Os estudos com traqueídes vasculares em Caryophyllales têm focalizado questões filogenéticas e funcionais. Embora sejam descritas como traqueídes, com espessamento da parede secundária superior a 2µm, o relato de WBTs em diferentes tecidos em outras famílias evidencia que a definição dessas células não está bem estabelecida. O objetivo deste trabalho é compreender a ontogenia das traqueídes vasculares de Pilosocereus aurisetus (cacto colunar), descrevendo a sua estrutura em nível celular e bioquímico, bem como suas implicações funcionais e evolutivas. Para isso foi descrita a ontogênese, como base para o estudo de composição de parede, e anticorpos foram utilizados para melhor entendimento das moléculas de relevância funcional. Além disso, uma revisão anatômica que sintetiza o conhecimento atual sobre ocorrência das WBT, polimorfismo do lenho e diversidade de hábitos foi inserida em um contexto filogenético, a fim de esclarecer o papel do polimorfismo do lenho na evolução de Cactoideae. Plântulas foram incluídas em parafina para obtenção de cortes seriados, analisados em microscopia óptica e confocal. A análise de composição de parede celular foi feita com tecido xilemático de plântulas, cujos polissacarídeos foram sujeitos a hidrólise ácida, seguida de análise em cromatografia. Na imunolocalização foram utilizados os anticorpos anti-galactano LM5 e anti-arabinano LM6, para pectinas, e anti-manano, para hemiceluloses. Dados sobre a presença de traqueídes vasculares e do tipo de lenho em Cactaceae foram coletados da literatura e mapeados em uma filogenia robusta. A grande proporção de parede primária, associada à deposição de galactano, permite a função de armazenamento de água. Além disso, o aumento de parede secundária associada à deposição de manano na base, sugere função de sustentação nesta região, ainda que, somente a formação do lenho fibroso pareça fornecer o suporte necessário para que um cacto colunar atinja a altura de um adulto. Tal processo parece ter sido a predisposição anatômica crucial para a evolução dos cactos colunares. O presente estudo fornece um panorama amplo e novas evidências sobre a origem e função das traqueídes vasculares de Cactaceae. / Studies with wide-band tracheids have adressed phylogenetic and functional questions. Although these cells have been described as tracheids, with secondary cell walls thicker than 2µm, their recent register in different tissues of other families has pointed out that this definition may not be well established. The aim of the present study is to understand the ontogeny of the wide-band tracheids in Pilosocereus aurisetus (a columnar cactus), describing their structure at both celular and biochemical levels, and to investigate their possible functional and evolutionary implications for the Cactoideae as a whole. Therefore, Pilosocereus aurisetus ontogeny was studied as basis to cell wall composition analyses. Such analyses involved the use of antibodies and the identification of molecules of functional relevance. Furthermore, an anatomical review that summarizes the current knowledge about wide-band tracheid occurrence, wood polymorphism, and habit diversity was analyzed within a phylogenetic framework to investigate the role of polymorphic wood in Cactoideae evolution. Seedlings were embedded in paraffin, and the resulting sections were analyzed in optical and confocal microscopy. Studying the cell wall composition in seedling xylem involved the use of acid hydrolization of polysaccharides followed by chromatography analysis. The antibodies used for imunocitolocalization were anti-galactan LM5 and anti-arabinan LM6, for pectins, and anti-mannan, for hemicelluloses. Data about wide-band tracheids occurrence and wood polymorphism in Cactaceae were collected from the literature and mapped in a robust phylogeny for the subfamily. The prevalent proportion of primary cell wall with galactan suggests a water storage function for the wide-band tracheids. Furthermore, the rise of secondary cell wall deposition, and the high concentration of mannan in the cactus base suggest a sustaining function for this region. However, the fibrous wood development alone seems to provide enough support to sustain a mature columnar cactus. Such process may have been the most important anatomical prerequisite in the evolution of columnar cacti. The present study offers an overview and new evidences for the origin and function of wide-band tracheids.

