Como em diversos tumores sólidos, no câncer de cabeça e pescoço (HNSCC) a presença de metástases é um importante fator de mal prognóstico. Até o momento, estudos indicam que, no microambiente inflamatório tumoral, a estimulação com o Fator de Necrose Tumoral Alpha (TNF-?) leva à ativação de diferentes vias moleculares, como a via do Fator Nuclear Kappa-B (NF-kB) e PI3K/AKT, que inibem GSK3? e consequentemente, promovem a estabilização e translocação nuclear de SNAIL e betacatenina. De um modo geral, em diversos tipos de câncer, enquanto beta-catenina tem ação em promover a proliferação celular, membros da família SNAIL são capazes de induzir o processo de transição epitélio-mesenquimal (EMT). Sabe-se que os eventos de EMT estão envolvidos tanto na iniciação de metástases quanto na geração de célulastronco tumorais (CSCs), que por sua vez estão associadas à falha terapêutica e recidiva, devido à características que lhe conferem resistência aos tratamentos convencionais. Ao silenciar a expressão gênica de modo pós-transcricional, microRNAs (miRs) tem sido associados à regulação tanto da EMT quanto da geração de CSCs. Com uso da abordagem de High-Content Screening (HCS, análise celular multiparamétrica quantitativa por microscopia automatizada), buscamos investigar a capacidade de um grupo de 30 miRs humanos, muitos deles envolvidos em vias inflamatórias e na pluripotência, em modular aspectos relacionados a sobrevivência celular e EMT, em uma linhagem celular derivada de HNSCC (FADU) sob estímulo inflamatório. Inicialmente, avaliamos o potencial do TNF-? em modular parâmetros morfométricos, bem como a presença/localização de proteínas relacionadas com a EMT e capacidade migratória. Posteriormente, avaliamos o efeito de moléculas miméticas dos miRs em suprimir ou potencializar a sobrevivência celular e EMT em células estimuladas com TNF-?, seguido da identificação de transcritos alvos preditos (bem como das vias de sinalização enriquecidas para estes alvos) comumente alvejados por grupos de miRs que levaram a alterações multiparamétricas similares. De modo geral, miRs que alvejaram RELA e AKT2/AKT3 foram responsáveis pela redução na proliferação celular e EMT, enquanto o oposto foi observado em miRs que alvejaram GSK3B e ARHGAP5 (inibidor de RhoA). O silenciamento por siRNAs específicos contra RELA e CTNNB1, causou à redução na sobrevivência celular, enquanto que o silenciamento de AKT1 e CTNNB1 levou à redução na expressão proteica de SNAIL/SLUG. Finalmente, o silenciamento de RELA, AKT1, GSK3B e CTNNB1 levou a redução na sobrevivência celular e indução a apoptose mesmo na ausência de estimulação com TNF-?. Como um todo, nós demonstramos que a abordagem de HCS permitiu a identificação de miRs com efeitos fenotípicos similares (no contexto de proliferação e EMT) e que, a predição de alvos compartilhados por estes miRs, levou à identificação de alvos e vias de sinalização relevantes do ponto de vista terapêutico. / Like many solid cancers, in head and neck cancer (HNC) the presence of metastases is an important factor of poor prognosis. To date, studies indicate that, in the tumor inflammatory microenvironment, stimulation with Tumor Necrosis Factor Alpha (TNF-?) leads to the activation of different molecular pathways, such as the Nuclear Factor-Kappa B (NF-kB) and PI3K/AKT pathway, inhibiting GSK3? and the degradation of SNAIL and beta-catenin, stabilizing them promoting their nuclear translocation. In general, in several types of cancer, while beta-catenin acts to promote cell proliferation, members of the SNAIL family induce the epithelial-mesenchymal (EMT) transition process. It is known that EMT events are involved both in the initiation of metastases and generation of cancer stem cells (CSCs), which in turn are associated with therapeutic failure and relapse, due to its properties that confer resistance to conventional treatments. By silencing gene expression in a post-transcriptional fashion, microRNAs (miRs) have been associated with the regulation of both EMT and CSCs generation. Using the HighContent Screening (HCS) approach, we sought to investigate the ability of a group of 30 human miRs, many of them involved in inflammatory pathways and pluripotency, to modulate aspects related to cell survival and EMT, in a HNSCC-derived cell line (FADU) under inflammatory stimuli. Initially, we evaluated the potential of TNF-? in modulating morphometric parameters, as well as the presence/location of EMT-related proteins and migratory capacity. Subsequently, we evaluated the effect of miRs mimetic molecules on suppressing or potentiating cell survival and EMT in TNF-?-stimulated cells, followed by the identification of predicted target transcripts (as well as signaling pathways enriched for these targets) commonly targeted by groups of miRs that led to similar multiparametric changes. Overall, miRs that targeted RELA and AKT2/AKT3 were responsible for the reduction in cell proliferation and EMT, while the opposite was observed in miRs that targeted GSK3B and ARHGAP5 (RhoA inhibitor). Gene silencing by specific siRNAs against RELA and CTNNB1 caused a reduction in cell survival, while silencing of AKT1 and CTNNB1 led to reduced protein expression of SNAIL/SLUG. Finally, the silencing of RELA, AKT1, GSK3B and CTNNB1 led to a reduction in cell survival and induction of apoptosis even in the absence of TNF-? stimulation. As a whole, we demonstrated that the HCS approach allowed the identification of miRs with similar phenotypic effects (in the context of proliferation and EMT) and that the prediction of targets shared by these miRs led to the identification of relevant targets and signaling pathways from the therapeutic point of view.

