchenantikörper und eine Durchlichtaufnahme zur Strukturdarstellung. Jeweils neun Bilder bilden eine quadratische Feldaufnahme mit Ausnahme der Lymphzellcluster, bei denen sich die zusammengefügten Bilder nach der Größe richten. Pro Bereich wurden abhängig von der Ausdehnung maximal fünf Feldaufnahmen angerfertigt. Die Bereiche sind Tumorzentrum, Tumorrand, tumorfreier Bereich und Lymphzellcluster. Letztere sind als Lymphzellansammlungen im Harnblasengewebe unabhängig vom Tumor definiert. Zu analysierende Bereiche (ROI, regions of interest) wurden manuell definiert und mithilfe der Software Fiji (ImageJ2) und einem eigens programmierten Macro die Fläche und die positiv markierten Zellen ermittelt. Die statistische Analyse erfolgte mittels der Software Graph Pad Prism 9.3.1 mit einem Signifikanzniveau von p<0,05%. Ergebnisse Der Datensatz besteht aus insgesamt 1732 Feldaufnahmen, die sich wiederum aus über 14500 High- Powerfield-Bildern zusammensetzen und analysiert wurden. Für die Färbungen ergeben sich pro Tumorareal aufgeschlüsselt auf die Harnblasenbereiche folgende Anzahl an Mittelwerten zur statistischen Analyse: Tumorzentrum COG 24, LAG 15-17, SAG 9-10; Tumorrand COG 23-24, LAG 16-17, SAG 9-10; Tumorfreier Bereich COG 18-19, LAG 12-14, SAG 8; Lymphzellcluster COG 10-15, LAG 16-21, SAG 3-5 Folgende Immunfluoreszenzmarkierungen konnten etabliert werden: CD45-Antikörper zur Darstellung der gesamten Leukozytenpopulation, CD3-Antikörper für die T-Zellen, CD8-Antikörper für den Subtyp der zytotoxischen T-Zellen (CTL), der CD4-Antikörper für den Subtyp der T-Helferzellen (TH) und der CD19-Antikörper für die B-Zellen. Kreuzreaktionen bzw. Hintergrundfluoreszenz traten vor allem im Tumorstroma und dem Endothel bei CD45-, CD19- und CD4-Antikörper auf. Das Signal-Rausch- Verhältnis war jedoch in den meisten Fällen aufgrund der intensiveren Markierung der Lymphozyten- Zellmembranen für die quantitative Analyse ausreichend. Lediglich die Markierung der T-Helferzellen mit dem CD4-Antikörper bereitete durch stärkere Kreuzreaktivitäten Probleme. In der quantitativen Analyse zeigen sich folgende signifikante Ergebnisse: - Reduzierte T-Zelldichte (CD3) der SAG gegenüber der COG im tumorfreien Bereich - Erhöhte T-Zelldichte (CD45/CD3) der SAG gegenüber der LAG im Tumorrand - Reduzierte cytotoxische T-Zelldichte (CD3/CD8) der SAG gegenüber der COG im tumorfreien Bereich - Reduzierte T-Helferzellen (CD3/CD4) der LAG gegenüber der COG im Tumorrand Zieht man die nicht signifikanten Tendenzen der einzelnen Gruppen mit in Betracht, besteht eine verstärkte Immunzelldichte im Tumorzentrum der LAG, wohingegen eine Abnahme dieser im Tumorrand auffällt. Die SAG weist punktuell Reduktionen in der Peripherie, nämlich den tumorfreien Bereichen und Lymphzellclustern auf. Veränderungen im gesamten Tumorbereich, zusammengefasst aus -center und -rand, sind in keiner Immunzellmarkierung vorhanden. Diskussion Die Auswahl der Antikörper erfolgte gemäß aktueller Literatur. Die Spezifität der Immunzellmarkierungen wurde durch die Verwendung von Doppelmarkierungen erhöht. Die Auswahl der untersuchten Bereiche (Tumorzentrum, Tumorrand, tumorfreie Region und Lymphzellcluster) ergeben ein Gesamtbild der Aktivierung des Immunsystems in der Harnblase und erreichen durch die Zahl von insgesamt 1272 Feldaufnahmen des Tumorbereichs eine hohe Repräsentativität. In der Literatur wird die zentrale Stellung der Immunreaktion durch verschiedene PDTs für die Metastasen- und Rezidivkontrolle beschrieben. Dieser Effekt konnte anhand der vorliegenden Ergebnisse nicht untersucht werden. Bei Betrachtung des gesamten Tumorbereichs zeigen sich in keiner Immunzellmarkierung signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen, was eine zusätzliche primäre Tumorkontrolle unwahrscheinlich werden lässt. Hinweise auf Einflüsse auf die Ausbildung einer differenzierten Anti-Tumor-Immunität lassen sich in einer Reduktion der Immunzelldichte im Tumorrand der LAG bei T- und T-Helferzellen und ebenfalls eine Verringerung bei T- und T-Killerzellen in der Peripherie der SAG sehen. Diese Ergebnisse könnten auf eine Migration bei der LAG ins Tumorzentrum und bei der SAG zum Tumorrand verweisen, die sich auch in der tendenziell erhöhten Immunzelldichte des Tumorzentrums der LAG widerspiegelt. Systemische Anti-Tumor-Effekte bleiben so weiterhin vorstellbar. In der vorliegenden Arbeit wurde das Hauptaugenmerk auf die Erfassung der Dichte von Immunzellen in den relevanten