Univ., Diss.--Kaiserslautern, 1998.

Universiẗat, Diss., 2004--Bonn.

In der vorliegenden Arbeit wurde die Leistungsfähigkeit der Hochleistungsflüssigchromatographie mit Photodiodenarraydetektion (HPLC-DAD) im Rahmen der Systematischen Toxikologischen Analyse (STA) umfassend untersucht, ein besonderer Schwerpunkt lag dabei auf der Aussagesicherheit bei der Substanzidentifizierung. Die Grundlage für diese Untersuchungen bildete die Messung der UV-Spektren und relativen Retentionszeiten (RRT) von 2.682 toxikologisch relevanten Substanzen mit Hilfe moderner Diodenarraydetektoren und unter einheitlichen experimentellen Bedingungen (Eluent: Acetonitril/ Phosphatpuffer pH 2,3; Trennsäule: Lichrospher RP8ec). Die erhaltenen Daten wurden zusammen mit weiteren Substanzinformationen in einer Spektrenbibliothek zusammengefasst, die als Buch und CD-ROM auch der Öffentlichkeit zugänglich gemacht wurde. Bei der Entwicklung eines Konzeptes zur Methodenvalidierung für die STA erwiesen sich insbesondere die Kenngrößen Selektivität und Spezifität als von zentraler Bedeutung. Unter Verwendung eines Fensteransatzes für die RRT und des Similarity Index (SI) für den Spektrenvergleich wurden sämtliche möglichen Substanzpaare aus der Spektrenbibliothek miteinander auf ihre Unterscheidbarkeit hin verglichen, wobei verschiedene RRT-Fensterbreiten und SI-Schwellenwerte zugrundegelegt wurden. Aus den Ergebnissen wurden Selektivitätsparameter wie die Relative Identification Power (RIP), die Discriminating Power (DP) und die Mean List Length (MLL) berechnet. Mit einer RIP von 84,2 %, einer MLL von 1,25 und einer DP von 0,9999 wurden für die Substanzidentifikation anhand von RRT + UV-Spektrum im Literaturvergleich sehr gute Ergebnisse erhalten. Die hohe Grad an Spezifität der UV-Spektren für den Einsatz in der STA wurde einerseits durch Auszählung sämtlicher in der Spektrenbibliothek gefundener Chromophore/Absorptionssysteme belegt: 1.650 verschiedene Absorptionssysteme wurden gefunden, über 60 % der Verbindungen trugen ein in diesem Substanzbestand einzigartiges Absorptionssystem. Andererseits wurde die computergestützte Unterscheidbarkeit zwischen verschiedenen Gruppen jeweils strukturell ähnlicher Wirkstoffe anhand des UV-Spektrums untersucht. Hierfür wurden 487 Substanzen in ein hierarchisches System von Haupt- und Untergruppen eingeteilt, zwischen denen anschließend mit Hilfe der Schrittweisen Diskriminanzanalyse (SDA) unterschieden werden sollte. Die sehr guten Klassifizierungsergebnisse und die Auflösung auch feiner struktureller Unterschiede, oftmals abseits des eigentlichen Absorptionssystems, lassen es grundsätzlich möglich erscheinen, auch Substanzen für die STA zu erschließen, die nicht in der Spektrenbibliothek enthalten sind. Insgesamt erwies sich die HPLC-DAD als hochselektives und -spezifisches Messverfahren, das zu Recht eine der wichtigsten STA-Methoden darstellt. / In this thesis the capability of high-performance liquid chromatography with photodiode array detection in the context of Systematical Toxicological Analysis (STA) was extensively investigated with a special focus on the certainty of substance identification. As the foundation for these investigations, UV spectra and relative retention times (RRT) of 2,682 toxicologically relevant compounds were recorded under uniform experimental conditions (mobile phase: acetonitrile/ phosphate buffer pH 2.3; column: Lichrospher RP8ec) using up-to-date photodiode array detectors. Together with additional substance information these data were built into a spectra library also made available to the public in the form of a book and a CD-ROM. During the development of a concept for the validation of a STA method, selectivity and specificity were found to be of central importance. Using a window approach for the RRT and the Similarity Index (SI) for spectral comparison, all possible substance pairs within the spectra library were examined in terms of their respective distinguishability, based on different RRT windows and SI threshold values. From the results selectivity parameters such as the Relative Identification Power (RIP), the Discriminating Power (DP), and the Mean List Length (MLL) were calculated. As compared to the literature, with a RIP of 84.2 %, a MLL of 1.25, and a DP of 0,9999 excellent results were obtained for the substance identification based on the combination of RRT and UV spectrum. The high degree of specificty of UV spectra for use in the STA was demonstrated on the one hand by counting all different chromophores/ absorption systems found in the spectra library: 1,650 systems were found, more than 60 % of the substances bore absorption systems unique in the dataset. On the other hand the computer-based distinction between different groups of structurally similar compounds on the basis of the UV spectrum was investigated by dividing 487 substances into a hierarchical system of main and subgroups and trying to distinguish between these groups using stepwise discriminant analysis (SDA). The highly satisfying classification results together with the resolution of fine structural differences, often remote from the actual absorption system, make it seem possible to also render substances not included in the spectra library accessible for the STA. In conclusion HPLC-DAD proved to be highly selective and specific, rightfully regarded as one of the most important STA methods.