Sabemos hoje que os tumores sólidos apresentam uma composição celular heterogênia e que apenas uma pequena parcela dessas células apresenta capacidade de se proliferar e gerar novos tumores. Estudos prévios sobre a formação do câncer de mama têm sido realizados com base na combinação dos marcadores de superfície celular CD44 e CD24. Já foi demonstrado que uma subpopulação de células do câncer de mama com alta expressão de CD44 e baixa expressão de CD24 (CD44+/CD24-) tem maior capacidade de gerar tumores, quando comparadas com a subpopulação de células CD44-/CD24+. O objetivo do estudo foi identificar a taxa de células com fenótipo CD44+/CD24- presentes nos tumores mamários e relaciona-la com a taxa de comprometimento dos linfonodos axilares ipsilaterais por neoplasia, além de avaliar também sua relação com outros fatores sabidamente relacionados com mal prognóstico da paciente. Pacientes e métodos: avaliamos prospectivamente 53 amostras cirúrgicas provenientes de 42 pacientes com diagnóstico histopatológico de carcinoma de mama, quantificando as células CD44+/CD24- por citometria de fluxo. Relacionamos a porcentagem destas células encontrada em cada amostra com o comprometimento axilar, os receptores hormonais e Her-2, a idade da paciente, o grau histológico do tumor, o diâmetro patológico do tumor e o tipo histológico. Resultados: verificamos um significante aumento da população de células CD44+/CD24- no grupo de carcinomas ductais invasivos em pacientes que apresentavam metástase axilar [mediana 8,53% (3,6 71,2%)] em relação ao grupo de pacientes sem linfonodos comprometidos pela neoplasia [mediana 1,49% (0,3 17,1%)] (p=0,0002). Conclusão: concluímos então que quando estudamos vários tumores mamários invasivos de mesma classificação histológica, podemos notar que existe uma variação na quantidade de células CD44+/CD24- entre eles. Nosso estudo mostrou que essa variação está relacionada à agressividade tumoral e à sua capacidade de gerar metástases já que, tumores com maior quantidade de células CD44+/CD24- apresentam maior taxa de comprometimento dos linfonodos axilares. / It is known that solid tumors are composed by a heterogeneous combination of cells and only a small portion of these cells has the capacity to proliferate and generate new tumors. Previous studies about the breast cancer initiation have been based on a combination of CD44 and CD24cell surface markers. It has been shown that this subpopulation of breast cancer cells with high expression of CD44 and low expression of CD24 (CD44+/CD24-) has a greater capacity to generate tumors when compared with the subpopulation of cells CD44- /CD24+. The study objective was to identify whether the rate of cells with CD44+/CD24- phenotype present in breast tumors is related with the rate of ipsilateral lymph node metastasis, in addition to evaluate its relationship with other risk factors known to be related with worst prognosis. Patients and methods: we prospectively evaluated 53 surgical specimens from 42 patients with histological diagnosis of breast cancer, quantifying CD44+/CD24- cells through flow cytometry. We list the percentage of these cells found in each sample with axillary lymph node status, hormone receptors and Her-2, patient age, histological grade, pathological tumor diameter and histological tumorclassification. Results: we find a significant increase of CD44+/CD24- population in the invasive ductal carcinomas, in patients with axillary metastasis [median 8.53% (3.6 - 71.2%)] than in the group of patients without lymph nodes metastasis [median 1.49% (0.3 - 17.1%)] (p = 0.0002). Conclusion: when we studied several invasive breast tumors of same histological classification, we note that there is variation in the number of CD44+/CD24- cells. Our study showed that this variation is related to tumor aggressiveness and their ability to generate metastasis, because tumors with high rate of CD44+/CD24- cells have a higher rate of lymph node metastasis.

As neoplasias mamárias apresentam um grande desafio tanto para a medicina humana, quanto para a medicina veterinária. Esses tumores apresentam ampla heterogeneidade intertumoral e intratumoral, dificultando assim a busca por tratamentos eficazes. Recentemente, pesquisadores tem voltado sua atenção para uma população de células que apresentam características muito semelhantes as células-tronco. São as chamadas células iniciadoras de tumores (CITs). Estas são descritas como as principais responsáveis por falhas nas quimioterapias e no surgimento de recidivas tumorais, devido ao seu potencial tumorigênico, de auto-renovação e de resistência a drogas antineoplásicas. Entretanto, o estudo dessas células é limitado pelas dificuldades no isolamento e na caracterização pós-enriquecimento dessas células, devido à perda do fenótipo em modelos in vitro. Sendo assim, vários estudos estão buscando maneiras alternativas de enriquecer essa população. Uma das maneiras mais utilizadas, baseia-se na indução do processo de transição epitélio-mesenquimal, através da superexpressão de fatores de transcrição como SNAI1, SLUG, ZEB1 e ZEB2. Sendo assim, nós objetivamos expressar de maneira exógena os fatores de transcrição SLUG e ZEB1 em células oriundas de carcinomas mamários caninos, caracterizar seus efeitos nessas células e observar se esses fatores de transcrição seriam capazes de induzir o fenótipo de CIT. Primeiramente, quatro amostras de carcinomas mamários caninos foram analisados quanto sua morfologia e os níveis de expressão gênica de quatro fatores de transcrição associados a transição epitélio-mesenquimal: SLUG, STAT3, ZEB1 e ZEB2. Após, nós selecionamos duas dessas amostras (CC-20E e CL-28E), que apresentavam morfologia típica de células epiteliais e baixa expressão dos fatores de transcrição citados acima e expressamos de maneira exógena e de forma estável os fatores de transcrição SLUG e ZEB1, através do processo de transdução lentiviral. Entretanto, apenas a transdução com os plasmídeos contendo a região codificante de SLUG foi eficiente. Sendo assim, nós avaliamos os efeitos da expressão exógena de SLUG nas células CC-20E e CL-28E, quanto a alteração de morfologia e expressão de filamentos intermediários como citoqueratina, vimentina e actina. Além disso, nós avaliamos se a expressão exógena de SLUG poderia regular a expressão de outros genes associados a EMT, além de genes supressores de tumores, alvos de SLUG. Por fim, nós avaliamos se a expressão exógena de SLUG poderia induzir ao fenótipo de CITs, verificando se havia alteração na sensibilidade das células aos quimioterápicos doxorrubicina e paclitaxel, além de avaliar o potencial tumorigênico e de auto-renovação dessas células em cultivos de baixa aderência. A expressão exógena de SLUG nas células CC-20E e CL-28E, não induziu a alterações na morfologia epitelial das células. Entretanto, as células alteraram sua disposição em monocamada no cultivo, formando tipos de túbulos semidiferenciados, característicos do processo de EMT híbrido ou parcial. Além, disso, houve um equilíbrio entre a expressão dos filamentos intermediários de citoqueratina e vimentina nas células, além do aumento na expressão dos genes CDH1 (E-caderina) e CDH2 (N-caderina), resultado que sustentou a indução de EMT parcial. O processo de EMT parcial induziu maior resistência ao quimioterápico paclitaxel, além de potencializar a tumorigenecidade e a capacidade de auto-renovação das células em cultivos de baixa aderência. Sendo assim, no presente estudo, nós obtivemos um cultivo com características que mimetizam as CITs, demonstrando que os processos que induzem esse fenótipo são semelhantes tanto na espécie canina, quanto em humanos, sustentando a hipótese de que neoplasias mamárias caninas podem servir como modelo para o estudo das CITs e, consequentemente, do desenvolvimento neoplásico de tumores sólidos. / Mammary neoplasms present a major challenge for both human and veterinary medicine, due to intertumoral and intratumoral heterogeneity, hindering the search for effective treatments. Recently, researchers has highlighted a population of cells with features very similar to stem cells. Known as Tumor-Initiating Cells (TICs), they are described as the main responsible