Eine ausgeprägte Mundtrockenheit, Xerostomie, entsteht häufig durch eine irreversible Funktionseinschränkung der Speicheldrüsen. Diese ist unter anderem durch die Einnahme bestimmter Medikamente, Autoimmunerkrankungen, fortgeschrittenes Alter oder die Bestrahlungstherapie von Tumoren der Kopf-Hals-Region bedingt, wobei letztere eine der häufigsten Ursachen darstellt. Konsequenzen der eingeschränkten Drüsenfunktion sind herabgesetzte Speichelflussraten, eine Reduktion des Mund-pH-Werts, eine veränderte Elektrolyt- und Immunglobulin-Zusammensetzung des Speichels und somit eine Verringerung des Infektionsschutzes. Die resultierenden Komplikationen erstrecken sich von Karies und rezidivierenden Infektionen bis hin zu Pilzbesiedelungen der Mundschleimhaut. Diese schränken die Lebensqualität der Patienten stark ein und führen häufig zu Therapieunterbrechungen. Fast die Hälfte der Patienten leidet unter Depressionen oder psychischen Belastungszuständen. Es gibt wenige Therapieansätze zur Behandlung der postradiogenen Xerostomie: Pilocarpin erhöht zwar die Speichelflussraten, hat jedoch keinen signifikanten Effekt auf die Lebensqualität. Die operative Translokation der Glandula submandibularis hat den Weg in die klinische Routine noch nicht gefunden, während die intensitätsmodulierte Bestrahlung (IMRT) nicht für jeden Patienten geeignet ist; beide zeigen jedoch einen positiven Effekt auf die Lebensqualität. Gentechnische und stammzellbasierte Ansätze zur Regeneration des Drüsengewebes befinden sich im Experimentalstadium. Somit ergibt sich ein dringender Bedarf an innovativen Optionen zur Behandlung der postradiogenen Xerostomie. Das Tissue Engineering, die Erstellung einer künstlichen Speicheldrüse aus körpereigenen Zellen, böte hier ein potentielles Behandlungskonzept. Diese Studie soll deshalb untersuchen, ob humane Speicheldrüsenepithelzellen (hSEZ) auf einer Matrix aus dezellularisiertem, porzinem Jejunum, der sogenannten Small intestinal submucosa + mucosa (SIS-muc), kultiviert werden können. Können die Zellen innerhalb der Wachstumsperiode wichtige physiologische Differenzierungsmarker beibehalten? Kann die Produktion von α-Amylase, einem der wichtigsten Enzyme des menschlichen Speichels, erhalten werden? Welchen Einfluss hat die Kokultur mit mikrovaskulären Endothelzellen (mvEZ)? Und zuletzt: Ist dezellularisierter Schweinedarm eine potentiell geeignete Matrix für das Tissue Engineering der menschlichen Speicheldrüse? Zunächst erfolgte die Entnahme von humanem Speicheldrüsengewebe, woraus hSEZ isoliert wurden. Diese wurden dann sowohl in Mono- als auch in Kokultur mit mvEZ auf die SIS-muc aufgebracht und auf dieser kultiviert. Die SIS-muc wurde aus kurzen Schweinedarm-Segmenten gewonnen, die in einem mehrstufigen Verfahren dezellularisiert wurden. Die besiedelte SIS-muc wurde mittels konventioneller sowie Immunfluoreszenzfärbungen, Raster- und Transmissionsektronenmikroskopie (REM/TEM) sowie quantitativer Polymerasekettenreaktion (qPCR) untersucht, darüber hinaus erfolgte die Messung der α-Amylase-Enzymaktivität. Histologisch sowie in der REM zeigte sich sowohl in der Mono- als auch in der Kokultur eine konfluente Besiedelung der SIS-muc mit hSEZ. In der Kokultur formten mvEZ einen Monolayer auf der serosalen Matrixseite. Bei der Charakterisierung der hSEZ zeigte sich in den Immunfluoreszenzaufnahmen eine starke Ausprägung von Zytokeratin, α-Amylase und Aquaporin-5 und eine moderate Ausprägung von Claudin-1. Bei der Untersuchung der Funktion der α-Amylase konnte in der Kokultur von hSEZ mit mvEZ eine im Gegensatz zur Mono- und 2D-Kultur signifikant erhöhte Enzymaktivität der α-Amylase nachgewiesen werden. In der qPCR-Analyse der α-Amylase-Genexpression war die 3D-Kultur der 2D-Kultur überlegen. Die vorliegende Arbeit zeigt, dass die Kultur von hSEZ auf der SIS-muc möglich ist. Es konnte nachgewiesen werden, dass die Zellen in 3D-Kultur spezifische Differenzierungsmerkmale beibehalten, die in der 2D-Kultur teils verloren gehen und dass hSEZ in Kokultur mit mvEZ eine gegenüber der Monokultur signifikant erhöhte Produktion von α-Amylase aufweisen. Diese Arbeit liefert die Datengrundlage für zukünftige Studien im dynamischen Bioreaktor-Modell (BioVaSc), die auf dem Weg zur klinischen Translation notwendig sind. Somit stellt sie einen wichtigen Schritt in Richtung einer auf Tissue Engineering basierten Therapie der belastenden Xerostomie dar. / Xerostomia or dryness of the mouth often results from irreversible loss of function of the salivary glands. This medical condition can either be induced by certain drugs, autoimmune diseases, high age or radiotherapy of head and neck cancer with the latter being one of the most common causes. Impaired glands lead to a decrease in saliva flow rate as well as pH level inside the mouth and cause an alteration in the composition of saliva (e.g. electrolytes, immunoglobulins) lowering its anti-inflammatory capacity. Complications imply caries and recurring infections as well as mycosis of the oral cavity which negatively impact the patients’ quality of life, often leading to therapy interruptions. Moreover, almost half of the patients suffer from depression or other mental disorders. The treatment of radiogenic xerostomia is based on only a few therapeutic approaches currently available: Pilocarpin increases saliva flow rate yet does not significantly improve the patiens’ quality of life or reduce mucositis. Although indicating positive effects on quality of life, operative translocation of the submandibular gland has not yet been established in the clinical routine, while intensity modulated radiotherapy (IMRT) is not suitable for every patient. On the other hand, genetic or stem-cell-based approaches for regeneration of salivary gland tissue are still at an experimental stage. Thus, there is a strong demand for innovative options for the treatment of radiation-induced xerostomia which could potentially be supplied by an approach based on the tissue engineering of the salivary gland using autologous cells. The aim of this study is to investigate, whether human salivary gland epithelial cells (hSGEs) can be cultured on a scaffold made from decellularized porcine jejunum, the so-called small intestinal submucosa (SIS-muc). Do the cells maintain the expression of certain cellular markers over the given cell culture time? Can the production of α-amylase, a key enzyme of human saliva, be perpetuated? And lastly: Is the SIS-muc an appropriate scaffold for the tissue engineering (TE) of the human salivary gland? To