Submitted by Luciane Willcox (luwillcox@gmail.com) on 2016-09-01T17:09:57Z No. of bitstreams: 1 Tese Ligia Kalb.pdf: 5952650 bytes, checksum: a59edd5e470c45308c3131321c0d4992 (MD5) / Approved for entry into archive by Luciane Willcox (luwillcox@gmail.com) on 2016-09-01T17:22:37Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Tese Ligia Kalb.pdf: 5952650 bytes, checksum: a59edd5e470c45308c3131321c0d4992 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-01T17:22:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese Ligia Kalb.pdf: 5952650 bytes, checksum: a59edd5e470c45308c3131321c0d4992 (MD5) Previous issue date: 2015 / CNPq / Instituto Carlos Chagas, Fundação Oswaldo Cruz, Fiocruz-PR, Curitiba, PR, Brasil / O tráfego vesicular mediado por clatrina, mecanismo pelo qual proteínas e lipídeos são transportados entre organelas envolvidas por membrana, é responsável por uma grande proporção de interiorização de membrana plasmática (endocitose) e de transporte a partir da Rede Trans Golgi para o sistema endossomal. Os eventos mediados por clatrina ainda são pouco conhecidos no protozoário Trypanosoma cruzi, o agente causador da doença de Chagas na América Latina. Além disso, estudos de sequências genômicas demonstram um extremo grau de divergência entre tripanosomatídeos, animais e fungos, com cerca de 1/3 das proteínas preditas sem função conhecida. Neste estudo, a expressão do gene e a localização das proteínas cadeias pesada (TcCHC) e leve (TcCLC) de clatrina foram investigadas em diferentes formas evolutivas de T. cruzi (epimastigotas, tripomastigotas e amastigotas), utilizando anticorpos policlonais e monoclonais produzidos contra as proteínas recombinantes de T. cruzi. A localização celular da proteína epsina (TcEpsina), uma importante proteína associada à clatrina, também foi investigada através de sua fusão com GFP e subsequente imunolocalização. Análise por microscopia confocal revelou um acúmulo de TcEpsina, TcCHC e TcCLC na porção anterior das células, onde a bolsa flagelar e complexo de Golgi estão localizados. A TcCLC parcialmente colocalizou com o marcador de Golgi TcRAB7-GFP e com albumina endocitada, mas não co-localizou com transferrina, uma proteína endocitada principalmente via vesículas não revestidas formadas no complexo citóstoma/citofaringe. As cadeias leve e pesada de clatrina tipicamente localizaram-se na porção anterior ao cinetoplasto, região em que encontram-se a bolsa flagelar e o Complexo de Golgi. Nossos dados indicam que em formas epimastigotas de T. cruzi a endocitose de albumina mediada por clatrina ocorre na bolsa flagelar, enquanto endocitose de transferina independente de clatrina ocorre no complexo citóstoma/citofaringe. Para uma análise proteômica dos complexos proteicos associados à clatrina e epsina, a cadeia leve de clatrina foi fusionada às proteínas A e C e a epsina foi fusionada a GFP e ambas as proteínas foram submetidas à criomoagem seguida da imunoprecipitação dos complexos a elas associados. Esta metodologia permitiu a identificação de suas proteínas associadas por espectrometria de massas, tais como os Complexos Adaptadores AP-1 e AP-4, vSNAREs, Rab4, Rab 11, epsina, tepsina, AP180, Sec1, Auxilina e Scamp. Foi demonstrada também a presença de proteínas hipotéticas nesta análise. Esta metodologia nos permitiu sugerir a forma com a qual ocorre o tráfego de vesículas em T. cruzi e como ocorre a maturação dos reservossomos, os quais acumulam funções de endossomo inicial, endossomo tardio e lisossomo. Análises futuras são necessárias a fim de comprovar estas hipóteses.