for chemotherapy failures and tumor recurrence, due to their tumorigenic potential, self-renewal ability and drug resistance. The study of TICs is limited mainly by their difficult isolation owing to specific markers absence, and furthermore, cells lose their phenotype when placed in vitro. Therefore, several studies are seeking for alternatives to enrich this population in regular cultures. One way is based on the epithelial-mesenchymal transition induction through of transcription factors overexpression, such as SNAI1, SLUG, ZEB1 e ZEB2. So, the aim of this study was to overexpresse the SLUG and ZEB1 transcription factors in a cell culture derived from canine mammary carcinomas, evaluate its effects and observe whether these transcription factors would be capable of inducing the TIC phenotype. First, four canine mammary carcinomas cell cultures were analyzed for their morphology and gene expression levels of four transcription factors associated with epithelial-mesenchymal transition: SLUG, STAT3, and ZEB1 ZEB2. After, we selected two samples (CC-20E and CL-28E) with typical morphology of epithelial cells and low expression of the transcription factors mentioned above. We then overexpress, stably, the transcription factors SLUG and ZEB1 by lentiviral transduction, However, only SLUG transduction was efficient. Then, we evaluated the effects of SLUG overexpression in CC-20E and CL-28E cells as the change of morphology, expression of intermediate filaments as cytokeratin, vimentin and actin. In addition, we evaluated whether SLUG overexpression could regulate the expression of other EMT-associated genes as well as tumor suppressor genes, and assessed evaluated the tumorigenic potential and self-renewal of these cells in low adherence cultures. Finally, we assessed whether SLUG overexpression could induce drug resistance through doxorubicin and paclitaxel sensivity assay. The SLUG overexpression did not induce modification in epithelial cell morphology, however, cells changed their arrangement in monolayer culture, inducing the semidifferentiated tubules, typical of hybrid or partial EMT process. In, addition, there was a balanced expression between cytokeratin and vimentin, possibly explained by an increase in CDH1 expression (E-cadherin) and CDH2 (N-cadherin) typical of partial EMT. Furthermore, the partial EMT generated cells presenting paclitaxel resistance, and enhanced the tumorigenic potential and self-renewal capacity of the cells on low adherent plates. Thus, in this study, we obtained a cell culture exhibiting features that mimics the TICs, demonstrating the mechanisms which regulate this phenotype are similar in dogs and humans, supporting the hypothesis that canine mammary carcinomas are a great model for the study of TICs and solid tumors development.

A interação entre células tumorais e células estromais tem um papel central na progressão neoplásica. As células estromais mesenquimais multipotentes (MSCs) podem se integrar ao microambiente tumoral onde modulam o crescimento dos tumores por meio de distintos mecanismos. Entretanto, pouco se sabe sobre o papel das MSCs na metástase, a principal causa de morte em pacientes com câncer. Utilizando um modelo de melanoma murino ortotópico, nós demonstramos que MSCs obtidas da medula óssea de camundongos (MO-MSCs) ocupam o nicho perivascular nos tumores primários e aumentam 2,5 vezes a incidência de micrometástases pulmonares quando co-infundidas com células de melanoma B16. Observamos ainda que o meio condicionado das MO-MSCs não altera o potencial de colonização pulmonar das células B16 infundidas sistemicamente. Isto indica que as MO-MSCs modulam as fases iniciais da cascata metastática, durante a qual ocorrem os processos de invasão e intravasão nos vasos sangüíneos. Em correlação com estes efeitos pró-metastáticos, o secretoma das MO-MSCs induziu a transição epitélio-mesenquimal (EMT) nas células de melanoma in vitro. Após cultivo em meio condicionado das MO-MSCs, as células B16 adquiriram uma morfologia evidentemente fibroblástica. Ao mesmo tempo, houve o rearranjo dos filamentos de actina e o aumento da expressão de marcadores mesenquimais como fibronectina, vimentina, FSP1, N-caderina e ZEB2, acompanhado da repressão transcricional de E-caderina. A ativação da EMT pelo secretoma das MO-MSCs resultou na aquisição de propriedades metastáticas nas células de melanoma. Após cultivo em meio condicionado de MO-MSCs, as células B16 tiveram seu potencial de ancoragem à fibronectina reduzido, ao passo que houve o aumento na mobilidade e no potencial de invasão em matrizes tridimensionais. Utilizando inibidores competitivos de ATP contra o receptor tirosina-cinase Met, demonstramos que a aquisição de todas as propriedades metastáticas avaliadas e a ativação da EMT nas células de melanoma é mediada pela ativação da via HGF/Met. Estes dados destacam o papel das MOMSCs no microambiente tumoral como fonte perivascular de moléculas indutoras da EMT, cuja ativação leva a aquisição de traços metastáticos nas células de melanoma. Além disso, a inibição da via HGF/Met pode neutralizar os efeitos das MO-MSCs sobre as células tumorais, contribuindo para a repressão de propriedades fundamentais que sustentam a progressão e a disseminação neoplásica. Estas informações são importantes para o desenvolvimento seguro das MO-MSCs como ferramenta terapêutica e demonstram a importância da sinalização entre MSCs e células tumorais na disseminação metastática. Mais especificamente, estas observações reforçam a inibição da via HGF/Met como uma abordagem promissora para o tratamento da metástase. / The crosstalk between tumor cells and stromal cells can profoundly impact tumor progression. Multipotent mesenchymal stromal cells (MSCs) have been reported to integrate the tumor microenvironment where they are described to modulate tumor growth by distinct mechanisms. However, little is known about the impact of MSCs on metastasis, the main cause of death in patients with cancer. Using an orthotopic mouse melanoma model, we showed that mouse bone marrow-derived MSCs (BMMSCs) occupy the perivascular niche within primary tumors and increased by 2.5-fold the incidence of lung micrometastases after co-infusion with B16 melanoma cells. Also, MO-MSCs conditioned medium did not affect the lung colonization ability of systemically infused B16 cells. This indicates that MO-MSCs induces the initial steps of the metastatic cascade, during which the invasion and intravasion occurs. Correlating with these metastatic effects, the BM-MSCs\' secretome activated the epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) in B16 cells in vitro. After culture in BMMSCs\' conditioned medium, B16 cells acquired an evident fibroblastic morphology. Simultaneously, we observed the rearrangement of actin filaments and the upregulation of mesenchymal markers such as fibronectin, vimentin, FSP1, Ncadherin and ZEB2. In agreement with the loss of epithelial phenotype, BM-MSCs\' secretome also suppressed E-cadherin expression in B16 cells. The activation of EMT by BM-MSCs leaded to the acquisition of metastatic traits in melanoma cells. After culture in BM-MSCs\' conditioned medium, B16 cells displayed reduced anchorage to fibronectin and increased motility and invasiveness in threedimensional matrix plugs. Inhibition of Met receptor with competitive ATP inhibitors demonstrated that the induction of EMT and the resultant acquisition of metastatic traits are driven by activation of HGF/Met signaling pathway. Taken together, these evidences highlight the role of BM-MSCs as a perivascular source of EMT-inductive signals, whose activation leads to acquisition of metastatic traits in melanoma cells. Furthermore, inhibition of HGF/Met signaling pathway can neutralize the effects of BM-MSCs on tumor cells, thereby allowing the repression of fundamental properties which support tumor progression and metastasis. This information is useful to safely develop BM-MSCs as therapeutic tool and demonstrate the relevance of the signaling between MSCs and tumor cells during metastasis. More specifically, it reinforces that inhibition of Met signaling can be a promissory approach for the treatment of metastasis.