examine this, human salivary gland tissue was obtained and salivary gland epithelial cells were isolated. The cells were cultured both in mono- and co-culture with microvascular endothelial cells (mvECs) on the SIS-muc. Colonized SIS-muc was analyzed in H&E and immunofluorescence stainings, scanning- and transmission electron microscopy as well as quantitative polymerase chain reaction (qPCR). Furthermore, enzyme activity of α-amylase was quantified. H&E stainings as well as scanning electron microscopy (SEM) revealed a confluent cell layer of hSGECs on the scaffold both in mono-and co-culture. Immunofluorescence stainings indicated a strong expression of cytoceratin, α-amylase and aquaporin-5 and a moderate expression of claudin-1. Enzyme assay revealed that SGECs co-cultured with mvECs yielded a significantly increased activity of α-amylase compared to the monocultured cells. Quantitative PCR (qPCR) indicated an increase in α-amylase gene expression in 3D-culture compared to 2D-culture. This study shows that hSGECs can successfully be cultured on the SIS-muc and maintain important cellular markers which partly vanish in 2D-culture. Moreover, co-culture with mvECs increased α-amylase enzyme activity of hGECs compared to monoculture. Those results significantly contribute to the base of evidence needed for following studies focusing on dynamic cell culture using the BioVaSc which are necessary to evaluate the possibilities for clinical translation. Thus, this study takes an important step towards a tissue engineering-based therapy of the burdensome xerostomia.

The basement membrane separates the epithelium from the stroma of any given barrier tissue and is essential in regulating cellular behavior, as mechanical barrier and as structural support. It further plays an important role for new tissue formation, homeostasis, and pathological processes, such as diabetes or cancer. Breakdown of the basement membrane is believed to be essential for tumor invasion and metastasization. Since the basement membrane is crucial for many body functions, the development of artificial basement membranes is indispensable for the ultimate formation of engineered functional tissue, however, challenging due to their complex structure. Electrospinning enables the production of fibers in the nano- or microscale range with morphological similarities to the randomly orientated collagen and elastic fibers in the basement membrane. However, electrospun fibers often lack the functional similarity to guide cells and maintain tissue-specific functions. Hence, their possible applications as matrix structure for tissue engineering are limited. Herein, the potential of polyester meshes, modified with six armed star-shaped pre-polymers and cell-adhesion-mediating peptides, was evaluated to act as functional isotropic and bipolar artificial basement membranes. Thereby, the meshes were shown to be biocompatible and stable including under dynamic conditions, and the degradation profile to correlate with the rate of new tissue formation. The different peptide sequences did not influence the morphology and integrity of the fibers. The modified membranes exhibited protein-repellent properties over 12 months, indicating the long-term stability of the cross-linked star-polymer surfaces. Cell culture experiments with primary fibroblasts and a human keratinocyte cell line (HaCaT) revealed that cell adhesion and growth strongly depends on the peptide sequences and their combinations employed. HaCaT cells grew to confluence on membranes modified with a combination of laminin/collagen type IV derived binding sequences and with a combination of fibronectin/laminin/collagen type IV derived peptide sequences. Fibroblasts strongly adhered to the fibronectin derived binding sequence and to membranes containing a combination of fibronectin/laminin/collagen type IV derived peptide sequences. The adhesion and growth of fibroblasts and HaCaT cells were significantly reduced on membranes modified with laminin, as well as collagen IV derived peptide sequences. HaCaT cells and fibroblasts barely adhered onto meshes without peptide sequences. Co-culture experiments at the air-liquid interface with fibroblasts and HaCaT cells confirmed the possibility of creating biocompatible, biofunctional and biomimetic isotropic and bipolar basement membranes, based on the functionalized fibers. HaCaT cells grew in several layers, differentiating towards the surface and expressing cytokeratin 10 in the suprabasal and cytokeratin 14 in the basal layers. Migration of fibroblasts into the electrospun membrane was shown by vimentin staining. Moreover, specific staining against laminin type V, collagen type I, III, IV and fibronectin illustrated that cells started to remodel the electrospun membrane and produced new extracellular matrix proteins following the adhesion to the synthetic surface structures. The culturing of primary human skin keratinocytes proved to be difficult on electrospun fibers. Cells attached to the membrane, but failed to form a multilayered, well-stratified, and keratinized epidermal layer. Changing the fiber composition and fixation methods did not promote tissue development. Further investigations of the membrane demonstrated the tremendous influence of the pore size of the membrane on epithelial formation. Furthermore, primary keratinocytes reacted more sensitive to pH changes in the medium than HaCaT cells did. Since primary keratinocytes did not adequately develop on the functionalized meshes, polycarbonate membranes were used instead of electrospun meshes to establish oral mucosa models. The tissue-engineered models represented important features of native human oral mucosa. They consisted of a multilayered epithelium with stratum basale, stratum spinosum, stratum granulosum, and stratum corneum. The models formed a physical barrier and the expression of characteristic cell markers was comparable with that in native human oral mucosa. The results from the ET-50 assay and the irritation study reflected the reproducibility of the tissue equivalents. Altogether, electrospinning enables the production of fibers with structural similarity to the basement membrane. Incorporating extracellular matrix components to mimic the functional composition offers a safe and promising way to modify the fibers so that they can be used for different tissue engineering applications. The resultant biomimetic membranes that can be functionalized with binding sequences derived from widely varying proteins can be used as