L'analyse de la réponse lymphocytaire T représente une exploration de plus en plus importante pour la compréhension de la physiopathologie de maladies et le suivi de protocoles d'immunothérapie. La mise en évidence de la production de cytokines par ces cellules permet d'identifier les sous populations de lymphocytes T (LT) et d'analyser leur fonctionnalité et leur état d'activation. L'Elispot est une technique déjà largement utilisée dans le suivi de la réponse vaccinale pour la détection de cellules sécrétrices de cytokines. Bien que la séroprotection soit le critère reconnu pour déterminer l'efficacité de la vaccination antigrippale, un rôle important de la réponse lymphocytaire T a été démontré dans le contrôle de l'infection. Nos travaux ont permis de mettre en évidence que l'utilisation de vaccins totaux pour le suivi de la réponse lymphocytaire T, par l'introduction de leurs excipients, peut induire un biais dans la détection des cytokines. Le thimérosal, conservateur utilisé dans certains vaccins, provoque in vitro lors de la détection d'interféron (IFN) par Elispot l'apparition de petits spots que nous avons associés a l'activation abortive précoce des LT. Leur taille permet cependant d'éliminer automatiquement du comptage ces spots non spécifiques. Contrairement à l'Elispot dont elle est dérivée, la technique Fluorospot permet l'analyse simultanée de plusieurs cytokines et est donc plus adaptée à la détection des profils de sécrétion et de la fréquence des LT polyfonctionnels, associés à un bon pronostic dans plusieurs pathologies. Nos résultats ont permis la validation technique de ce test pour la détection des couples IFN/interleukine (IL)-10 et IFN/IL-2. Grâce au développement au laboratoire d'une lignée produisant de l'IFN et l'IL-10, nous avons montré que le Fluorospot avait une sensibilité supérieure à la cytométrie intracellulaire pour la détection de l'IFN et de l'IL-10. Il était déjà connu que l'IL-10 était difficilement détectable par cytométrie, renforçant l'intérêt du Fluorospot pour détecter les cellules Tr1. L'utilisation du Fluorospot lors du suivi de la réponse vaccinale antigrippale a également permis de démontrer une équivalence de sensibilité avec l'Elispot. Au cours du suivi de ce protocole anti-grippal, nous avons montré à l'aide du Fluorospot que la réponse LT antigrippale était surtout caractérisée par une forte production d'IL-2 et que la détection isolée d'IFN a une faible sensibilité pour la mesure des réponses LT anti-grippales. Il s'agit de la première utilisation de ce test pour le suivi d'un protocole vaccinal démontrant sa robustesse et sa faisabilité dans un contexte clinique. Nos résultats offrent donc une validation complète de la technique Fluorospot, aussi bien du point de vue technique que clinique, ouvrant des perspectives d'utilisation pour le suivi de futurs protocoles. / The detection of cellular response via its different T cell subpopulations was proved to be crucial to better understand mechanisms of pathologies and monitor protocols of immunotherapy. Unicellular cytokine measurement not only allows the assessment of their inherent role on immunological response, but also the detection of T lymphocytes (LT) secretion profile which gives information on subpopulations involved, their activation state and their functionality. Detection of the cytokine secreting cells frequency is achievable with Elispot. This test is widely used in clinical trials to monitor vaccine response to diseases such as influenza. Although seroprotection is the recognized parameter to assess anti-influenza vaccine efficiency, cellular response has been proved to play an important role in infection control. Our results highlighted that the use of the whole vaccine to monitor T cell response may induce bias in cytokine detection. Indeed, their excipients can be considered as contaminants, like Thimerosal which is used as a preservative in some vaccines. We demonstrated that it induced detection of small spots in interferon (IFN) Elispot. We proved that these spots were associated with in vitro early abortive T cell activation. However, their size enabled us to remove these unspecific spots from bona fide spots.Fluorospot test is suited for multiplex cytokine analysis. Thus it is more adapted than Elispot to detect cytokine secretion profiles and polyfunctional T cells frequency. It is worth noting that polyfunctionnal Tcells are associated with a better clinical outcome in several pathologies. Our results led to technical validation of this test for detection of two cytokines couples, IFN/interleukin (IL)-10 and IFN/IL-2. Fluorospot showed a better sensitivity than intracellular staining cytometry (ICS) in detection of IFN and IL-10 produced by a cell line transfected with the cDNA encoding these cytokines. Moreover, Fluorospot demonstrated a similar sensitivity than Elispot when used to monitor the immunological response to an anti-influenza vaccine. Furthermore, using this technique, we showed that anti-influenza T cell producing IL-2 were the dominant population of T cells. Isolated IFN producing T cells were less sensitive than the detection of IL-2 to detect specific T cell response against influenza. Therefore our results provided a full validation of Fluorospot test, for the technical part as well as for the clinical part. These conclusions open perspectives of using this method to monitor protocols in a near future.