Submitted by CAMILA LEONEL DA SILVA null (camilaleonels_1@hotmail.com) on 2016-05-02T19:33:26Z No. of bitstreams: 1 TESE - Camila Leonel da Silva.pdf: 12839463 bytes, checksum: a432431aa8b8009a0183a4c0896c3e34 (MD5) / Approved for entry into archive by Felipe Augusto Arakaki (arakaki@reitoria.unesp.br) on 2016-05-04T19:19:33Z (GMT) No. of bitstreams: 1 silva_cl_dr_sjrp.pdf: 12839463 bytes, checksum: a432431aa8b8009a0183a4c0896c3e34 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-04T19:19:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 silva_cl_dr_sjrp.pdf: 12839463 bytes, checksum: a432431aa8b8009a0183a4c0896c3e34 (MD5) Previous issue date: 2016-04-23 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / A transição epitélio-mesenquimal (EMT) é o processo pelo qual as células cancerosas a partir de tumores primários passam por uma conversão fenotípica para invadir e migrar, gerar metástases em tecidos ou órgãos distantes. Este processo pode ser induzido por fatores de crescimento, tais como Fator de Crescimento Transformante beta (TGF-β) e sua alta expressão tem sido implicada na angiogênese tumoral, na migração e invasão celular em muitos tipos de tumores. A expressão de ROCK-1 está associada com a malignidade dos tumores, enquanto a inibição desta molécula resulta em uma supressão significativa de metástases tumorais. A metformina, um fármaco utilizado no tratamento da diabetes, demonstrou inicialmente inibir a EMT e impedir o fenótipo mesenquimal pela repressão transcricional de pontos chave da regulação da EMT (ZEB1, TWIST1, SNAIL2, TGF-β) em células de câncer de mama. Os objetivos foram avaliar a expressão gênica e proteica de marcadores relacionados a metástase, em um estudo in vitro e in vivo, em linhagens de câncer de mama, após o tratamento com metformina, além do silenciamento gênico do TGF-β1 para inibição da transição epitélio-mesenquimal. Foi realizado a transfecção da linhagem celular metastática de tumor mamário canino CF41 de forma estável após a construção de um pequeno RNA de interferência para desenvolver derivados clonais que expressam níveis reduzidos de TGF-β1 (células TGF-β1sh). Este foi subsequentemente combinado com o tratamento com metformina, para analisar os efeitos sobre a migração de células, assim como a expressão dos marcadores de EMT E-caderina e N-caderina, quantificados através de imunofluorescência e do qRT-PCR. As linhagens mamárias humanas MCF-7 (não-metastática) e MDA-MB-231 (metastática) foram tratadas com metformina e inibidor Y27632, após a indução da EMT por TGF-β1 para examinar os efeitos sobre a migração destas células, bem como a expressão proteica dos marcadores ROCK-1, vimentina, E-caderina, CD44 e CD24 por imunocitoquímica. Em um estudo in vivo, as células não modificadas CF41 ou que expressam TGF-β1 shRNA foram injetadas na região inguinal de camundongos fêmea nude atímicos tratados com metformina. Os camundongos foram eutanasiados após o tratamento e os pulmões foram recolhidos para avaliação do número de metástases. As regiões metastáticas foram subsequentemente avaliadas pela expressão de N-caderina, E-caderina, vimentina e claudina-7 através da imuno-histoquímica. Foi possível avaliar que a taxa de migração e invasão foi menor em células TGF-β1sh, em comparação com as células parentais CF41 e esta inibição foi significativa quando combinado com o tratamento com metformina. As análises in vitro demonstraram que o tratamento com metformina reduziu a expressão de N-caderina e aumentou a expressão de E-caderina nas células CF41 e TGF-β1sh. Os resultados demonstram também que após a indução do TGF-β1 nas linhagens MCF-7 e MDA-MB-231 houve menor expressão das proteínas ROCK-1, vimentina, CD44 e CD24 em ambas as linhagens após tratamento com metformina e Y27632. Nas células MDA-MB-231 a expressão de E-caderina foi maior em todos os grupos de tratamento. O tratamento da linhagems MDA-MB-231 com metformina e Y27632 reduziu significativamente a invasão destas células. O estudo in vivo demonstrou que o tratamento com metformina reduziu o número de metástases pulmonares em animais portadores de tumores induzidos com as células TGF-β1sh. Houve diminuição da expressão de marcadores mesenquimais N-caderina e vimentina, e aumento da expressão de marcadores epiteliais E-caderina e claudina-7 nas metástases pulmonares. Assim, concluimos que este estudo confirma os benefícios do silenciamento do TGF-β1, além do tratamento com metformina e Y27632 como potenciais agentes terapêuticos em tumores de mama, bloqueando o processo de EMT e seu potencial metastático. / Epithelial mesenchymal transition (EMT) is the process by which cancer cells from primary tumors pass through a phenotypic conversion to invade and migrate, generating metastases in organs or tissues distant. This process can be induced by growth factors such as transforming growth factor beta (TGF-β) and its overexpression has been implicated in tumor angiogenesis, cell migration and invasion in many cancers. ROCK-1 expression is associated with the malignant character of tumors, while inhibiting this molecule results in a significant suppression of tumor metastasis. Metformin, a drug use for the treatment of diabetes, was previously shown to inhibit EMT by suppressing expression of key transcription factors in breast cancer cells. The aims were to evaluate the gene expression and protein expression of related markers metastasis, in a study in vitro and in vivo in breast cancer cell lines after treatment with metformin in addition to the gene silencing of TGF-β1 for inhibiting epithelial-mesenquimal transition. These aims were contemplated performing transfected of canine metastatic mammary tumor cell line CF41 with small interfering RNA constructs to develop clonal derivatives expressing reduced levels of TGF-β1 (TGF-β1sh cells). This was subsequently combined with metformin treatment, to look at effects on cell migration, as well as the expression of the EMT markers E-cadherin and N-cadherin, which were quantified by immunofluorescence and qRT-PCR. MCF-7 and MDA-MB-231 cell lines were treated with metformin and Y27632, after induction of EMT by TGF-β1, to examine the effects on cell migration as well as the protein expression of the ROCK-1 markers, vimentin, E-cadherin, CD44 and CD24 by immunocitochemistry. In an in vivo study, unmodified or TGF-β1 shRNA-expressing CF41 cells were injected in the inguinal region of nude athymic female mice that were treated with metformin. Mice were sacrificed after treatment and the lungs were collected to assess the number of metastases. Metastatic nodules were subsequently assessed for, N-cadherin, E-cadherin, vimentin and claudin-7 expression via