Os estudos com traqueídes vasculares em Caryophyllales têm focalizado questões filogenéticas e funcionais. Embora sejam descritas como traqueídes, com espessamento da parede secundária superior a 2µm, o relato de WBTs em diferentes tecidos em outras famílias evidencia que a definição dessas células não está bem estabelecida. O objetivo deste trabalho é compreender a ontogenia das traqueídes vasculares de Pilosocereus aurisetus (cacto colunar), descrevendo a sua estrutura em nível celular e bioquímico, bem como suas implicações funcionais e evolutivas. Para isso foi descrita a ontogênese, como base para o estudo de composição de parede, e anticorpos foram utilizados para melhor entendimento das moléculas de relevância funcional. Além disso, uma revisão anatômica que sintetiza o conhecimento atual sobre ocorrência das WBT, polimorfismo do lenho e diversidade de hábitos foi inserida em um contexto filogenético, a fim de esclarecer o papel do polimorfismo do lenho na evolução de Cactoideae. Plântulas foram incluídas em parafina para obtenção de cortes seriados, analisados em microscopia óptica e confocal. A análise de composição de parede celular foi feita com tecido xilemático de plântulas, cujos polissacarídeos foram sujeitos a hidrólise ácida, seguida de análise em cromatografia. Na imunolocalização foram utilizados os anticorpos anti-galactano LM5 e anti-arabinano LM6, para pectinas, e anti-manano, para hemiceluloses. Dados sobre a presença de traqueídes vasculares e do tipo de lenho em Cactaceae foram coletados da literatura e mapeados em uma filogenia robusta. A grande proporção de parede primária, associada à deposição de galactano, permite a função de armazenamento de água. Além disso, o aumento de parede secundária associada à deposição de manano na base, sugere função de sustentação nesta região, ainda que, somente a formação do lenho fibroso pareça fornecer o suporte necessário para que um cacto colunar atinja a altura de um adulto. Tal processo parece ter sido a predisposição anatômica crucial para a evolução dos cactos colunares. O presente estudo fornece um panorama amplo e novas evidências sobre a origem e função das traqueídes vasculares de Cactaceae. / Studies with wide-band tracheids have adressed phylogenetic and functional questions. Although these cells have been described as tracheids, with secondary cell walls thicker than 2µm, their recent register in different tissues of other families has pointed out that this definition may not be well established. The aim of the present study is to understand the ontogeny of the wide-band tracheids in Pilosocereus aurisetus (a columnar cactus), describing their structure at both celular and biochemical levels, and to investigate their possible functional and evolutionary implications for the Cactoideae as a whole. Therefore, Pilosocereus aurisetus ontogeny was studied as basis to cell wall composition analyses. Such analyses involved the use of antibodies and the identification of molecules of functional relevance. Furthermore, an anatomical review that summarizes the current knowledge about wide-band tracheid occurrence, wood polymorphism, and habit diversity was analyzed within a phylogenetic framework to investigate the role of polymorphic wood in Cactoideae evolution. Seedlings were embedded in paraffin, and the resulting sections were analyzed in optical and confocal microscopy. Studying the cell wall composition in seedling xylem involved the use of acid hydrolization of polysaccharides followed by chromatography analysis. The antibodies used for imunocitolocalization were anti-galactan LM5 and anti-arabinan LM6, for pectins, and anti-mannan, for hemicelluloses. Data about wide-band tracheids occurrence and wood polymorphism in Cactaceae were collected from the literature and mapped in a robust phylogeny for the subfamily. The prevalent proportion of primary cell wall with galactan suggests a water storage function for the wide-band tracheids. Furthermore, the rise of secondary cell wall deposition, and the high concentration of mannan in the cactus base suggest a sustaining function for this region. However, the fibrous wood development alone seems to provide enough support to sustain a mature columnar cactus. Such process may have been the most important anatomical prerequisite in the evolution of columnar cacti. The present study offers an overview and new evidences for the origin and function of wide-band tracheids.