Existing ecotoxicity data for chemicals vary to a high extent between the environmental compartments water and sediment, since the evaluation of contaminants has historically focused on water exposition. Many anthropogenic chemicals and waste materials, including toxic organic and inorganic chemicals, adsorb to particulate matter and accumulate in sediments, and may thus be a threat to organisms living in the sediment. The invertebrates Chironomus riparius and Lumbriculus variegatus were selected as representatives of endobenthic living organisms. Acute toxicity tests, via water-only exposure, and sediment toxicity tests were conducted with the two endobenthic invertebrates. In sediment toxicity tests, organisms are mainly exposed to sediment- and particle-bound chemicals and dissolved chemical in the pore water. Toxicity data for algae, daphnids, and fish (via water-only exposure) are available for many substances, whereas the existing sediment toxicity data are rather rare. Thus, the interest arises to predict sediment toxicity for sediment-dwelling invertebrates from existing acute toxicity data of tests with water-only exposure. The main emphasis of this work was placed on one metal compound and seven organic chemicals. The objective of this study was fivefold: (1) develop methods and improve existing procedures on acute and sediment toxicity testing of the two invertebrates; (2) conduct both acute toxicity tests via water exposure and long-term sediment toxicity tests for the selected model substances to generate data for comparative discussion; (3) assess correlations among acute toxicity data of the organisms exposed via water-only and correlations among sediment toxicity data of the two endobenthic invertebrates for the eight tested chemicals; (4) assess possible forecasting for sediment toxicity from acute toxicity (via water-only exposure) and (5) assess exposure effects to determine the main exposure route. Acute toxicity data of the eight tested chemicals of D. magna significantly correlated with data of L. variegatus and C. riparius (p<0.05). However, a prediction of toxicity based on D. magna data bears high uncertainty, due to the small data set and high variation in sensitivity of the organisms. Existing sediment toxicity test methods were improved to meet the demand for artificial sediments containing organic matter that serves sufficiently as internal food source for the test organisms, and thus representing natural exposure conditions. However, the sediments that were used for the two organisms to test the selected model substances differed in sediment composition. Therefore, a sediment with the same sediment composition and the same water-to-sediment ratio for both invertebrates was developed, to have similar exposure conditions. In sediment toxicity tests, C. riparius was observed to be more sensitive than L. variegatus and no correlation was observed among data of the invertebrates. For the selected substances, lowest effect concentrations were observed for 3,4-dichloroaniline, whereas effect concentrations were the highest for benzo[a]pyrene. No correlations were found between the acute toxicity data of exposure via the water phase and sediment toxicity data, thus making a prediction of sediment toxicity data impossible. From analytical measurements of chemicals concentration in the compartments overlying, pore water, and bulk sediment, partition coefficients on sediment water partitioning were calculated. The highest partition coefficient ratios for sediment water partitioning were found for the high lipophilic organic substances 4,4-dichlorodiphenyltrichloroethan (DDT) and benzo[a]pyrene. Further, it was found that the main exposure routes in the 28-day sediment toxicity tests were not only chemical but species-dependent. As a result of very differing exposure routes for the tested chemicals and the absence of correlations from the acute to sediment toxicity data, sediment toxicity tests are necessary to assess the toxicity of chemicals on sediment inhabiting organisms. / In den