immunohistochemistry. With the obtained results it was possible to assess the migration and invasion rate was lower in TGF-β1sh cells as compared to parental CF41 cells and this inhibition was significant when combined with metformin treatment. In vitro analyses demonstrated that metformin treatment reduced n-cadherin expression and increased E-cadherin expression in both CF41 and TGF-β1sh cells. After TGF-β1 induction in MDA-MB231 and MCF-7 cell lines, there was a lower protein expression of ROCK-1, vimentin, CD44 and CD24 in both cell lines after treatment with metformin and Y27632. In MDA-MB-231 cells, E-cadherin expression was increased in all treatment groups. Treatment of MDA-MB-231 cell line with metformin and Y27632 significantly reduced the invasion of these cells. In vivo studies demonstrated that metformin treatment reduced the number of lung metastases in animals bearing TGF-β1sh tumors. This paralleled a decreased expression of mesenchymal markers N-cadherin and vimentin, and increased expression of epithelial markers E-cadherin and claudin-7 in lung metastases.This study confirms the benefits of TGF-β1 silencing in addition to metformin and Y27632 as potential therapeutic agents in mammary tumors, by blocking EMT process and metastatic potential. / FAPESP: 2012/09778-1

A interação entre células tumorais e células estromais tem um papel central na progressão neoplásica. As células estromais mesenquimais multipotentes (MSCs) podem se integrar ao microambiente tumoral onde modulam o crescimento dos tumores por meio de distintos mecanismos. Entretanto, pouco se sabe sobre o papel das MSCs na metástase, a principal causa de morte em pacientes com câncer. Utilizando um modelo de melanoma murino ortotópico, nós demonstramos que MSCs obtidas da medula óssea de camundongos (MO-MSCs) ocupam o nicho perivascular nos tumores primários e aumentam 2,5 vezes a incidência de micrometástases pulmonares quando co-infundidas com células de melanoma B16. Observamos ainda que o meio condicionado das MO-MSCs não altera o potencial de colonização pulmonar das células B16 infundidas sistemicamente. Isto indica que as MO-MSCs modulam as fases iniciais da cascata metastática, durante a qual ocorrem os processos de invasão e intravasão nos vasos sangüíneos. Em correlação com estes efeitos pró-metastáticos, o secretoma das MO-MSCs induziu a transição epitélio-mesenquimal (EMT) nas células de melanoma in vitro. Após cultivo em meio condicionado das MO-MSCs, as células B16 adquiriram uma morfologia evidentemente fibroblástica. Ao mesmo tempo, houve o rearranjo dos filamentos de actina e o aumento da expressão de marcadores mesenquimais como fibronectina, vimentina, FSP1, N-caderina e ZEB2, acompanhado da repressão transcricional de E-caderina. A ativação da EMT pelo secretoma das MO-MSCs resultou na aquisição de propriedades metastáticas nas células de melanoma. Após cultivo em meio condicionado de MO-MSCs, as células B16 tiveram seu potencial de ancoragem à fibronectina reduzido, ao passo que houve o aumento na mobilidade e no potencial de invasão em matrizes tridimensionais. Utilizando inibidores competitivos de ATP contra o receptor tirosina-cinase Met, demonstramos que a aquisição de todas as propriedades metastáticas avaliadas e a ativação da EMT nas células de melanoma é mediada pela ativação da via HGF/Met. Estes dados destacam o papel das MOMSCs no microambiente tumoral como fonte perivascular de moléculas indutoras da EMT, cuja ativação leva a aquisição de traços metastáticos nas células de melanoma. Além disso, a inibição da via HGF/Met pode neutralizar os efeitos das MO-MSCs sobre as células tumorais, contribuindo para a repressão de propriedades fundamentais que sustentam a progressão e a disseminação neoplásica. Estas informações são importantes para o desenvolvimento seguro das MO-MSCs como ferramenta terapêutica e demonstram a importância da sinalização entre MSCs e células tumorais na disseminação metastática. Mais especificamente, estas observações reforçam a inibição da via HGF/Met como uma abordagem promissora para o tratamento da metástase. / The crosstalk between tumor cells and stromal cells can profoundly impact tumor progression. Multipotent mesenchymal stromal cells (MSCs) have been reported to integrate the tumor microenvironment where they are described to modulate tumor growth by distinct mechanisms. However, little is known about the impact of MSCs on metastasis, the main cause of death in patients with cancer. Using an orthotopic mouse melanoma model, we showed that mouse bone marrow-derived MSCs (BMMSCs) occupy the perivascular niche within primary tumors and increased by 2.5-fold the incidence of lung micrometastases after co-infusion with B16 melanoma cells. Also, MO-MSCs conditioned medium did not affect the lung colonization ability of systemically infused B16 cells. This indicates that MO-MSCs induces the initial steps of the metastatic cascade, during which the invasion and intravasion occurs. Correlating with these metastatic effects, the BM-MSCs\' secretome activated the epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) in B16 cells in vitro. After culture in BMMSCs\' conditioned medium, B16 cells acquired an evident fibroblastic morphology. Simultaneously, we observed the rearrangement of actin filaments and the upregulation of mesenchymal markers such as fibronectin, vimentin, FSP1, Ncadherin and ZEB2. In agreement with the loss of epithelial phenotype, BM-MSCs\' secretome also suppressed E-cadherin expression in B16 cells. The activation of EMT by BM-MSCs leaded to the acquisition of metastatic traits in melanoma cells. After culture in BM-MSCs\' conditioned medium, B16 cells displayed reduced anchorage to fibronectin and increased motility and invasiveness in threedimensional matrix plugs. Inhibition of Met receptor with competitive ATP inhibitors demonstrated that the induction of EMT and the resultant acquisition of metastatic traits are driven by activation of HGF/Met signaling pathway. Taken together, these evidences highlight the role of BM-MSCs as a perivascular source of EMT-inductive signals, whose activation leads to acquisition of metastatic traits in melanoma cells. Furthermore, inhibition of HGF/Met signaling pathway can neutralize the effects of BM-MSCs on tumor cells, thereby allowing the repression of fundamental properties which support tumor progression and metastasis. This information is useful to safely develop BM-MSCs as therapeutic tool and demonstrate the relevance of the signaling between MSCs and tumor cells during metastasis. More specifically, it reinforces that inhibition of Met signaling can be a promissory approach for the treatment of metastasis.