Bereichen gelegt. Eine Analyse der Aktivität z.B. der CTL erfolgte nicht. Der Einfluss von Immunzellen auf die Prognose des Harnblasenkarzinoms wird kontrovers diskutiert und ist nicht eindeutig einzuordnen. Kombinationstherapien mit ionisierender Strahlung, Checkpointinhibitoren oder Low-Dose Cyclophosphamid könnten verbesserte Resultate in zukünftigen Arbeiten ermöglichen. Weiterhin sollte ein Augenmerk auf den Zeitrahmen zur Detektion von immunogenen Effekten gelegt werden, vor allem, um akute (48 Stunden) und langfristige (bis zu 90 Tagen) zu detektieren. Subtypenanalyse von T-Helfer- und zytotoxischen T-Zellen sollten erfolgen, um die Anti-Tumor- Immunität differenzierter beurteilen zu können.:1 Abkürzungsverzeichnis 2 Einleitung 2.1 Urothelkarzinom 2.1.1 Epidemiologie und Ätiologie des Urothelkarzinoms 2.1.2 Aktuelle Therapieoptionen des muskelinvasiven Harnblasenkarzinoms 2.2 Anti-Tumor-Immunität 2.2.1 Ausgewählte Prozesse des Immunsystems zum Verständnis der Anti-Tumor-Immunität 2.2.2 Tumormicroenvironment 2.2.3 Übersicht über die Hauptformen des Zelltods und immunmodulatorische Effekte 2.2.4 Damage associated molecular patterns 2.2.5 Tumorantigene 2.3 Photodynamische Therapie 2.3.1Wirkprinzip 2.3.2 Photosensibilisatoren 2.3.3 Einfluss der PDT auf das Immunsystem 2.3.4 Die PDT des Harnblasenkarzinoms 2.3.5 Tetrahydroporphyrin-Tetratosylat: Ein neuer Photosensibilisator zur Therapie des MIBC 3 Ziele der Arbeit 4 Material und Methoden 4.1 Materialien 4.1.1 Asservierte Harnblasengewebeschnitte 4.1.2 Liste der Reagenzien, Verbrauchsmaterialien, Software und Geräte 4.2 Methoden 4.2.1 Vorarbeiten der Forschungsgruppe 4.2.2 Färbeprotokoll Immunfluoreszenz 4.2.3 Etablierung der Antikörper 4.2.4 Aufnahmetechnik 4.2.5 Datenerhebung 4.2.6 Statistik 5 Ergebnisse 5.1 Versuchstiere 5.2 Charakterisierung desDatensatzes 5.3 Qualitative Auswertung 5.4 Quantitative Auswertung 5.4.1 Vergleich der Immunzelldichte in Abhängigkeit von der Behandlung 5.4.1.1 CD45 5.4.1.2 CD3 5.4.1.3 CD8 5.4.1.4 CD4 5.4.1.5 CD19 5.4.1.6 CD45/CD3 5.4.1.7 CD3/CD8 5.4.1.8 CD3/CD4 5.4.1.9 Deskriptive und analytische Daten der Statistik 5.4.1.10 Zusammenfassung des Vergleichs der Immunzelldichten 6 Diskussion 6.1 Methodendiskussion 6.1.1 Auswahl der Antikörper 6.1.2 Beurteilung der CD3-Antikörper 6.1.3 ROI-Auswahl und Beurteilung des Datensatzes 6.2 Ergebnisdiskussion 6.2.1 Beurteilung der Immunreaktion der THPTS-PDT im Kontext anderer PDTs 6.3 Beurteilung der Immunreaktionen beim Harnblasenkarzinom 6.4 Aussichtsreiche Kombinationstherapien 6.5 Umgang mit Schwierigkeiten 7 Schlussbemerkung 8 Zusammenfassung 9 Darstellungsverzeichnis 9.1 Abbildungen 9.2 Tabellen 10 Literaturverzeichnis 11 Anlagen 11.1 Färbeprotokolle 11.1.1 Immunfluoreszenz Doppelmarkierung CD45/CD3 11.1.2 Immunfluoreszenz Doppelmarkierung CD3/CD4 11.1.3 Immunfluoreszenz Doppelmarkierung CD3/CD8 11.1.4 Immunfluoreszenz Einfachmarkierung CD19 11.1.5 Lichtmikroskopie Standardprotokoll in der Etablierungsphase 12 Selbstständigkeitserklärung 13 Lebenslauf 14 Publikationen 15 Danksagung

Multimodal treatment adding immunotherapy and photodynamic treatment (PDT) to standard therapy might improve the devastating therapeutic outcome of glioblastoma multiforme patients. As a first step, we provide investigations to optimize dendritic cell (DC) vaccination by using PDT and ionizing radiation (IR) to achieve maximal synergistic effects. In vitro experiments were conducted on murine glioblastoma GL261 cells, primary DCs differentiated from bone marrow and T cells, isolated from the spleen. Induction of cell death, reactive oxygen species, and inhibition of proliferation by tetrahydroporphyrin-tetratosylat (THPTS)-PDT and IR were confirmed by WST-1, LDH, ROS, and BrdU assay. Tumor cargo (lysate or cells) for DC load was treated with different combinations of THPTS-PDT, freeze/thaw cycles, and IR and immunogenicity analyzed by induction of T-cell activation. Cellular markers (CD11c, 83, 86, 40, 44, 69, 3, 4, 8, PD-L1) were quantified by flow cytometry. Cytotoxic T-cell response was evaluated by calcein AM assay. Immunogenicity of THPTS-PDT-treated GL261 cells lysate was superior to IR-treated lysate, or treated whole cells proven by increased DC phagocytosis, T-cell adhesion, proliferation, cytolytic activity, and cytokine release. These data strongly support the application of PDT together with IR for optimal immunogenic cell death induction in tumor cell lysate used to pulse DC vaccines.