meisten standardisierten ökotoxikologischen Untersuchungen zur Abschätzung des Gefährdungspotentials von Chemikalien für Gewässer erfolgt die Exposition der Organismen über die Wasserphase. Viele Schadstoffe, die in die aquatische Umwelt gelangen, adsorbieren aufgrund ihrer physikalisch-chemischen Eigenschaften an die Oberflächen von Schwebstoffen, sedimentieren und erreichen Sedimentkonzentrationen, die möglicherweise eine Gefahr für sedimentbewohnende Organismen darstellen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden für benthische Invertebraten Testverfahren etabliert, bei denen eine Exposition der Organismen über das Sediment, hier hauptsächlich über die an ingestierte Sedimentbestandteile gebundene oder über die im Porenwasser gelöste Chemikalie (28-Tage Sedimenttoxizitätstest), und über dieWasserphase (Akuttoxizitätstest) erfolgte. Die Invertebraten Chironomus riparius und Lumbriculus variegatus wurden als typische Vertreter endobenthischer Organismen ausgewählt. Für viele Chemikalien liegen Daten zur akuten Toxizität für Algen, Daphnien und Fische für die Wasserexposition vor. Demgegenüber sind nur wenige Daten zur Toxizität für benthische Organismen weder mit einer Wasser- noch mit einer Sedimentexposition vorhanden. Als Modellsubstanzen wurden eine anorganische und sieben organische Substanzen für die Untersuchungen ausgewählt. Ziele dieser Arbeit waren: (1) die Entwicklung und Verbesserung von bestehenden Methoden zur Bestimmung der akuten Toxizität mitWasserexposition und der Sedimenttoxizität für die beiden Invertebraten; (2) die Durchführung der Tests mit den acht ausgewählten Modellsubstanzen zur vergleichenden Betrachtung; (3) die Beurteilung einer Korrelation der Daten zur Akuttoxizität innerhalb der verschiedenen Organismen mit Wasserexposition und einer Korrelation der Daten zwischen den beiden benthischen Organismen bei Sedimentexposition; (4) die Beurteilung einer Korrelation zwischen Daten der benthischen Invertebraten zur Akuttoxizität mit Wasserexposition und Sedimenttoxizität und (5) die Ermittlung und Bewertung der Expositionspfade. Die Akuttoxizitätsdaten von D. magna korrelieren significant (p<0.05) mit den Daten der beiden Invertebraten. Jedoch ist eine Vorhersage aufgrund des kleinen Datensatzes und der großen Unterschiede in der Empfindlichkeit der Arten abzulehnen. Um einer möglichst natürlichen Expositionssituation in Sedimenten zu entsprechen, wurden künstliche Sedimente mit interner Futterquelle, die auch mit der zu testenden Chemikalie kontaminiert wurde, entwickelt und für die Tests mit den Modellsubstanzen verwendet. Ein Nachteil war die unterschiedliche Sedimentzusammensetzung für die beiden Organismen. Um gleiche Expositionsbedingungen für beide Testorganismen zu gewährleisten, wurde ein artifizielles Sediment mit gleicher Zusammensetzung und gleichem Volumenverhältnis zwischen Sediment und Überstandswasser entwickelt. In den Sedimenttoxizitätstests reagierte C. riparius empfindlicher als L. variegatus. Die Effektkonzentrationen waren am niedrigsten für 3,4-Dichloraniline und am höchsten für Benzo[a]pyren. Die Korrelationen zwischen den Ergebnissen aus Akut- und Sedimenttoxizitstests waren nicht signifikant (p>0.05). Folglich läßt sich die Sedimenttoxizität nicht aus Daten zur akuten Toxizität mit Wasserexposition abschätzen. Aus den analytischen Messungen von Sediment-, Porenwasser- und Überstandswasserproben wurden die Koeffizienten für die Verteilung zwischen Sediment und Wasser berechnet. Für die stark lipophilen Stoffe, 4-Dichlorodiphenyltrichloroethan (DDT) und Benzo[a]pyren wurden die höchsten Koeffizienten errechnet. Weiterhin wurde festgestellt, daß die Hauptexpositionspfade in Sedimenttoxizitätstests einerseits von der Chemikalie und andererseits von der verwendeten Spezies abhängen. Aufgrund der Ergebnisse dieser Arbeit und der Tatsache, daß Sedimente “Senken” für viele Schadstoffe sind, müssen zur Erfassung und Bewertung des Gefährdungspotentials von Chemikalien gegenüber Sedimentbewohnern weiterhin Sedimenttoxizitätstests durchgeführt werden.

