Thesis (Ph. D.)--University of Wisconsin--Madison, 1983. / Typescript. Vita. eContent provider-neutral record in process. Description based on print version record. Includes bibliographical references (leaves 126-135).

Thesis (Ph. D.)--Auburn University, 2009. / Abstract. Vita. Includes bibliographical references (p. 121-129).

Thesis (Ph. D.)--University of Wisconsin--Madison, 1970. / Typescript. Vita. eContent provider-neutral record in process. Description based on print version record. Includes bibliography.

Made available in DSpace on 2014-10-09T12:50:44Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2014-10-09T13:58:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 00718.pdf: 1498139 bytes, checksum: f702dccfa320f843e27c284e713aefbb (MD5) / Tese (Doutoramento) / IEA/T / Instituto de Quimica, Universidade de Sao Paulo - IQ/USP

Aerolysin is a channel-forming protein toxin secreted by virulent Aeromonas species. The toxin binds to receptors on cells, is proteolytically activated, and then assembles into a heptameric oligomer, which inserts into the plasma membrane forming a functional channel, resulting in cell death. To further characterize these steps receptor identification, the effect of membrane domains on channel formation and the mode of cell death were investigated on T lymphomas. Screening of cell lysates for proaerolysin-binding proteins N-glycosidase and phosphatidylinositol specific phospholipase C treatment and/or purification of these proteins resulted in the identification of a group of glycosylphosphatidylinositol (GPI)-anchored proteins, which included contactin, Thy-1, and placental alkaline phosphatase. Liposomes were used to show that these proteins were receptors for aerolysin as those containing Thy1 or placental alkaline phosphatase in their membranes were at least 100-fold more sensitive to aerolysin than those without protein. Similarly, cells expressing GPI-anchored proteins were 10⁴-fold more sensitive to aerolysin than cells lacking them. This is likely the result of these proteins concentrating aerolysin on the cell surface and thus promoting oligomerization. The fact that these proteins can be localized to membrane domains known as rafts, which are enriched in sphingomyelin and cholesterol has the potential to affect oligomerization. To investigate this possibility erythrocytes and T lymphomas were treated with methyl-β-cyclodextrin, which destroys rafts by sequestering cholesterol. Raft disruption did not decrease the sensitivity of these cells to aerolysin. Similarly, aerolysin was no more active against liposomes containing placental alkaline phosphatase in raft domains than those in which the receptor was in non-raft domains. Thus raft domains do not promote channel formation by aerolysin. The mechanism of cell death was next investigated. At high toxin concentrations cell death was shown to proceed by necrosis, whereas at subnanomolar concentrations aerolysin triggers apoptosis. Using inactive aerolysin variants it was determined that apoptosis was not a result of binding to GPI-anchored proteins nor was it triggered by receptor clustering induced by oligomerization. Instead the formation of a small number of channels was shown to trigger apoptosis. Taken together these studies have helped to clarify the mode of action of aerolysin. / Graduate

Made available in DSpace on 2014-10-09T12:42:35Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2014-10-09T14:01:24Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Tese (Doutoramento) / IPEN/T / Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN-CNEN/SP / FAPESP:09/10305-8

Made available in DSpace on 2014-10-09T12:50:44Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2014-10-09T13:58:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 00718.pdf: 1498139 bytes, checksum: f702dccfa320f843e27c284e713aefbb (MD5) / Tese (Doutoramento) / IEA/T / Instituto de Quimica, Universidade de Sao Paulo - IQ/USP

Made available in DSpace on 2014-10-09T12:42:35Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2014-10-09T14:01:24Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / As toxinas de veneno de serpentes têm como principal função alterar a homeostase das presas para fins de alimentação ou defesa. O estudo aprofundado da composição do veneno de serpentes é importante para a produção de soros antiofídicos mais eficientes, para a descoberta de novos fármacos e na compreensão de processos biológicos, ecológicos e evolutivos. As pesquisas com toxinas têm mostrado uma versatilidade natural, refinada pela evolução, na diversificação de funções em famílias de proteínas recrutadas de suas funções endógenas, por meio de sucessivas duplicações e acumulo de mutações levando a uma evolução acelerada. A miríade de toxinas disponíveis e sua diversidade de funções ainda não foram completamente descritas. A combinação das análises em larga escala do transcriptoma de novo da glândula de veneno e do proteoma do veneno permite elaborar um perfil mais completo do toxinoma do veneno, permitindo inclusive um aumento na sensibilidade da detecção de toxinas pouco representadas e inesperadas nos venenos. O objetivo geral deste estudo foi analisar o toxinoma do veneno de uma das mais perigosas espécies australianas, a Pseudonaja textilis (Elapidae). Foi possível identificar no veneno as toxinas: fatores de coagulação de veneno do complexo protrombinase, subunidades de fosfolipases A2 (PLA2) da neurotoxina textilotoxin e PLA2 de atividade procoagulante, neurotoxinas tipo three-finger toxin (3FTx), inibidores de protease do tipo-kunitz textilinin, e pela primeira vez, uma nova variante de 3FTx, lectinas tipo C, CRiSP além de indícios de toxinas de lagarto Heloderma e outras proteínas candidatas a toxinas como calreticulin e dipeptidase 2. Metaloproteinases, pouco estudadas em Elapidae, foram clonadas e detectadas no veneno por ensaios de fracionamento e imunoreatividade. A análise do transcriptoma identificou novas isoformas e variantes de toxinas, principalmente das 3FTx e dos inibidores de serinoproteases, assim como transcritos de toxinas que não foram detectadas no veneno e que merecem mais investigações. O quadro de sintomas com acidentes em humanos é bem explicado pelas toxinas identificadas, porém, em seu habitat natural, as toxinas pouco conhecidas e até então não descritas devem ter funções importantes e específicas na predação. Identificar esta diversidade de variantes é importante para entender o modo de ação das toxinas. / Tese (Doutoramento) / IPEN/T / Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN-CNEN/SP / FAPESP:09/10305-8

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