O eucalipto (Eucalyptus spp.) é a arbórea comercial mais importante do Brasil, tendo um papel marcante na indústria de papel e celulose. O aumento no rendimento da extração da polpa celulósica e a redução nos custos de produção são os principais objetivos dos programas de melhoramento genético de eucalipto. Como o processo de deslignificação é fundamental para a extração da celulose, é suma importante compreender a biossíntese e deposição da parede celular secundária durante a xilogênese. A diferenciação dos elementos traqueais é caracterizada pela deposição da parede celular secundária, logo estudos de expressão gênica envolvendo essas células xilemáticas é uma estratégia interessante. Foi realizado o sequenciamento do transcriptoma de células em suspensão em diferentes fases de desenvolvimento (células meristemáticas, células alongadas e elementos traqueais) gerando 348 milhões de leituras paired-end com 100 pb cada uma, com a maioria das leituras (80 %) alinhada e mapeada contra genoma de referência. A análise dos genes diferencialmente expressos (GDEs) identificou um total de 3426, 1044 e 4665 GDEs nas comparações M vs. A, A vs. T e M vs. T, respectivamente. Sendo 1316, 567, 2637 genes up-regulated e 2110, 476, 2028 genes down-regulated nas comparações M/A, T/A, T/M, respectivamente. Um total de 4229 genes foram anotados funcionalmente e mapeados em 310 rotas identificadas pelo KEGG, obtendo-se 40 sequências relacionadas à rota dos fenilpropanoides, a quinta rota mais representativa. Quando foram considerados os GDEs com log2 fold change ≤ -1,5 e log2 fold change ≥ 1,5, 34 rotas metabólicas foram identificadas, destas, a principal foi a rota dos fenilpropanoides, com 14 sequências relacionadas a enzima lactoperoxidase. Foi realizado o enriquecimento dos termos GO e nas redes a biossíntese de celulose e xiloglucanos, rotas de sinalização de etileno, rotas de biogênese e organização da parede celular vegetal e de morte celular, entre outras, foram destaque. Identificaram-se 31 fatores de transcrição, sendo 3 fatores de transcrição MYB, 2 fatores de transcrição NAC e 10 fatores de transcrição WRKY. Além disso, 21, 7 e 23 genes da rota da celulose e hemiceluloses e 24, 8 e 21 genes da rota de síntese dos monômeros da lignina foram constatados nas comparações M vs. A, A vs. T e M vs. T, respectivamente. Assim como, foram encontrados genes codificadores de lacases e peroxidases, participantes da polimerização dos monômeros da lignina. Os resultados possibilitaram uma compreensão mais ampla da regulação transcricional da biossíntese da parede celular secundária nas células xilemáticas de eucalipto e revelou novos genes participantes da xilogênese. Este conjunto de dados transcricionais ajudará na realização de manipulações genéticas visando à obtenção de plantas de eucalipto com características de extratibilidade aspiradas pela indústria. / Eucalyptus (Eucalyptus spp.) is the most important commercial tree in Brazil, playing a significant role in the pulp and paper industry. An increase in the yield of cellulosic pulp extraction and a reduction of production cost are the main objectives of the eucalyptus breeding programs. As the delignification process is fundamental for the extraction of cellulose, it is highly important to understand the biosynthesis and deposition of the secondary cell wall during xylogenesis. The differentiation of the tracheary elements is characterized by the deposition of the secondary cell wall, so studies of gene expression involving these xylem cells is an interesting strategy. Sequencing of the transcriptome of cells in suspension at different stages of development (meristematic cells, elongated cells and tracheal elements) was performed generating 348 million paired-end reads with 100 bp each, with most readings (80%) aligned and mapped against reference genome. The analysis of differentially expressed genes (DEG) identified a total of 3426, 1044 and 4665 DEGs in the comparisons M vs. A, A vs. T and M vs. T, respectively. Being 1316, 567, 2637 up-regulated genes and 2110, 476, 2028 down-regulated genes in the M/A, T/A, T/M, respectively. A total of 4229 genes were functionally annotated and mapped in 310 routes identified by the KEGG, yielding 40 sequences related to the phenylpropanoid route, the fifth most representative route. When DEGs with log2 fold change ≤ - 1.5 e log2 fold change ≥ 1.5 were considered, 34 metabolic routes were identified. From these, the main route was the phenylpropanoids pathway, with 14 sequences correlated to the enzyme lactoperoxidase. The GO terms enrichment was carried out and the networks of cellulose and xyloglucans biosynthesis, ethylene signaling routes, biogenesis routes and the plant cell wall organization and cell death, among others, were highlighted. Thirty-one transcription factors were identified, being 3 MYB transcription factors, 2 NAC transcription factors and 10 WRKY transcription factors. In addition, 21, 7 and 23 genes of the cellulose and hemicelluloses pathway and 24, 8 and 21 genes of lignin monomer synthesis route were found in the M vs. A, A vs. T and M vs. T comparisons, respectively. Besides this, encoding genes laccases and peroxidases were found, participating in the polymerization of lignin monomers. The results allowed a broader understanding of the transcriptional regulation of secondary cell wall biosynthesis in eucalyptus xylem cells and revealed new genes participating in xylogenesis. This set of transcriptional data will help in the accomplishment of genetic manipulations in order to obtain eucalyptus plants with extractability characteristics aspired by the industry.