Existing ecotoxicity data for chemicals vary to a high extent between the environmental compartments water and sediment, since the evaluation of contaminants has historically focused on water exposition. Many anthropogenic chemicals and waste materials, including toxic organic and inorganic chemicals, adsorb to particulate matter and accumulate in sediments, and may thus be a threat to organisms living in the sediment. The invertebrates Chironomus riparius and Lumbriculus variegatus were selected as representatives of endobenthic living organisms. Acute toxicity tests, via water-only exposure, and sediment toxicity tests were conducted with the two endobenthic invertebrates. In sediment toxicity tests, organisms are mainly exposed to sediment- and particle-bound chemicals and dissolved chemical in the pore water. Toxicity data for algae, daphnids, and fish (via water-only exposure) are available for many substances, whereas the existing sediment toxicity data are rather rare. Thus, the interest arises to predict sediment toxicity for sediment-dwelling invertebrates from existing acute toxicity data of tests with water-only exposure. The main emphasis of this work was placed on one metal compound and seven organic chemicals. The objective of this study was fivefold: (1) develop methods and improve existing procedures on acute and sediment toxicity testing of the two invertebrates; (2) conduct both acute toxicity tests via water exposure and long-term sediment toxicity tests for the selected model substances to generate data for comparative discussion; (3) assess correlations among acute toxicity data of the organisms exposed via water-only and correlations among sediment toxicity data of the two endobenthic invertebrates for the eight tested chemicals; (4) assess possible forecasting for sediment toxicity from acute toxicity (via water-only exposure) and (5) assess exposure effects to determine the main exposure route. Acute toxicity data of the eight tested chemicals of D. magna significantly correlated with data of L. variegatus and C. riparius (p<0.05). However, a prediction of toxicity based on D. magna data bears high uncertainty, due to the small data set and high variation in sensitivity of the organisms. Existing sediment toxicity test methods were improved to meet the demand for artificial sediments containing organic matter that serves sufficiently as internal food source for the test organisms, and thus representing natural exposure conditions. However, the sediments that were used for the two organisms to test the selected model substances differed in sediment composition. Therefore, a sediment with the same sediment composition and the same water-to-sediment ratio for both invertebrates was developed, to have similar exposure conditions. In sediment toxicity tests, C. riparius was observed to be more sensitive than L. variegatus and no correlation was observed among data of the invertebrates. For the selected substances, lowest effect concentrations were observed for 3,4-dichloroaniline, whereas effect concentrations were the highest for benzo[a]pyrene. No correlations were found between the acute toxicity data of exposure via the water phase and sediment toxicity data, thus making a prediction of sediment toxicity data impossible. From analytical measurements of chemicals concentration in the compartments overlying, pore water, and bulk sediment, partition coefficients on sediment water partitioning were calculated. The highest partition coefficient ratios for sediment water partitioning were found for the high lipophilic organic substances 4,4-dichlorodiphenyltrichloroethan (DDT) and benzo[a]pyrene. Further, it was found that the main exposure routes in the 28-day sediment toxicity tests were not only chemical but species-dependent. As a result of very differing exposure routes for the tested chemicals and the absence of correlations from the acute to sediment toxicity data, sediment toxicity tests are necessary to assess the toxicity of chemicals on sediment inhabiting organisms. / In den