As neoplasias mamárias apresentam um grande desafio tanto para a medicina humana, quanto para a medicina veterinária. Esses tumores apresentam ampla heterogeneidade intertumoral e intratumoral, dificultando assim a busca por tratamentos eficazes. Recentemente, pesquisadores tem voltado sua atenção para uma população de células que apresentam características muito semelhantes as células-tronco. São as chamadas células iniciadoras de tumores (CITs). Estas são descritas como as principais responsáveis por falhas nas quimioterapias e no surgimento de recidivas tumorais, devido ao seu potencial tumorigênico, de auto-renovação e de resistência a drogas antineoplásicas. Entretanto, o estudo dessas células é limitado pelas dificuldades no isolamento e na caracterização pós-enriquecimento dessas células, devido à perda do fenótipo em modelos in vitro. Sendo assim, vários estudos estão buscando maneiras alternativas de enriquecer essa população. Uma das maneiras mais utilizadas, baseia-se na indução do processo de transição epitélio-mesenquimal, através da superexpressão de fatores de transcrição como SNAI1, SLUG, ZEB1 e ZEB2. Sendo assim, nós objetivamos expressar de maneira exógena os fatores de transcrição SLUG e ZEB1 em células oriundas de carcinomas mamários caninos, caracterizar seus efeitos nessas células e observar se esses fatores de transcrição seriam capazes de induzir o fenótipo de CIT. Primeiramente, quatro amostras de carcinomas mamários caninos foram analisados quanto sua morfologia e os níveis de expressão gênica de quatro fatores de transcrição associados a transição epitélio-mesenquimal: SLUG, STAT3, ZEB1 e ZEB2. Após, nós selecionamos duas dessas amostras (CC-20E e CL-28E), que apresentavam morfologia típica de células epiteliais e baixa expressão dos fatores de transcrição citados acima e expressamos de maneira exógena e de forma estável os fatores de transcrição SLUG e ZEB1, através do processo de transdução lentiviral. Entretanto, apenas a transdução com os plasmídeos contendo a região codificante de SLUG foi eficiente. Sendo assim, nós avaliamos os efeitos da expressão exógena de SLUG nas células CC-20E e CL-28E, quanto a alteração de morfologia e expressão de filamentos intermediários como citoqueratina, vimentina e actina. Além disso, nós avaliamos se a expressão exógena de SLUG poderia regular a expressão de outros genes associados a EMT, além de genes supressores de tumores, alvos de SLUG. Por fim, nós avaliamos se a expressão exógena de SLUG poderia induzir ao fenótipo de CITs, verificando se havia alteração na sensibilidade das células aos quimioterápicos doxorrubicina e paclitaxel, além de avaliar o potencial tumorigênico e de auto-renovação dessas células em cultivos de baixa aderência. A expressão exógena de SLUG nas células CC-20E e CL-28E, não induziu a alterações na morfologia epitelial das células. Entretanto, as células alteraram sua disposição em monocamada no cultivo, formando tipos de túbulos semidiferenciados, característicos do processo de EMT híbrido ou parcial. Além, disso, houve um equilíbrio entre a expressão dos filamentos intermediários de citoqueratina e vimentina nas células, além do aumento na expressão dos genes CDH1 (E-caderina) e CDH2 (N-caderina), resultado que sustentou a indução de EMT parcial. O processo de EMT parcial induziu maior resistência ao quimioterápico paclitaxel, além de potencializar a tumorigenecidade e a capacidade de auto-renovação das células em cultivos de baixa aderência. Sendo assim, no presente estudo, nós obtivemos um cultivo com características que mimetizam as CITs, demonstrando que os processos que induzem esse fenótipo são semelhantes tanto na espécie canina, quanto em humanos, sustentando a hipótese de que neoplasias mamárias caninas podem servir como modelo para o estudo das CITs e, consequentemente, do desenvolvimento neoplásico de tumores sólidos. / Mammary neoplasms present a major challenge for both human and veterinary medicine, due to intertumoral and intratumoral heterogeneity, hindering the search for effective treatments. Recently, researchers has highlighted a population of cells with features very similar to stem cells. Known as Tumor-Initiating Cells (TICs), they are described as the main responsible for chemotherapy failures and tumor recurrence, due to their tumorigenic potential, self-renewal ability and drug resistance. The study of TICs is limited mainly by their difficult isolation owing to specific markers absence, and furthermore, cells lose their phenotype when placed in vitro. Therefore, several studies are seeking for alternatives to enrich this population in regular cultures. One way is based on the epithelial-mesenchymal transition induction through of transcription factors overexpression, such as SNAI1, SLUG, ZEB1 e ZEB2. So, the aim of this study was to overexpresse the SLUG and ZEB1 transcription factors in a cell culture derived from canine mammary carcinomas, evaluate its effects and observe whether these transcription factors would be capable of inducing the TIC phenotype. First, four canine mammary carcinomas cell cultures were analyzed for their morphology and gene expression levels of four transcription factors associated with epithelial-mesenchymal transition: SLUG, STAT3, and ZEB1 ZEB2. After, we selected two samples (CC-20E and CL-28E) with typical morphology of epithelial cells and low expression of the transcription factors mentioned above. We then overexpress, stably, the transcription factors SLUG and ZEB1 by lentiviral transduction, However, only SLUG transduction was efficient. Then, we evaluated the effects of SLUG overexpression in CC-20E and CL-28E cells as the change of morphology, expression of intermediate filaments as cytokeratin, vimentin and actin. In addition, we evaluated whether SLUG overexpression could regulate the expression of other EMT-associated genes as well as tumor suppressor genes, and assessed evaluated the tumorigenic potential and self-renewal of these cells in low adherence cultures. Finally, we assessed whether SLUG overexpression could induce drug resistance through doxorubicin and paclitaxel sensivity assay. The SLUG overexpression did not induce modification in epithelial cell morphology, however, cells changed their arrangement in monolayer culture, inducing the semidifferentiated tubules, typical of hybrid or partial EMT process. In, addition, there was a balanced expression between cytokeratin and vimentin, possibly explained by an increase in CDH1 expression (E-cadherin) and CDH2 (N-cadherin) typical of partial EMT. Furthermore, the partial EMT generated cells presenting paclitaxel resistance, and enhanced the tumorigenic potential and self-renewal capacity of the cells on low adherent plates. Thus, in this study, we obtained a cell culture exhibiting features that mimics the TICs, demonstrating the mechanisms which regulate this phenotype are similar in dogs and humans, supporting the hypothesis that canine mammary carcinomas are a great model for the study of TICs and solid tumors development.