Lignin is the second most abundant biopolymer on earth and is found in the wood (xylem) of vascular land plants. To transport the hydro-mineral sap, xylem forms specialized conduit cells, called tracheary elements (TEs), which are hollow dead cylinders reinforced with lateral secondary cell walls (SCW). These SCWs incorporate lignin to gain mechanical strength, water impermeability and resistance against pathogens. The aim of this thesis is to understand the spatio-temporal deposition of lignin during TE differentiation and the relationship with its neighbouring cells. In vitro TE differentiating cell cultures of Zinnia elegans and Arabidopsis thaliana are ideal tools to study this process: cells differentiate simultaneously into 30-50% TEs while the rest remain parenchymatic (non-TEs). Live-cell imaging of such TEs indicated that lignification occurs after programmed cell death (PCD), in a non-cell autonomous manner, in which the non-TEs provide the lignin monomers. This thesis confirms that lignification occurs and continues long after TE PCD in both in vitro TE cultures and whole plants using biochemical, pharmacological and cytological methods. The cooperative supply of lignin monomers by the non-TEs was demonstrated by using Zinnia and Arabidopsis in vitro TE cultures. Inhibitor experiments revealed further that the non-TEs supply reactive oxygen species (ROS) to TEs and that ROS are required for TE post-mortem lignification. Characterization of the non-TEs showed an enlarged nucleus with increased DNA content, thus indicating that non-TEs are in fact endoreplicated xylem parenchyma cells (XP). The cooperative lignification was confirmed in whole plants by using knock-out mutants in a lignin monomer synthesis gene, which exhibit reduced TE lignification. The XP specific complementation of these mutants led to nearly completely rescuing the TE lignin reduction. Using microscopic techniques, the spatial distribution of lignin was analyzed in TEs from in vitro cultures and whole plants, revealing that lignification is restricted to TE SCWs in both protoxylem and metaxylem. These specific deposition domains were established by phenoloxidases, i.e. laccases localized to SCWs and peroxidases, present in SCWs and the apoplastic space. Laccases were cell-autonomously produced by developing TEs, indicating that the deposition domains are defined before PCD. Altogether, these results highlight that the hydro-mineral sap transport through TEs is enabled by the spatially and temporally controlled lignification of the SCW. Lignification occurs post-mortem by the supply of monomers and ROS from neighbouring XP cells and is restricted to specific deposition domains, defined by the pre-mortem sequestration of phenoloxidases.