Bei Thiomersal handelt es sich um ein quecksilberhaltiges Konservierungsmittel in Medizinprodukten, welches auch in Impfstoffen Verwendung findet. In dieser Arbeit wurden die Toxizität von Thiomersal und von Glutathionkonjugaten seiner Dissoziationsprodukte sowie zum Vergleich die Toxizität von zwei strukturell mit Thiomersal bzw. seinen Metaboliten verwandten Referenzsubstanzen, p-Chlormercuribenzoesäure und Ethylquecksilberchlorid, in Zellsystemen mit humanen Zellen vom Typ A-549 und Hep-G2 untersucht. Alle fünf Substanzen führten zu einer dosisabhängigen Vitalitätsreduktion bei beiden Zelllinien. Die stärkste Vitalitätsreduktion wurde durch Ethylquecksilberchlorid erzielt, danach folgten in absteigender Reihenfolge Thiomersal, Ethylquecksilber-L-Glutathion und p-Chlormercuribenzoesäure. Den schwächsten vitalitätsreduzierenden Effekt zeigte Thiosalicyl-L-Glutathion-Disulfid. Diese Ergebnisse sprechen dafür, dass die Glutathion-Konjugation von Thiomersal zu einer Abschwächung der Toxizität im menschlichen Organismus führt und untermauern die Annahme einer protektiven Wirkung von Glutathion. Die giftende Rolle von Glutathion in Bioaktivierungsprozessen anderer Noxen wird diskutiert. Es wurde im Rahmen dieser Arbeit ein Beitrag zum besseren Verständnis der Toxizität von Thiomersal im humanen Organismus geleistet und darüber hinaus Bezüge zum potentiellen allergenen Potential von Thiomersal hergestellt.

Bei Thiomersal handelt es sich um ein quecksilberhaltiges Konservierungsmittel in Medizinprodukten, welches auch in Impfstoffen Verwendung findet. In dieser Arbeit wurden die Toxizität von Thiomersal und von Glutathionkonjugaten seiner Dissoziationsprodukte sowie zum Vergleich die Toxizität von zwei strukturell mit Thiomersal bzw. seinen Metaboliten verwandten Referenzsubstanzen, p-Chlormercuribenzoesäure und Ethylquecksilberchlorid, in Zellsystemen mit humanen Zellen vom Typ A-549 und Hep-G2 untersucht. Alle fünf Substanzen führten zu einer dosisabhängigen Vitalitätsreduktion bei beiden Zelllinien. Die stärkste Vitalitätsreduktion wurde durch Ethylquecksilberchlorid erzielt, danach folgten in absteigender Reihenfolge Thiomersal, Ethylquecksilber-L-Glutathion und p-Chlormercuribenzoesäure. Den schwächsten vitalitätsreduzierenden Effekt zeigte Thiosalicyl-L-Glutathion-Disulfid. Diese Ergebnisse sprechen dafür, dass die Glutathion-Konjugation von Thiomersal zu einer Abschwächung der Toxizität im menschlichen Organismus führt und untermauern die Annahme einer protektiven Wirkung von Glutathion. Die giftende Rolle von Glutathion in Bioaktivierungsprozessen anderer Noxen wird diskutiert. Es wurde im Rahmen dieser Arbeit ein Beitrag zum besseren Verständnis der Toxizität von Thiomersal im humanen Organismus geleistet und darüber hinaus Bezüge zum potentiellen allergenen Potential von Thiomersal hergestellt.