a toolbox to study the influence of isotropic and bipolar basement membranes on tissue formation and matrix remodeling systematically, with regards to the biochemical composition and the influence and importance of mono- and co-culture. The oral mucosa models may be useful for toxicity and permeation studies, to monitor the irritation potential of oral health care products and biomaterials or as a disease model. / Die Basalmembran trennt das Epithel vom Stroma eines jeden Wandgewebes und ist entscheidend bei der Regulierung des Zellverhaltens, als mechanische Barriere, und als strukturelle Unterstützung. Darüber hinaus spielt sie eine wichtige Rolle sowohl bei der Neubildung von Gewebe und der Homöostase, als auch bei pathologischen Prozessen, wie Diabetes mellitus oder Krebs. Es wird angenommen, dass die Überquerung der Basalmembran eine entscheidende Rolle bei der Tumorinvasion und Metastasierung spielt. Wegen der großen Bedeutung der Membran für eine Vielzahl an Körperfunktionen, ist die Entwicklung von strukturierten und funktionalen künstlichen Basalmembranen für den Aufbau von im Labor entwickeltem funktionalem Gewebe unerlässlich; nichtsdestotrotz stellt die Herstellung aufgrund der komplexen Struktur eine Herausforderung dar. Das elektrostatische Verspinnen ermöglicht es, Fasern im Nano oder Mikrometer Maßstab mit morphologischen Ähnlichkeiten zu den zufällig orientierten Kollagen und elastischen Fasern in der Basalmembran herzustellen. Allerdings fehlt den elektrogesponnenen Fasern häufig die funktionale Ähnlichkeit um die Zellbewegung innerhalb des Gewebes zu regulieren und gewebespezifische Funktionen aufrecht zu erhalten. Daher sind ihre Anwendungsmöglichkeiten als Membranen für das Tissue Engineering begrenzt. In dieser Arbeit wurde das Potential eines Polyestergerüsts beurteilt, das mit einem sechsarmigen sternförmigen Additiv und Zelladhäsion vermittelnden Peptiden modifiziert worden war, als isotrope und bipolare künstliche Basalmembran. Zunächst wurden die Materialeigenschaften der Faservliese untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Vliese biokompatibel, und auch unter dynamischen Bedingungen stabil sind. Zudem korrelierte der Abbau der Vliese mit dem Aufbau von neuem Gewebe. Die Modifizierung der Faseroberfläche mit Peptidsequenzen beeinflusste nicht die Morphologie und die Integrität der Fasern. Die funktionalisierten Gerüste zeigten proteinabweisende Eigenschaften über 12 Monate, was die langfristige Stabilität der quervernetzten Stern Polymer Oberflächen bestätigte. Zellkulturversuche mit primären Fibroblasten und einer humanen Keratinozyten Zelllinie (HaCaT) ergaben, dass die Zelladhäsion und das Wachstum stark von den Peptidsequenzen und deren Kombinationen abhängig sind. HaCaT Zellen wuchsen zur Konfluenz auf Vliesen, die mit einer Kombination aus Laminin/Kollagen Typ IV stammenden Peptidsequenzen und mit einer Kombination aus Fibronektin/Laminin/Kollagen Typ IV stammenden Peptidsequenzen funktionalisiert worden waren. Fibroblasten dagegen adhärierten und proliferierten stark auf Vliesen, die mit Fibronektin, und einer Kombination aus Fibronektin/Laminin/Kollagen Typ IV stammenden Bindungssequenzen modifiziert worden waren. Die Adhäsion und das Wachstum von Fibroblasten und HaCaT Zellen waren dagegen auf mit Laminin sowie mit Kollagen Typ IV funktionalisierten Membranen deutlich geringer. Fibroblasten und HaCaT Zellen adhärierten kaum auf Vliesen ohne Peptidsequenzen. Ko Kultur Versuche an der Luft Flüssigkeits Grenzfläche mit Fibroblasten und HaCaT Zellen bestätigten, dass es möglich ist, basierend auf funktionalisierten Fasern, biokompatible, biofunktionale und biomimetische isotrope und anisotrope Basalmembranen aufzubauen. HaCaT Zellen wuchsen mehrschichtig, differenzierten und polarisierten, dies wurde belegt durch den Nachweis von Zytokeratin 14 in den basalen und Zytokeratin 10 in den oberen Schichten des Epithels. Die Vimentin Färbung zeigte, dass die Fibroblasten in das Vlies einwandern. Durch spezifische Färbung von Laminin V, Kollagen I, III, IV und Fibronektin konnte gezeigt werden, dass die Zellen beginnen das Vlies umzubauen und extrazelluläre Matrix Proteine zu produzieren. Die Kultivierung von primären Keratinozyten, sowohl aus der humanen Haut als auch aus der humanen Mundschleimhaut, erwies sich als komplex auf elektrogesponnenen Fasern. Die Zellen adhärierten auf der Membran, bildeten aber weder mit noch ohne Fibroblasten ein mehrschichtiges, verhorntes Epithel aus. Die Anpassung der Faserzusammensetzung und der Fixierungsmethoden begünstigte die Entwicklung des Epithels nicht. Weiterführende experimentelle Studien belegten, dass der Porendurchmesser des Vlieses eine wichtige Rolle für die Entwicklung des Epithels spielt und dass primäre Keratinozyten stärker auf pH Veränderungen reagieren als HaCaT Zellen. Da die funktionalisierten Fasern sich nicht als geeignete Struktur für primäre Keratinozyten erwiesen, wurden Polycarbonat Membranen anstelle von elektrogesponnenen Strukturen als Träger für den Aufbau von Mundschleimhautmodellen verwendet. Die Modelle zeigten wichtige Eigenschaften der nativen Mundschleimhaut. Es bildete sich ein mehrschichtiges, polarisiertes Epithel aus basalen Zellen, einer Stachelzellschicht, Körnerzellschicht und Hornschicht. Die Modelle entwickelten eine physikalische Barriere und exprimierten Zellmarker ähnlich der nativen Mundschleimhaut. Die Ergebnisse des ET 50 Assays und der Irritationsstudie legten dar, dass die Modelle reproduzierbar hergestellt werden können. Das elektrostatische Spinnen ermöglicht es, fibrilläre Strukturen, die der Basalmembran sehr ähnlich sind, herzustellen. Die Funktionalisierung der Fasern mit Zelladhäsionssignalen stellt eine vielversprechende Möglichkeit dar, diese Fasern so zu modifizieren, dass sie als Basalmembranen für verschiedene Anwendungen des Tissue Engineerings geeignet sind. Die biomimetischen Membranen können mit Bindungssequenzen von sehr unterschiedlichen Proteinen modifiziert werden. Darüber hinaus können sie genutzt werden, den Einfluss von isotropen und anisotropen Basalmembranen auf die Gewebebildung und den Matrixumbau systematisch in Bezug auf die biochemische Zusammensetzung und den Einfluss sowie die Bedeutung von Mono und Ko Kultur zu untersuchen. Die Mundschleimhautmodelle können für toxikologische Untersuchungen, Permeationsstudien, sowie als Krankheitsmodelle eingesetzt werden. Außerdem können sie verwendet werden, um das Irritationspotenzial von Mundhygieneprodukten und Biomaterialien einzuschätzen.