Modificações nas histonas são conhecidas por regular a estrutura conformacional da cromatina e a expressão gênica em células adultas e células-tronco pluripotentes. Tem sido postulado que a acetilação e deacetilação das histonas podem influenciar a expressão de genes envolvidos na iniciação, progressão e metástase tumoral, além de contribuir para o desenvolvimento de resistência à quimioterapia. Assim, buscou-se avaliar a influência das modificações nas histonas sobre a biologia do carcinoma epidermoide de cabeça e pescoço (CECP) e sua respectiva subpopulação de células semelhantes às células-tronco (CSC). Inicialmente, foi checado os níveis de acetilação da histona H3 (membro das histonas nucleares associado à compactação da cromatina) em um painel representativo de linhagens celulares de CECP. Posteriormente, para estudar a influência do estroma tumoral no padrão de acetilação da histona H3, o microambiente do tumor foi mimetizado através da utilização de meio condicionado derivado do cultivo de fibroblastos e cultura primária de células endoteliais humanas. Além disso, validamos esses resultados in vitro por meio de amostras humanas de CECP. Finalmente, a acetilação e deacetilação da cromatina foi induzida, respectivamente, pela administração dos inibidores das enzimas histona deacetilase tricostatina A (TSA) e histona acetiltransferase curcumina, em linhagens celulares de CECP. Foi feita a análise da formação de esferas (ensaio funcional de células-tronco), juntamente com a verificação dos níveis de ALDH, marcador de células-tronco (citometria de fluxo - FACS), além da determinação do índice de proliferação tumoral (Ki-67) e realização dos ensaios de invasão e migração celular. Linhagens celulares de CECP apresentaram níveis baixos de acetilação da histona H3 e demonstraram capacidade de retenção de uma subpopulação de CSC. Apenas o meio condicionado de células endoteliais humanas foi capaz de alterar a conformação da cromatina, uma vez que induziu o aumento da acetilação da histona H3. Interessantemente, foi também notado um concomitante aumento da agressividade de linhagens celulares de CECP (aumento dos níveis de BMI-1 e vimentina). Esses resultados foram confirmados em amostras humanas de CECP que mostraram, apenas no fronte de invasão, células com cromatina acetilada. Curiosamente, essas mesmas células também expressaram vimentina. Os tratamentos com TSA e curcumina resultaram na diminuição significativa da subpopulação de CSC, interrompendo a formação de esferas e reduzindo os níveis de ALDH. Além disso, o tratamento com curcumina mostrou resultados muito interessantes, uma vez que gerou uma redução evidente da invasão celular e impactou por completo o potencial de migração tumoral, sendo nesse sentido mais eficiente que a cisplatina, droga antineoplásica bem estabelecida. Por outro lado, o tratamento com TSA induziu a transição epitélio-mesenquimal nas linhagens celulares de CECP, detectada pelo aumento da expressão de vimentina e indução de um fenótipo fusiforme, juntamente com o aumento da invasão tumoral e os níveis de BMI-1. Portanto, a organização da cromatina está envolvida na modulação da presença de CSC e os altos níveis de acetilação das histonas intensificam o comportamento agressivo de células de CECP. / Histone modifications are known to regulate chromatin conformation structure and gene expression in adult cells and pluripotent stem cells. It has been postulated that histone acetylation and deacetylation could influence the expression of genes involved in cancer initiation, progression, metastasis, and development of resistance to chemotherapies. Here, we sought to evaluate the influence of histone modifications over the biology of head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) and its stem cell-like subpopulation (CSC). Initially, we checked the status of histone H3 acetylation (a member of the core histones associated to chromatin compaction) in a representative set of HNSCC cell lines. Subsequently, to analyze the influence of tumor stroma over the histone H3 acetylation, we mimicked the tumor microenvironment by using conditioned medium from fibroblasts and primary human endothelial cells. Further we validated these in vitro findings through human samples of HNSCC. Finally, we induced chromatin acetylation and deacetylation by the administration of the histone deacetylase inhibitor trichostatin A (TSA) and histone acetyltransferase inhibitor curcumin, respectively, in HNSCC cell lines. The analysis of spheres formation (stem cell functional assay), along with the levels of stem cells marker ALDH (showed by flow cytometry - FACS), tumor proliferation index (Ki-67), invasion and migration cellular potencial were verified. HNSCC cell lines showed lower levels of histone H3 acetylation and ability to retain a subpopulation of CSC. Only conditioned media from human endothelial cells was able to alter the conformation of chromatin, since it induced the increase of histone H3 acetylation. Interestingly, it was also noted a concomitant augment of HNSCC cell lines aggressiveness (enhanced BMI-1 and vimentin levels). These findings were confirmed in human samples of HNSCC that showed, only at the invasive front, cells with acetylated chromatin. Curiously, these same cells also expressed vimentin. TSA and curcumin treatments resulted in significant decrease of the CSC subpopulation by disrupting the spheres and reducing the levels of ALDH. Also, curcumin treatment showed exciting results since it caused an evident reduction of cellular invasion and it impacted the tumoral migration potential, being more efficient than cisplantin, a well-established antineoplastic drug. However, TSA induced epithelial to mesenchymal transition in HNSCC cell lines detected by the upregulation of vimentin and the induction of a fusiform phenotype along with augmented tumor invasion and the levels of BMI-1. Chromatin organization is involved in the modulation of CSC where high levels of histone acetylation intensify the aggressive behavior of HNSCC cells.