Bei Thiomersal handelt es sich um ein quecksilberhaltiges Konservierungsmittel in Medizinprodukten, welches auch in Impfstoffen Verwendung findet. In dieser Arbeit wurden die Toxizität von Thiomersal und von Glutathionkonjugaten seiner Dissoziationsprodukte sowie zum Vergleich die Toxizität von zwei strukturell mit Thiomersal bzw. seinen Metaboliten verwandten Referenzsubstanzen, p-Chlormercuribenzoesäure und Ethylquecksilberchlorid, in Zellsystemen mit humanen Zellen vom Typ A-549 und Hep-G2 untersucht. Alle fünf Substanzen führten zu einer dosisabhängigen Vitalitätsreduktion bei beiden Zelllinien. Die stärkste Vitalitätsreduktion wurde durch Ethylquecksilberchlorid erzielt, danach folgten in absteigender Reihenfolge Thiomersal, Ethylquecksilber-L-Glutathion und p-Chlormercuribenzoesäure. Den schwächsten vitalitätsreduzierenden Effekt zeigte Thiosalicyl-L-Glutathion-Disulfid. Diese Ergebnisse sprechen dafür, dass die Glutathion-Konjugation von Thiomersal zu einer Abschwächung der Toxizität im menschlichen Organismus führt und untermauern die Annahme einer protektiven Wirkung von Glutathion. Die giftende Rolle von Glutathion in Bioaktivierungsprozessen anderer Noxen wird diskutiert. Es wurde im Rahmen dieser Arbeit ein Beitrag zum besseren Verständnis der Toxizität von Thiomersal im humanen Organismus geleistet und darüber hinaus Bezüge zum potentiellen allergenen Potential von Thiomersal hergestellt.

Bei Thiomersal handelt es sich um ein quecksilberhaltiges Konservierungsmittel in Medizinprodukten, welches auch in Impfstoffen Verwendung findet. In dieser Arbeit wurden die Toxizität von Thiomersal und von Glutathionkonjugaten seiner Dissoziationsprodukte sowie zum Vergleich die Toxizität von zwei strukturell mit Thiomersal bzw. seinen Metaboliten verwandten Referenzsubstanzen, p-Chlormercuribenzoesäure und Ethylquecksilberchlorid, in Zellsystemen mit humanen Zellen vom Typ A-549 und Hep-G2 untersucht. Alle fünf Substanzen führten zu einer dosisabhängigen Vitalitätsreduktion bei beiden Zelllinien. Die stärkste Vitalitätsreduktion wurde durch Ethylquecksilberchlorid erzielt, danach folgten in absteigender Reihenfolge Thiomersal, Ethylquecksilber-L-Glutathion und p-Chlormercuribenzoesäure. Den schwächsten vitalitätsreduzierenden Effekt zeigte Thiosalicyl-L-Glutathion-Disulfid. Diese Ergebnisse sprechen dafür, dass die Glutathion-Konjugation von Thiomersal zu einer Abschwächung der Toxizität im menschlichen Organismus führt und untermauern die Annahme einer protektiven Wirkung von Glutathion. Die giftende Rolle von Glutathion in Bioaktivierungsprozessen anderer Noxen wird diskutiert. Es wurde im Rahmen dieser Arbeit ein Beitrag zum besseren Verständnis der Toxizität von Thiomersal im humanen Organismus geleistet und darüber hinaus Bezüge zum potentiellen allergenen Potential von Thiomersal hergestellt.