Traumatische und/oder degenerative, umschriebene Knorpeldefekte sind aufgrund der schlechten intrinsischen Regenerationseigenschaften des Knorpelgewebes immer noch eine chirurgische Herausforderung. Therapiemöglichkeiten mittels Knorpelrekonstruktion durch autologes Knorpelgewebe hat den Nachteil der „donor-site-morbidity“ und auch die mit guten klinischen und bildmorphologischen Ergebnissen bereits in der Klinik angewandte matrixgekoppelte autologe Chondrozytentransplantation kommt nicht ohne eine zusätzliche Operation und Entnahme von Knorpelgewebe aus. Autologe mesenchymale Stammzellen sind einfach mittels Beckenkammpunktion zu gewinnen und stellen aufgrund ihres Proliferations- und chondrogenen Differenzierungsvermögens eine vielversprechende Alternative dar. Die Tissue Engineering Division des orthopädischen König-Ludwig-Hauses in Würzburg befasst sich nun seit mehreren Jahren in verschiedenen Versuchsreihen unter anderem mit dieser Alternative der Knorpelrekonstruktion. Vor allem die Optimierung der Nutzung von Stammzellen, die Vordifferenzierungsmöglichkeiten in vitro und das Verhalten in verschiedenen Trägermatrizes wird erforscht. Die vorliegende Arbeit stellt eine Pilotstudie zur Anwendung von Stammzellen analog zu der in klinischer Anwendung befindlichen MACT in vivo in Göttinger Minipigs vor. Wir haben zeigen können, wenn auch nur mit einer geringen Fallzahl und fehlenden signifikanten Aussagen, dass Stammzellen eine vielversprechende Alternative zu Chondrozyten in der Versorgung von Gelenkknorpeldefekten darstellen. Eine Verarbeitung in Kollagen I Hydrogelen ist in gleicher Weise wie mit den Chondrozyten möglich und auch die mechanische Stabilität differiert nicht. Die histologischen und immunhistochemischen Auswertungen haben in den Stammzelltransplantaten gleich gute, in einigen Aspekten sogar gering bessere Ergebnisse erzielt als die bewährten Chondrozytentransplantate. In der Nachbehandlung schien die sofortige volle Belastung der frisch operierten Kniegelenke bei den Minipigs möglicherweise problematisch in Bezug auf die Fixierung und den Verbleib der Gel-Transplantate im Defekt. In der Klinik ist eine zeitweise Teilbelastung und anfangs lediglich passive Bewegung des Gelenks natürlich problemlos möglich. In der Zukunft werden durch Vordifferenzierung und Markierung der Stammzellen sowie durch Vorauswahl von Zellen mit einem hohen chondrogenen Differenzierungspotential die Ergebnisse von ähnlichen Versuchsreihen sicher noch optimiert werden können. / Repair of full-thickness cartilage defects with autologous chondrocytes and autologous mesenchymal stem cells in a collagen-I-hydrogel - a pilot study in mini-pigs

Kardiovaskuläre Erkrankungen, wie beispielsweise der Herzinfarkt, sind die häufigste Todesursache weltweit. Bei einem Herzinfarkt sterben Areale des Herzens aufgrund einer Unterversorgung mit Blut ab. Da das Herzmuskelgewebe ein sogenanntes terminal differenziertes Gewebe ist, kommt es zu keiner Regeneration des Gewebes, mit der Folge einer Herzinsuffizienz beziehungsweise dem Tod des Patienten. Eine alternative Behandlungsmöglichkeit zu einer Herztransplantation stellt das Tissue Engineering dar. Mit Hilfe des Tissue Engineerings können dreidimensionale Gewebe aufgebaut und kultiviert werden, um auf diese Weise ein funktionelles Gewebe zu erhalten, durch welches das abgestorbene Gewebeareal des Herzens zukünftig auch ersetzt werden könnte. In der vorliegenden Arbeit wurden notwendige Technologien für den Aufbau von Geweben entwickelt sowie erste Versuche für die Erzeugung eines funktionellen Herzmuskelgewebes durchgeführt. Beim Aufbau von dreidimensionalen Geweben finden Trägerstrukturen Anwendung, die mit Zellen besiedelt werden. Solche Trägerstrukturen können aus biologischen oder synthetischen Polymeren hergestellt sein oder aus der extrazellulären Matrix eines dezellularisierten Gewebes bestehen. Für eine standardisierte Dezellularisierung von Geweben wurde eine computergesteuerte Pumpeneinheit, für die Herstellung von Nanofaserscaffolds eine Elektrospinninganlage entwickelt. Mit Hilfe der Dezellularisierungseinheit können komplexe Organe, wie ein Herz im Ganzen, reproduzierbar dezellularisiert werden. Untersuchungen der mittels Elektrospinning hergestellten Nanofaserscaffolds, welche als Alternative zu der dezellularisierten, natürlichen Matrix eingesetzt werden können, zeigten bei allen hergestellten Zusammensetzungen eine Orientierung der Zellen entlang der Fasern. Die Kultivierung von Zellmatrixkonstrukten erfolgt im Tissue Engineering häufig unter dynamischen Bedingungen. Hierfür wurde ein mobiler Stand Alone Inkubator mit der erforderlichen Peripherie für eine Kultur unter Perfusion des Gewebes entwickelt. Als Weiterentwicklung des Stand Alone Inkubators ist eine modulare Bioreaktorplattform, bestehend aus Wärmetauscher, Beutelpumpe und Gasaustauscher, aufgebaut worden. In dieses System kann über Standard Anschlüsse jegliche Art von Bioreaktor in das System eingebunden werden. Durch