O eucalipto (Eucalyptus spp.) é a arbórea comercial mais importante do Brasil, tendo um papel marcante na indústria de papel e celulose. O aumento no rendimento da extração da polpa celulósica e a redução nos custos de produção são os principais objetivos dos programas de melhoramento genético de eucalipto. Como o processo de deslignificação é fundamental para a extração da celulose, é suma importante compreender a biossíntese e deposição da parede celular secundária durante a xilogênese. A diferenciação dos elementos traqueais é caracterizada pela deposição da parede celular secundária, logo estudos de expressão gênica envolvendo essas células xilemáticas é uma estratégia interessante. Foi realizado o sequenciamento do transcriptoma de células em suspensão em diferentes fases de desenvolvimento (células meristemáticas, células alongadas e elementos traqueais) gerando 348 milhões de leituras paired-end com 100 pb cada uma, com a maioria das leituras (80 %) alinhada e mapeada contra genoma de referência. A análise dos genes diferencialmente expressos (GDEs) identificou um total de 3426, 1044 e 4665 GDEs nas comparações M vs. A, A vs. T e M vs. T, respectivamente. Sendo 1316, 567, 2637 genes up-regulated e 2110, 476, 2028 genes down-regulated nas comparações M/A, T/A, T/M, respectivamente. Um total de 4229 genes foram anotados funcionalmente e mapeados em 310 rotas identificadas pelo KEGG, obtendo-se 40 sequências relacionadas à rota dos fenilpropanoides, a quinta rota mais representativa. Quando foram considerados os GDEs com log2 fold change ≤ -1,5 e log2 fold change ≥ 1,5, 34 rotas metabólicas foram identificadas, destas, a principal foi a rota dos fenilpropanoides, com 14 sequências relacionadas a enzima lactoperoxidase. Foi realizado o enriquecimento dos termos GO e nas redes a biossíntese de celulose e xiloglucanos, rotas de sinalização de etileno, rotas de biogênese e organização da parede celular vegetal e de morte celular, entre outras, foram destaque. Identificaram-se 31 fatores de transcrição, sendo 3 fatores de transcrição MYB, 2 fatores de transcrição NAC e 10 fatores de transcrição WRKY. Além disso, 21, 7 e 23 genes da rota da celulose e hemiceluloses e 24, 8 e 21 genes da rota de síntese dos monômeros da lignina foram constatados nas comparações M vs. A, A vs. T e M vs. T, respectivamente. Assim como, foram encontrados genes codificadores de lacases e peroxidases, participantes da polimerização dos monômeros da lignina. Os resultados possibilitaram uma compreensão mais ampla da regulação transcricional da biossíntese da parede celular secundária nas células xilemáticas de eucalipto e revelou novos genes participantes da xilogênese. Este conjunto de dados transcricionais ajudará na realização de manipulações genéticas visando à obtenção de plantas de eucalipto com características de extratibilidade aspiradas pela indústria. / Eucalyptus (Eucalyptus spp.) is the most important commercial tree in Brazil, playing a significant role in the pulp and paper industry. An increase in the yield of cellulosic pulp extraction and a reduction of production cost are the main objectives of the eucalyptus breeding programs. As the delignification process is fundamental for the extraction of cellulose, it is highly important to understand the biosynthesis and deposition of the secondary cell wall during xylogenesis. The differentiation of the tracheary elements is characterized by the deposition of the secondary cell wall, so studies of gene expression involving these xylem cells is an interesting strategy. Sequencing of the transcriptome of cells in suspension at different stages of development (meristematic cells, elongated cells and tracheal elements) was performed generating 348 million paired-end reads with 100 bp each, with most readings (80%) aligned and mapped against reference genome. The analysis of differentially expressed genes (DEG) identified a total of 3426, 1044 and 4665 DEGs in the comparisons M vs. A, A vs. T and M vs. T, respectively. Being 1316, 567, 2637 up-regulated genes and 2110, 476, 2028 down-regulated genes in the M/A, T/A, T/M, respectively. A total of 4229 genes were functionally annotated and mapped in 310 routes identified by the KEGG, yielding 40 sequences related to the phenylpropanoid route, the fifth most representative route. When DEGs with log2 fold change ≤ - 1.5 e log2 fold change ≥ 1.5 were considered, 34 metabolic routes were identified. From these, the main route was the phenylpropanoids pathway, with 14 sequences correlated to the enzyme lactoperoxidase. The GO terms enrichment was carried out and the networks of cellulose and xyloglucans biosynthesis, ethylene signaling routes, biogenesis routes and the plant cell wall organization and cell death, among others, were highlighted. Thirty-one transcription factors were identified, being 3 MYB transcription factors, 2 NAC transcription factors and 10 WRKY transcription factors. In addition, 21, 7 and 23 genes of the cellulose and hemicelluloses pathway and 24, 8 and 21 genes of lignin monomer synthesis route were found in the M vs. A, A vs. T and M vs. T comparisons, respectively. Besides this, encoding genes laccases and peroxidases were found, participating in the polymerization of lignin monomers. The results allowed a broader understanding of the transcriptional regulation of secondary cell wall biosynthesis in eucalyptus xylem cells and revealed new genes participating in xylogenesis. This set of transcriptional data will help in the accomplishment of genetic manipulations in order to obtain eucalyptus plants with extractability characteristics aspired by the industry.