meisten standardisierten ökotoxikologischen Untersuchungen zur Abschätzung des Gefährdungspotentials von Chemikalien für Gewässer erfolgt die Exposition der Organismen über die Wasserphase. Viele Schadstoffe, die in die aquatische Umwelt gelangen, adsorbieren aufgrund ihrer physikalisch-chemischen Eigenschaften an die Oberflächen von Schwebstoffen, sedimentieren und erreichen Sedimentkonzentrationen, die möglicherweise eine Gefahr für sedimentbewohnende Organismen darstellen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden für benthische Invertebraten Testverfahren etabliert, bei denen eine Exposition der Organismen über das Sediment, hier hauptsächlich über die an ingestierte Sedimentbestandteile gebundene oder über die im Porenwasser gelöste Chemikalie (28-Tage Sedimenttoxizitätstest), und über dieWasserphase (Akuttoxizitätstest) erfolgte. Die Invertebraten Chironomus riparius und Lumbriculus variegatus wurden als typische Vertreter endobenthischer Organismen ausgewählt. Für viele Chemikalien liegen Daten zur akuten Toxizität für Algen, Daphnien und Fische für die Wasserexposition vor. Demgegenüber sind nur wenige Daten zur Toxizität für benthische Organismen weder mit einer Wasser- noch mit einer Sedimentexposition vorhanden. Als Modellsubstanzen wurden eine anorganische und sieben organische Substanzen für die Untersuchungen ausgewählt. Ziele dieser Arbeit waren: (1) die Entwicklung und Verbesserung von bestehenden Methoden zur Bestimmung der akuten Toxizität mitWasserexposition und der Sedimenttoxizität für die beiden Invertebraten; (2) die Durchführung der Tests mit den acht ausgewählten Modellsubstanzen zur vergleichenden Betrachtung; (3) die Beurteilung einer Korrelation der Daten zur Akuttoxizität innerhalb der verschiedenen Organismen mit Wasserexposition und einer Korrelation der Daten zwischen den beiden benthischen Organismen bei Sedimentexposition; (4) die Beurteilung einer Korrelation zwischen Daten der benthischen Invertebraten zur Akuttoxizität mit Wasserexposition und Sedimenttoxizität und (5) die Ermittlung und Bewertung der Expositionspfade. Die Akuttoxizitätsdaten von D. magna korrelieren significant (p<0.05) mit den Daten der beiden Invertebraten. Jedoch ist eine Vorhersage aufgrund des kleinen Datensatzes und der großen Unterschiede in der Empfindlichkeit der Arten abzulehnen. Um einer möglichst natürlichen Expositionssituation in Sedimenten zu entsprechen, wurden künstliche Sedimente mit interner Futterquelle, die auch mit der zu testenden Chemikalie kontaminiert wurde, entwickelt und für die Tests mit den Modellsubstanzen verwendet. Ein Nachteil war die unterschiedliche Sedimentzusammensetzung für die beiden Organismen. Um gleiche Expositionsbedingungen für beide Testorganismen zu gewährleisten, wurde ein artifizielles Sediment mit gleicher Zusammensetzung und gleichem Volumenverhältnis zwischen Sediment und Überstandswasser entwickelt. In den Sedimenttoxizitätstests reagierte C. riparius empfindlicher als L. variegatus. Die Effektkonzentrationen waren am niedrigsten für 3,4-Dichloraniline und am höchsten für Benzo[a]pyren. Die Korrelationen zwischen den Ergebnissen aus Akut- und Sedimenttoxizitstests waren nicht signifikant (p>0.05). Folglich läßt sich die Sedimenttoxizität nicht aus Daten zur akuten Toxizität mit Wasserexposition abschätzen. Aus den analytischen Messungen von Sediment-, Porenwasser- und Überstandswasserproben wurden die Koeffizienten für die Verteilung zwischen Sediment und Wasser berechnet. Für die stark lipophilen Stoffe, 4-Dichlorodiphenyltrichloroethan (DDT) und Benzo[a]pyren wurden die höchsten Koeffizienten errechnet. Weiterhin wurde festgestellt, daß die Hauptexpositionspfade in Sedimenttoxizitätstests einerseits von der Chemikalie und andererseits von der verwendeten Spezies abhängen. Aufgrund der Ergebnisse dieser Arbeit und der Tatsache, daß Sedimente “Senken” für viele Schadstoffe sind, müssen zur Erfassung und Bewertung des Gefährdungspotentials von Chemikalien gegenüber Sedimentbewohnern weiterhin Sedimenttoxizitätstests durchgeführt werden.