die Kompaktheit des Systems ist es möglich mehrere Ansätze parallel auf engem Raum durchzuführen. Die Funktion der Plattform, wurde in der vorliegenden Arbeit durch die Gewebekultur einer nativen porzinen Karotis nachgewiesen. Für den Aufbau des kardialen Gewebes dient die small intestinal submucosa ohne Serosa (SISser) als Trägerstruktur. Der Aufbau des Gewebekonstrukts erfolgte in verschiedenen Ansätzen unter Einsatz verschiedener Zellarten. Native, aus Herzbiopsien generierte Cardiosphere derived cells (CDCs) verteilten sich gleichmäßige über die Oberfläche der Matrix, jedoch konnten immunhistologisch keine spezifischen kardialen Marker bei den artifiziellen Geweben nachgewiesen werden. Zellmatrixkonstrukte aus einer Mono Kultur von Kardiomyozyten, differenziert aus induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS Zellen) sowie einer Co Kultur dieser Kardiomyozyten mit mesenchymalen Stammzellen und Zellen aus einer Herzbiopsie zeigten nach wenigen Tagen in Kultur ein kontraktiles Verhalten. Immunhistologische Färbungen der beiden Gewebe bestätigten die Expression der spezifischen kardialen Marker, wie beispielsweise kardiales Troponin T, kardiales Troponin C und alpha Actinin. Die Kardiomyozyten der Mono Kultur sind jedoch nicht über die gesamte Matrixoberfläche verteilt, sondern bilden Aggregate. Bei der Co Kultur kann eine gleichmäßige Verteilung der Zellen auf der Matrix beobachtet werden. Der vielversprechendste Ansatz für den Aufbau eines Herzmuskelgewebes, welches als Implantat oder Testsystem eingesetzt werden kann, bildet nach den in dieser Arbeit erzielten Ergebnissen, ein Konstrukt aus der SISser und der Co Kultur der Zellen. Allerdings muss die Zusammensetzung der Co Kultur sowie das Verhältnis der Zellzahlen optimiert werden. / Cardiovascular diseases as myocardial infarction are the most frequent cause of death worldwide. During a myocardial infarction, areas of the heart are being damaged because of an insufficient nutrient supply. Heart tissue is a terminal differentiated tissue, this means that it can’t be regenerated by itself. The consequence of this characteristic is a heart insufficiency or the death of the patient. An alternative treatment to heart transplantation is promised by tissue engineering. By using the methods of tissue engineering, cells can be cultured on a scaffold to generate a mature tissue, which can be used to replace the damaged areas of the heart. In the present work systems for the generation of tissues have been developed and first experiments to build up a functional cardiac patch were performed. To generate three-dimensional tissues, scaffolds colonized with cells are necessary. These scaffolds can be produced with biological or synthetic polymers or even decellularized tissues can be used. A computer controlled decellularization platform was designed to ensure a standardized, reproducible decellularization of complex organs like hearts. Furthermore, an electrospinning device was developed for the production of nanofiber scaffolds. On such matrices, seeded cells grow along the fibers. Most cell-matrix-constructs are cultured under dynamic conditions in tissue engineering. A stand alone incubator system containing the required periphery to apply different culture conditions was developed. As further development a compact modular bioreactor platform consisting of a heat exchanger, a bag pump and a gas exchanger was established. All kinds of bioreactors can be enclosed to the system via standard Luer Lock Connectors. Due to the compactness of the system, it is possible to parallelize and run experiments easily on narrow space. The functionality of the platform was demonstrated by a tissue culture of a native porcine carotid artery. The small intestinal submucosa without serosa (SISser) was employed as matrix for the development of a functional cardiac patch. In different experiments diverse cell types were used to generate a cardiac construct. Cardiosphere derived cells (CDC) seeded on the SISser showed an equal distribution all over the surface of the matrix, but no expression of specific cardiac markers. Constructs consisting of a mono culture of induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes (CM iPS cells) or a co culture of CM iPS cells, mesenchymal stem cells and cells isolated form a heart biopsy showed a contraction of the whole matrix after a few days in culture. Furthermore, cardiac markers like cardiac troponin T, cardiac troponin C and alpha actinin could be observed by immunohistological staining. Regarding the morphology of the different tissues, the mono culture of the CM iPS cells formed agglomerates on the surface of the matrix whereas the co culture showed a well distribution of the cells all over the surface of the matrix. Consequently, the co culture on the SISser is the most promising approach for the development of a functional cardiac patch. However, the combination of cell types within the co culture and their ratio has to be optimized.