Modificações nas histonas são conhecidas por regular a estrutura conformacional da cromatina e a expressão gênica em células adultas e células-tronco pluripotentes. Tem sido postulado que a acetilação e deacetilação das histonas podem influenciar a expressão de genes envolvidos na iniciação, progressão e metástase tumoral, além de contribuir para o desenvolvimento de resistência à quimioterapia. Assim, buscou-se avaliar a influência das modificações nas histonas sobre a biologia do carcinoma epidermoide de cabeça e pescoço (CECP) e sua respectiva subpopulação de células semelhantes às células-tronco (CSC). Inicialmente, foi checado os níveis de acetilação da histona H3 (membro das histonas nucleares associado à compactação da cromatina) em um painel representativo de linhagens celulares de CECP. Posteriormente, para estudar a influência do estroma tumoral no padrão de acetilação da histona H3, o microambiente do tumor foi mimetizado através da utilização de meio condicionado derivado do cultivo de fibroblastos e cultura primária de células endoteliais humanas. Além disso, validamos esses resultados in vitro por meio de amostras humanas de CECP. Finalmente, a acetilação e deacetilação da cromatina foi induzida, respectivamente, pela administração dos inibidores das enzimas histona deacetilase tricostatina A (TSA) e histona acetiltransferase curcumina, em linhagens celulares de CECP. Foi feita a análise da formação de esferas (ensaio funcional de células-tronco), juntamente com a verificação dos níveis de ALDH, marcador de células-tronco (citometria de fluxo - FACS), além da determinação do índice de proliferação tumoral (Ki-67) e realização dos ensaios de invasão e migração celular. Linhagens celulares de CECP apresentaram níveis baixos de acetilação da histona H3 e demonstraram capacidade de retenção de uma subpopulação de CSC. Apenas o meio condicionado de células endoteliais humanas foi capaz de alterar a conformação da cromatina, uma vez que induziu o aumento da acetilação da histona H3. Interessantemente, foi também notado um concomitante aumento da agressividade de linhagens celulares de CECP (aumento dos níveis de BMI-1 e vimentina). Esses resultados foram confirmados em amostras humanas de CECP que mostraram, apenas no fronte de invasão, células com cromatina acetilada. Curiosamente, essas mesmas células também expressaram vimentina. Os tratamentos com TSA e curcumina resultaram na diminuição significativa da subpopulação de CSC, interrompendo a formação de esferas e reduzindo os níveis de ALDH. Além disso, o tratamento com curcumina mostrou resultados muito interessantes, uma vez que gerou uma redução evidente da invasão celular e impactou por completo o potencial de migração tumoral, sendo nesse sentido mais eficiente que a cisplatina, droga antineoplásica bem estabelecida. Por outro lado, o tratamento com TSA induziu a transição epitélio-mesenquimal nas linhagens celulares de CECP, detectada pelo aumento da expressão de vimentina e indução de um fenótipo fusiforme, juntamente com o aumento da invasão tumoral e os níveis de BMI-1. Portanto, a organização da cromatina está envolvida na modulação da presença de CSC e os altos níveis de acetilação das histonas intensificam o comportamento agressivo de células de CECP. / Histone modifications are known to regulate chromatin conformation structure and gene expression in adult cells and pluripotent stem cells. It has been postulated that histone acetylation and deacetylation could influence the expression of genes involved in cancer initiation, progression, metastasis, and development of resistance to chemotherapies. Here, we sought to evaluate the influence of histone modifications over the biology of head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) and its stem cell-like subpopulation (CSC). Initially, we checked the status of histone H3 acetylation (a member of the core histones associated to chromatin compaction) in a representative set of HNSCC cell lines. Subsequently, to analyze the influence of tumor stroma over the histone H3 acetylation, we mimicked the tumor microenvironment by using conditioned medium from fibroblasts and primary human endothelial cells. Further we validated these in vitro findings through human samples of HNSCC. Finally, we induced chromatin acetylation and deacetylation by the administration of the histone deacetylase inhibitor trichostatin A (TSA) and histone acetyltransferase inhibitor curcumin, respectively, in HNSCC cell lines. The analysis of spheres formation (stem cell functional assay), along with the levels of stem cells marker ALDH (showed by flow cytometry - FACS), tumor proliferation index (Ki-67), invasion and migration cellular potencial were verified. HNSCC cell lines showed lower levels of histone H3 acetylation and ability to retain a subpopulation of CSC. Only conditioned media from human endothelial cells was able to alter the conformation of chromatin, since it induced the increase of histone H3 acetylation. Interestingly, it was also noted a concomitant augment of HNSCC cell lines aggressiveness (enhanced BMI-1 and vimentin levels). These findings were confirmed in human samples of HNSCC that showed, only at the invasive front, cells with acetylated chromatin. Curiously, these same cells also expressed vimentin. TSA and curcumin treatments resulted in significant decrease of the CSC subpopulation by disrupting the spheres and reducing the levels of ALDH. Also, curcumin treatment showed exciting results since it caused an evident reduction of cellular invasion and it impacted the tumoral migration potential, being more efficient than cisplantin, a well-established antineoplastic drug. However, TSA induced epithelial to mesenchymal transition in HNSCC cell lines detected by the upregulation of vimentin and the induction of a fusiform phenotype along with augmented tumor invasion and the levels of BMI-1. Chromatin organization is involved in the modulation of CSC where high levels of histone acetylation intensify the aggressive behavior of HNSCC cells.