Die Systematische Toxikologische Analyse (STA) stellt auf Grund der großen Vielfalt und der ständigen Zunahme an toxikologisch relevanten Substanzen eine der größten Herausforderungen in der chemischen Analyse dar. In der vorliegenden Arbeit wurde daher die Eignung der Flüssigchromatographie in Kombination mit der Hybrid-Quadrupol-Flugzeitmassenspektrometrie (LC-QTOF-MS) für diesen Zweck untersucht. Dazu wurden eine Datenbank mit über 7360 und eine CID-Spektrenbibliothek mit mehr als 2720 toxikologisch relevanten Substanzen erstellt und geeignete Probenvorbereitungsmethoden entwickelt. Die Erprobung der Methoden erfolgte an dotierten Blut- und Haarproben. Hierbei zeigte sich, dass die Analyse im Auto-MS/MS-Modus (Messzyklen von MS- und MS/MS-Spektren) eine Identifizierung basischer Substanzen mittels CID-Spektren zwischen 0,5 und 2 ng/ml im Blut ermöglichte. Die Nachweisgrenzen der für 24 Wirkstoffe validierten Methode in Haaren lagen bei 3 bis 15 pg/mg. Die Eignung der LC-QTOF-MS zur STA von Haarproben wurde an 30 Drogentodesfällen und 60 Todesfällen mit bekannter chronischer Medikamenteneinnahme zu Lebzeiten sowie an 77 Blutproben nachgewiesen. Für die Suche nach Metaboliten wurde ein Metaboliten-Tool entwickelt. In der praktischen Anwendung auf Datenfiles von Blut- und Haarproben erwies sich das Tool als wertvolles Hilfsmittel zur Identifizierung unbekannter Peaks und zur Bestätigung von Suchergebnissen in der Datenbank. Zur automatischen Konzentrationsabschätzung identifizierter Substanzen wurde ein Tool „Estimate Concentration“ geschaffen. Die Überprüfung des Verfahrens an realen Blut- und Haarproben durch Vergleich mit HPLC-DAD- und GC-MS-Ergebnissen wies eine gute Übereinstimmung der Konzentrationen auf. Insgesamt zeigten die Untersuchungen, dass die LC-QTOF-MS zurzeit die am besten geeignete Methode für die STA darstellt. Auch bei einem erst später aufkommenden Verdacht kann eine gezielte Suche in dem bereits gemessenen Datenfile durchgeführt werden. / Due to the large variety and the steady increase of toxicologically relevant substances, systematic toxicological analysis (STA) is one of the most difficult tasks in analytical chemistry and, therefore, a steady topic of research and methodical improvement. For this reason, the suitability of liquid chromatography in combination with hybrid quadrupole time-of-flight mass spectrometry (LC-QTOF-MS) for STA was investigated. For this purpose, a database of more than 7360 and a CID spectra library of more than 2720 toxicologically relevant substances and suitable methods for sample preparation were developed. The application was evaluated at spiked blood and hair samples. It was found that the analysis in Auto-MS/MS mode (alternating measurement cycles of MS and MS/MS spectra) allowed substance identification in blood using CID spectra between 0.5 and 2 ng/ml for basic substances. The detection limits of the validated method in hair ranged from 3 to 15 pg/mg for 24 drugs. The suitability of LC-QTOF-MS for STA was tested for hair samples from 30 drug-related death cases and from 60 death cases with known chronic medication as well as for 77 blood samples. For the search of metabolites, a metabolite tool was developed. In the practical application to data files from blood and hair samples, the tool proved to be very helpful for identification of unknown peaks and for confirmation of results obtained only from the database without CID spectra. A tool "Estimate Concentration" was created for automatic estimation of concentrations of identified substances. The application to real blood and hair samples and the comparison of the concentrations with results from HPLC-DAD and GC-MS showed good agreement. Overall, these investigations showed that LC-QTOF-MS is currently the most favorable method for STA. Because of the comprehensive registration of all substances in a sample, the data files can be checked for the presence of certain poisons even later without new measurements.