The main function of the small intestine is the absorption of essential nutrients, water and vitamins. Moreover, it constitutes a barrier protecting us from toxic xenobiotics and pathogens. For a better understanding of these processes, the development of intestinal in vitro models is of great interest to the study of pharmacological and pathological issues such as transport mechanisms and barrier function. Depending on the scientific questions, models of different complexity can be applied. In vitro Transwell® systems based on a porous PET-membrane enable the standardized study of transport mechanisms across the intestinal barrier as well as the investigation of the influence of target substances on barrier integrity. However, this artificial setup reflects only limited aspects of the physiology of the native small intestine and can pose an additional physical barrier. Hence, the applications of this model for tissue engineering are limited. Previously, tissue models based on a biological decellularized scaffold derived from porcine gut tissue were demonstrated to be a good alternative to the commonly used Transwell® system. This study showed that preserved biological extracellular matrix components like collagen and elastin provide a natural environment for the epithelial cells, promoting cell adhesion and growth. Intestinal epithelial cells such as Caco-2 cultured on such a scaffold showed a confluent, tight monolayer on the apical surface. Additionally, myofibroblasts were able to migrate into the scaffold supporting intestinal barrier formation. In this thesis, dendritic cells were additionally introduced to this model mimicking an important component of the immune system. This co-culture model was then successfully proven to be suitable for the screening of particle formulations developed as delivery system for cancer antigens in peroral vaccination studies. In particular, nanoparticles based on PLGA, PEG-PAGE-PLGA, Mannose-PEG-PAGE-PLGA and Chitosan were tested. Uptake studies revealed only slight differences in the transcellular transport rate among the different particles. Dendritic cells were shown to phagocytose the particles after they have passed the intestinal barrier. The particles demonstrated to be an effective carrier system to transport peptides across the intestinal barrier and therefore present a useful tool for the development of novel drugs. Furthermore, to mimic the complex structure and physiology of the gut including the presence of multiple different cell types, the Caco-2 cell line was replaced by primary intestinal cells to set up a de novo tissue model. To that end, intestinal crypts including undifferentiated stem cells and progenitor cells were isolated from human small intestinal tissue samples (jejunum) and expanded in vitro in organoid cultures. Cells were cultured on the decellularized porcine gut matrix in co-culture with intestinal myofibroblasts. These novel tissue models were maintained under either static or dynamic conditions. Primary intestinal epithelial cells formed a confluent monolayer including the major differentiated cell types positive for mucin (goblet cells), villin (enterocytes), chromogranin A (enteroendocrine cells) and lysozyme (paneth cells). Electron microscopy images depicted essential functional units of an intact epithelium, such as microvilli and tight junctions. FITC-dextran permeability and TEER measurements were used to assess tightness of the cell layer. Models showed characteristic transport activity for several reference substances. Mechanical stimulation of the cells by a dynamic culture system had a great impact on barrier integrity and transporter activity resulting in a tighter barrier and a higher efflux transporter activity. In Summary, the use of primary human intestinal cells combined with a biological decellularized scaffold offers a new and promising way to setup more physiological intestinal in vitro models. Maintenance of primary intestinal stem cells with their proliferation and differentiation potential together with adjusted culture protocols might help further improve the models. In particular, dynamic culture systems and co culture models proofed to be a first crucial steps towards a more physiological model. Such tissue models might be useful to improve the predictive power of in vitro models and in vitro in vivo correlation (IVIVC) studies. Moreover, these tissue models will be useful tools in preclinical studies to test pharmaceutical substances, probiotic active organisms, human pathogenic germs and could even be used to build up patient-specific tissue model for personalized medicine. / Die Hauptfunktion des Dünndarms besteht in der Aufnahme von lebenswichtigen Nährstoffen, Wasser und Vitaminen. Zudem stellt er eine Barriere dar, die uns vor toxischen Fremdstoffen und Pathogenen schützt. Um diese Prozesse besser zu verstehen, ist die Entwicklung neuer in vitro Modellen des Darms von großem Interesse um pharmakologische und pathologische Studien durchzuführen. Abhängig von der wissenschaftlichen Fragestellung können Modelle von unterschiedlicher Komplexität zur Anwendung kommen. In vitro Transwell® Systeme basierend auf einer porösen PET-Membran ermöglichen die Untersuchung von Transportmechanismen über die intestinal Barriere und den Einfluss von Wirkstoffen auf deren Integrität. Dieser künstliche Aufbau ähnelt jedoch nur eingeschränkt der Physiologie des Dünndarms und kann eine zusätzliche physikalische Barriere darstellen. Die Anwendungsmöglichkeiten dieses Modells im Tissue Engineering sind daher begrenzt. Gewebemodelle basierend auf einer dezellularisierten biologischen Matrix hergestellt aus Schweinedarmgewebe haben sich als gute Alternative zum herkömmlichen Transwell® System herausgestellt. Diese Studie zeigt, dass die erhaltenen Komponenten der biologischen Extrazellulärmatrix wie Kollagen und Elastin eine natürliche Umgebung für die Epithelzellen bieten und Zelladhäsion und Wachstum der Zellen fördern. Darmepithelzellen wie Caco-2 Zellen, welche auf einer solchen Matrix kultiviert wurden, bildeten einen konfluenten, dichten Monolayer auf der apikalen Oberfläche aus. Zusätzlich ermöglichte dieser Aufbau die Migration von Myofibroblasten in die Matrix, was die Bildung der intestinalen Barriere unterstützt. In dieser Doktorarbeit wurden zusätzlich dendritische Zellen als wichtige Komponente des adaptiven Immunsystems in das Modell integriert. Dieses Ko-Kultur Modell erwies sich als geeignet um partikuläre Formulierungen zu testen, welche als Transportsysteme für Tumorantigene entwickelt wurden. Es wurden Partikel basierend auf PLGA, PEG-PAGE-PLGA, Mannose-PEG-PAGE-PLGA und Chitosan untersucht. Aufnahmestudien ergaben nur geringfügige Unterschiede in den Transportraten zwischen den verschiedenen Partikeln. Es konnte ausserdem gezeigt werden, dass dendritische Zellen die Partikel phagozytieren, nachdem sie die intestinale Barriere überwunden haben. Die Partikel erwiesen sich als effektives Transportsystem um Peptide über die intestinale Barriere zu schleusen und stellen daher ein nützliches Werkzeug für die Entwicklung neuartiger Medikamente dar. Um die komplexe