Bei Thiomersal handelt es sich um ein quecksilberhaltiges Konservierungsmittel in Medizinprodukten, welches auch in Impfstoffen Verwendung findet. In dieser Arbeit wurden die Toxizität von Thiomersal und von Glutathionkonjugaten seiner Dissoziationsprodukte sowie zum Vergleich die Toxizität von zwei strukturell mit Thiomersal bzw. seinen Metaboliten verwandten Referenzsubstanzen, p-Chlormercuribenzoesäure und Ethylquecksilberchlorid, in Zellsystemen mit humanen Zellen vom Typ A-549 und Hep-G2 untersucht. Alle fünf Substanzen führten zu einer dosisabhängigen Vitalitätsreduktion bei beiden Zelllinien. Die stärkste Vitalitätsreduktion wurde durch Ethylquecksilberchlorid erzielt, danach folgten in absteigender Reihenfolge Thiomersal, Ethylquecksilber-L-Glutathion und p-Chlormercuribenzoesäure. Den schwächsten vitalitätsreduzierenden Effekt zeigte Thiosalicyl-L-Glutathion-Disulfid. Diese Ergebnisse sprechen dafür, dass die Glutathion-Konjugation von Thiomersal zu einer Abschwächung der Toxizität im menschlichen Organismus führt und untermauern die Annahme einer protektiven Wirkung von Glutathion. Die giftende Rolle von Glutathion in Bioaktivierungsprozessen anderer Noxen wird diskutiert. Es wurde im Rahmen dieser Arbeit ein Beitrag zum besseren Verständnis der Toxizität von Thiomersal im humanen Organismus geleistet und darüber hinaus Bezüge zum potentiellen allergenen Potential von Thiomersal hergestellt.

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[pt] O tiomersal é um composto organomercurial usado como conservante em vacinas. Sua degradação sob exposição luz visível ou ao UV produz ácido tiosalicílico, ácido ditiobenzóico e etilmercúrio. A inclusão do tiomersal em composições vacinais é controversa, pois alguns estudos apontam sua correlação com neurotoxicidade, porém, outras investigações ressaltam a sua segurança. O objetivo desse estudo foi avaliar o grau de degradação do tiomersal sob influência de luz, pH, temperatura e material da embalagem, mediante a comparação de três técnicas analíticas. Adicionalmente, foi avaliado o efeito de excipientes vacinais. Conduziu-se uma investigação, inicialmente por espectrofotometria de absorção molecular no UV-vis, em relação à foto-exposição e presença dos excipientes. Para apoiar a confiabilidade dos resultados, testes estatísticos foram realizados. Para a análise da formação de quantidades ultra-traço de espécies mercuriais (etilmercúrio e mercúrio inorgânico), técnicas de maior sensibilidade como a espectrometria de absorção atômica e de fluorescência atômica acoplada à cromatografia gasosa foram utilizadas. Os resultados revelaram degradação do tiomersal sob exposição ao UV. A presença de excipientes durante a foto-irradiação demonstrou efeitos variados na estabilidade do tiomersal, com alguns excipientes favorecendo a degradação. Além disso, o material do recipiente foi relevante e as variações de temperatura e pH não afetaram significativamente a estabilidade. O tiomersal manteve-se estável na maioria dos testes que envolvia condições reais de armazenamento de vacinas. Essas descobertas contribuem para a compreensão do comportamento do conservante frente a fatores potenciais que influenciam sua estabilidade, subsidiando o desenvolvimento e armazenamento de vacinas, garantindo sua eficácia e segurança. / [en] Thiomersal is an organomercury compound used as a preservative in vaccines. Its degradation under exposure to visible light or UV produces thiosalicylic acid, dithiobenzoic acid and ethylmercury. The inclusion of thiomersal in vaccine compositions is controversial, as some studies indicate its correlation with neurotoxicity, , however, other investigations emphasize its safety. The objective of this study was to evaluate the degree of degradation of thiomersal under the influence of light, pH, temperature and packaging material, by comparing three analytical techniques. Additionally, the effect of vaccine excipients was evaluated. An investigation was conducted, initially by UV-vis molecular absorption spectrophotometry, regarding photo-exposure and the presence of excipients. To support the reliability of the results, statistical tests were performed. To analyze the formation of ultra-trace amounts of mercury species (ethylmercury and inorganic mercury), highly sensitive techniques such as atomic absorption and atomic fluorescence spectrometry coupled to gas chromatography were used. The results revealed degradation of thiomersal under UV exposure. The presence of excipients during photoirradiation demonstrated varying effects on the stability of thiomersal, with some excipients favoring degradation. Furthermore, the container material was relevant and variations in temperature and pH did not significantly affect stability. Therefore, thiomersal remained stable in most tests involving real vaccine storage conditions. These findings contribute to the understanding of preservative behavior in the face of potential factors that influence its stability, supporting the development and storage of vaccines, ensuring their efficacy and safety.