Struktur und Physiologie des Darms noch besser nachzustellen, wurde für den Aufbau des Modells die Caco-2 Zelllinie durch primäre Darmzellen ersetzt. Die Darmkrypten, welche undifferenzierte Stammzellen und Vorläuferzellen enthalten, wurden aus humanen Dünndarmgewebe, dem Jejunum, isoliert und in vitro expandiert. Die Zellen wurden zusammen mit Myofibroblasten auf der dezellularisierten Schweinedarmmatrix, unter statischen und dynamischen Bedingungen, kultiviert. Die primären Darmepithelzellen bildeten einen konfluenten Monolayer, welcher alle differenzierten intestinalen Zelltypen aufwies, gezeigt durch Zellen positiv für Mucin (Becherzellen), Villin (Enterozyten), Chromogranin A (enteroendokrine Zellen) und Lysozym (Paneth-Zellen). Mit Hilfe von Elektronenmikroskopie ließen sich essentielle funktionelle Einheiten eines intakten Epithels darstellen, wie die Mikrovilli und Tight Junctions. Um die Dichtigkeit des Epithels zu überprüfen wurde mit FITC-Dextran die Permeabilität bestimmt und TEER-Messungen durchgeführt. Die Modelle zeigten einen charakteristischen Transport für mehrere Referenzsubstanzen. Mechanische Stimulation durch ein dynamisches Kultivierungssystem hatte einen starken Einfluss auf die Barriereintegrität und Transporteraktivität der Modelle, was sich in einer dichteren Barriere und erhöhten Efflux-Transporteraktivität widerspiegelte. Alles in allem bietet die Verwendung primärer intestinaler Zellen in Kombination mit einer dezellularisierten biologischen Matrix eine neue, vielversprechende Möglichkeit physiologischere in vitro Modelle des Darms aufzubauen. Der Erhalt intestinaler Stammzellen mit ihrem Proliferations- und Differenzierungspotential zusammen mit angepassten Protokollen könnte dabei helfen die Modelle weiter zu verbessern. Insbesondere die dynamische Kultivierung und die Ko-Kultur-Modelle erwiesen sich als entscheidender Schritt auf dem Weg zu physiologischeren Modellen. Solche Gewebemodelle könnten sich als nützlich erweisen, wenn es darum geht die Vorhersagekraft der in vitro Modelle, sowie die in vitro-in vivo Korrelation zu verbessern. Solche Gewebemodelle können ein nützliches Werkzeuge in der präklinischen Forschung für die Testung von pharmazeutischen Wirkstoffen, probiotisch aktiven Organismen, sowie humaner pathogener Keime sein und sogar zum Aufbau personalisierter Modelle für die regenerative Medizin dienen.

<p>Full thickness wounds, such as deep burns, need restoration of both the dermal and epidermal layers of the skin. In normal wound healing, re-epithelialization occurs by migration and proliferation of keratinocytes from the wound edges and by differentiation of stem cells from remaining hair follicles. Restoration of dermis occurs by influx of growth factors secreted by macrophages, platelets, and fibroblasts; by fibroblast proliferation and subsequent synthesis and remodeling of collagenous dermal matrix. In the case of full-thickness acute burn injuries and chronic wounds (e.g. pressure ulcers, venous ulcers and diabetic foot ulcers), these processes are defective. With the principles of tissue engineering in mind (to correct, improve and maintain tissues and their functions), researchers have developed promising materials and methods to make it possible to restore either the dermal (Integra^® DRT, Alloderm^®) or the epidermal layer (split thickness skin grafts (STSG), cultured epithelial autografts (CEA), autologous keratinocytes in single cell suspension). It is now well established that superior results are obtained if both dermal and epidermal components are combined, for example in a bilayered skin equivalent.<strong> </strong>Apligraf^®is recommended for use on venous ulcers and is the only bilayered living skin equivalent currently approved by the FDA. Studies on different factors affecting the wound healing capacity as well as techniques in use provide valuable information for further development.</p><p>In this licentiate thesis, we evaluated different transplantation techniques for delivering cultured human keratinocytes in single cell suspension, a measure becoming more frequently used in addition to STSG and CEA for restoring the epidermal layer of the skin. We found that the pressure device, commonly used to spray cell suspension onto the wound with pressures as high as 200 kPa, killed around 0% of the cells. In comparison, an ordinary syringe with the attachment of a spray nozzle showed almost 90% viable cells post transplantation and provided an equally good distribution of the cell suspension.</p><p>We also studied different silver containing dressings regarding silver accumulation in human skin. In addition, we graded the re-epithelialization to evaluate whether the dressings caused any delay in the wound healing process. We found that the silver dressings tested, with few exceptions, caused dermal accumulation of silver, primarily aggregated around blood vessels. We could also show that most of the dressings had negative effect on the re-epithelialization.</p><p>For the restoration of the dermal layer of the skin, Integra^® DRT functions as a scaffold for guided tissue regeneration of the dermis. We had the possibility to study a case of necrotizing fasciitis were the treatment consisted of the use of Integra^® DTR together with sub-atmospheric pressure (after initial surgical debridement) and later transplantation of split thickness skin grafts. This measure proved to be safe as well as giving satisfactory pliable and aesthetically acceptable result.</p>

<p>The time when it will be possible to grow complex organs in a lab environment comes closerdue to the rapid progress taking place in the area of biotechnology and tissue engineering.Various tissue engineering methods of creating artificial scaffolds has evolved, one of thosebeing electrospinning. Electrospun scaffolds are beneficial in tissue engineering applicationsforemost in regard to their body-mimicking structure. Small pore sizes and low porosities mayhowever limit cell infiltration and thereby creation of 3D functional tissues. The issue of cellinfiltration in electrospun constructs such as nonwoven polymer scaffolds for use in tissueengineering may be solved by a method of simultaneous integration i.e. integrating particlesduring the phase of production in the electrospinning process. In this thesis investigation of aproof-of-concept to the idea of in the future distributing living cells within the threedimensionalstructure during the process of electrospinning of a polymeric biomaterial weremade. To be able to conduct simple experiments glass particles with proper sizes are used tosubstitute living cells. During this thesis a novel method called spray electrospinning tookshape enabling a fine distribution of particles in an electrospun material.The work in this thesis shows that there are methods to simultaneously integrate particles inproduction of scaffold materials, one of these composed of spraying particles whileelectrospinning on a rotating collector. The experiments were done in order to compare thedifferent methods; Double, Coaxial and Spray electrospinning pointing out similarities anddifferences between the three. The methods used to characterize the materials include scalemeasurements and SEM image analysis to determine morphology, fibre diameter, layerthickness and distance between particles. Glass particles were used as substitutes for livingcells for the sake of proof of concept which showed that these can successfully be integratedsimultaneously in an electrospun material. However porosity and the number of particles haveto be further optimized for the material to be ready for use in tissue engineering.The time when it will be possible to grow complex organs in a lab environment comes closerdue to the rapid progress taking place in the area of biotechnology and tissue engineering.Various tissue engineering methods of creating artificial scaffolds has evolved, one of thosebeing electrospinning. Electrospun scaffolds are beneficial in tissue engineering applicationsforemost in regard to their body-mimicking structure. Small pore sizes and low porosities mayhowever limit cell infiltration and thereby creation of 3D functional tissues. The issue of cellinfiltration in electrospun constructs such as nonwoven polymer scaffolds for use in tissueengineering may be solved by a method of simultaneous integration i.e. integrating particlesduring the phase of production in the electrospinning process. In this thesis investigation of aproof-of-concept to the idea of in the future distributing living cells within the threedimensionalstructure during the process of electrospinning of a polymeric biomaterial weremade. To be able to conduct simple experiments glass particles with proper sizes are used tosubstitute living cells. During this thesis a novel method called spray electrospinning tookshape enabling a fine distribution of particles in an electrospun material.The work in this thesis shows that there are methods to simultaneously integrate particles inproduction of scaffold materials, one of these composed of spraying particles whileelectrospinning on a rotating collector. The experiments were done in order to compare thedifferent methods; Double, Coaxial and Spray electrospinning pointing out similarities anddifferences between the three. The methods used to characterize the materials include scalemeasurements and SEM image analysis to determine morphology, fibre diameter, layerthickness and distance between particles. Glass particles were used as substitutes for livingcells for the sake of proof of concept which showed that these can successfully be integratedsimultaneously in an electrospun material. However porosity and the number of particles haveto be further optimized for the material to be ready for use in tissue engineering.</p>

Treatment of cardiac diseases involves transplantation of donor hearts, since the damaged heart has limited self-regeneration potential. An alternative treatment option has emerged as engineered cardiac tissues, grown in vitro by cultivation of cardiac cells on biomaterials, have comparable properties to native myocardium and can be implanted for cardiac repair. Major current limitations are a viable cell source and adequate vascularization to support cell survival. In this thesis, two proangiogenic biomaterials, a scaffold and a hydrogel, were developed to achieve vascularization in vitro and in vivo for cardiac repair. Scaffold patches are suitable for repairing congestive heart failure or congenital malformations, while injectable biomaterials allow minimally-invasive treatment post-myocardial infarction (MI). In the first aim, a collagen scaffold with covalently immobilized vascular endothelial growth factor (VEGF) was developed, and improved cell mobilization, survival and proliferation when used for free wall repair in adult rats. This increased angiogenesis, which aided in retaining the biomaterial size to allow tissue growth. In the second aim, a collagen-chitosan hydrogel with encapsulated thymosin β4 (Tβ4) was developed to 1) recruit cells from the heart epicardium for repair post-MI in vivo, and 2) guide capillary outgrowths from arteries and veins to form oriented capillary structure for in vitro cardiac tissue engineering. Results showed that the encapsulation of Tβ4 into collagen-chitosan hydrogels led to cell outgrowths from rat or mouse cardiac explants in vitro. A portion of the recruited cells were CD31-positive endothelial cells (ECs) that formed tubes. The hydrogel was injected in vivo to increase vascularization and number of cardiomyocytes within the infarct area post-MI, which improved left ventricular wall thickness. Tβ4-hydrogel also promoted the outgrowth of capillaries from vascular explants that followed the direction of the hydrogel-coated grooves of a micropatterned polydimethylsiloxane (PDMS) substrate. These capillary outgrowths eventually formed a vascular bed for engineering vascularized cardiac tissues. This thesis presents two bioinstructive biomaterials with sustained and localized delivery of angiogenic molecules to be used for in situ cardiac repair based on improved vascularization. The use of cell-free bioactive materials overcomes limitations of cell isolation and expansion as required for cell therapies or implantation of engineered tissues.

A key challenge in tissue engineering is overcoming cell death in the scaffold interior due to the limited diffusion of oxygen and nutrients therein. We hypothesized here that immobilizing a gradient of vascular endothelial growth factor (VEGF-165) would guide endothelial cells into the interior of the scaffold thereby enhancing angiogenesis. The protein was immobilized onto a collagen scaffold through carbodiimide chemistry by one of the three methods experimented: placing 5 µl of the solution at the center of the scaffold to create a ~2 ng/ml/mm gradient in a radial direction. D4T endothelial cells were observed to be guided by this VEGF-165 gradient deep into the center of the scaffold compared to both uniformly immobilized VEGF-165 and VEGF-free controls. We concluded that the VEGF-165 gradient scaffolds promoted the migration, and not proliferation, of cells deep into the scaffold. These gradient scaffolds provide the foundation for future in vivo tissue engineering studies.

A key challenge in tissue engineering is overcoming cell death in the scaffold interior due to the limited diffusion of oxygen and nutrients therein. We hypothesized here that immobilizing a gradient of vascular endothelial growth factor (VEGF-165) would guide endothelial cells into the interior of the scaffold thereby enhancing angiogenesis. The protein was immobilized onto a collagen scaffold through carbodiimide chemistry by one of the three methods experimented: placing 5 µl of the solution at the center of the scaffold to create a ~2 ng/ml/mm gradient in a radial direction. D4T endothelial cells were observed to be guided by this VEGF-165 gradient deep into the center of the scaffold compared to both uniformly immobilized VEGF-165 and VEGF-free controls. We concluded that the VEGF-165 gradient scaffolds promoted the migration, and not proliferation, of cells deep into the scaffold. These gradient scaffolds provide the foundation for future in vivo tissue engineering studies.