Šio darbo tikslas – taikant in vivo transkripcijos interferencijos sistemą, ištirti laukinio tipo restrikcijos endonukleazės (REazės) Eco31I (atpažįsta DNR seką 5’-GGTCTC-3’) ir mutantinės REazės Eco31IQ69R/K127I (atpažįsta DNR seką 5’-(G/W)GTCTC-3’) sąveikos su DNR sekomis 5’-GGTCTC-3’, 5’-AGTCTC-3’, 5’-TGTCTC-3’, 5’-CGTCTC-3‘ savybes. In vivo transkripcijos interferencijos sistemą sudaro aadA genas (sąlygoja atsparumą spektinomicinui) ir priešprasmis stiprus konstitutyvinis E. coli promotorius conII, nuo kurio vykstanti transkripcija blokuoja aadA geno ekspresiją. Tokios ląstelės fenotipas yra SpS. Transkripcija nuo promotoriaus conII gali būti reguliuojama, įvedant specifiškai su DNR sąveikaujančių baltymų atpažįstamas DNR sekas – sintetinius operatorius. Sąveikaudamas su atpažįstama DNR seka, baltymas veikia kaip conII promotoriaus represorius. Tai sąlygoja ląstelės fenotipo pasikeitimą į SpR. Darbo metu buvo sukonstruotos keturios transkripcijos inerferencijos sistemos plazmidės, kuriose promotorius conII turi operatorines sekas: 5’-GGTCTC-3’, 5’-AGTCTC-3’, 5’-TGTCTC-3’, 5’-CGTCTC-3‘. REazė, nesant apsaugančios metilazės, turi letalų poveiki ląstelei-šeimininkui, todėl darbe buvo naudoti katalitiškai neaktyvūs fermento mutantai Eco31IH312A ir Eco31IQ69R/K127I+H312A. A priori tikėtasi, kad abu fermentai specifiškai sąveikaus su 5’-GGTCTC-3’ seka, o Eco31IQ69R/K127I+H312A taip pat įtakos transkripciją nuo promotoriaus conII, sąveikaudama su 5’-AGTCTC-3’, 5’-TGTCTC-3’... [toliau žr. visą tekstą] / The aim of this study was the investigation of interaction of wild type restriction endonuclease (REase) Eco31I and mutant REase Eco31IQ69R/K127I with DNA sequences 5’-GGTCTC-3’, 5’-AGTCTC-3’, 5’-TGTCTC-3’ and 5’-CGTCTC-3 by an in vivo transcriptional interfererence assay. The transcriptional interference assay is composed of an aadA gene that determines the resistance to spectinomycin and antisense constitutive E. coli promoter conII. The expression of aadA gene is blocked by the transcription from promoter conII and, therefore, the phenotype is SpS. The promoter conII could be regulated by installing operator sequence. DNA-binding protein binds to this recognition sequence and acts as a repressor of promoter conII. This interaction determines transformation of the phenotype to SpR. Four transcriptional interference system plasmids with operon sequences 5’-GGTCTC-3’, 5’-AGTCTC-3’, 5’-TGTCTC-3’and 5’-CGTCTC-3’ were engineered during this study. Cleavage deficient variants Eco31IH312A and Eco31IQ69R/K127I+H312A were tested, because the presence of REase in the absence of cognate DNA methyltransferase is lethal to the host. We predicted that the both enzymes (Eco31IH312A and Eco31IQ69R/K127I+H312A) would interact with 5’-GGTCTC-3’ sequence. Therefore, the interaction of Eco31IQ69R/K127I+H312A with sequences 5’-AGTCTC-3’ and 5’-TGTCTC-3’ at the lower level was expected. The optimal conditions of transcriptional interference were selected and the both enzymes interacted only with... [to full text]

Bendrąja prasme kolagenolizė - dalinė arba visiška konkretaus kolageno tipo molekulės proteolizė, vykstanti in vivo (fiziologinių ar patologinių procesų metu) ar in vitro. Vandens molekulė, kaip įprasta hidrolizės reakcijoms, būtinas antrasis kolagenolizės proceso substratas. Kolagenolizę katalizuoja kolagenoliziniu specifiškumu pasižyminčios peptidazės. Kolagenai -vieni svarbiausių baltymų tiek atliekamų funkcijų, tiek biotechnologinio panaudojimo atžvilgiais. Jų panaudojimas neįmanomas be kolagenolizės proceso, taigi -kolagenolizinių peptidazių. Tik nedaugeliui peptidazių būdingas kolagenolizinis specifiškumas. Eukariotų ir prokariotų skirtumai kolageno kaip kolagenolizės substrato produkavimo galimybės atžvilgiu, taip pat netapačios šio fibrilinio baltymo biologinės funkcijos šiuose gyvybės domenuose lėmė skirtumus tarp prokariotų ir eukariotų kolagenolizinių peptidazių. Nors prokariotinės kolagenolizinės peptidazės tiriamos vis intensyviau, daugiau dėmesio skiriama patogeninių kamienų (Clostridium, Porphyromonas genčių) produkuojamoms kolagenazėms. Tuo tarpu nepatogeninių prokariotų kolagenazių tyrimai vykdomi rečiau. Ilgainiui tai gali lemti nevisavertį prokariotų kolagenazių biotechnologinio potencialo išnaudojimą bei iš dalies riboti pačio kolageno taikymą, sprendžiant konkrečias problemas. Biotechnologinio panaudojimo poreikiams tenkinti būtina klonuoti kolagenolizinių peptidazių genus, pritaikant efektyvias ekspresijos sistemas. Darbo tikslas: Atlikti termofilinių... [toliau žr. visą tekstą] / Collagens are one of the most important proteins including their functions and biotechnological application. The biotechnological application of collagens wouldn‘t be possible without the process of collagenolysis which is catalysed by collagenolytic peptidases. The aim of this work was to perform transcriptional analysis of U32.002 (Helicobacter-type) collagenolytic peptidase gene and its cloning as well as basic analysis. The analysis of U32.002 peptidase gene transcription was performed after the extraction of total RNA from G. lituanicus DSM 15325T cells that were in two different stages of growth. Reverse transcription assays were performed after total RNA extraction. After the process of reverse transcription samples of cDNA were used for the diagnostic PGR that was carried out by using five different primers. This gene was cloned with and without putative signal/pro sequence in order to produce the preparation of U32.002 peptidase. Full sequence of U32.002 peptidase gene was cloned into pTZ57R/T and then into the expression vector pET28c(+). U32.002 gene without putative signal/pro sequence was cloned into pJET1.2, and then into pET28c(+). SDS-PAGE and MALDI-TOF analyses were performed in order to determine the fact of expression in E. coli BL21 (DE3). Full scale expression optimisation was performed, as well. The influence of calcium and zinc ions to the structural stability of U32.002 peptidase with putative signal/pro sequence was analysed. The collagenolytic... [to full text]

Liver possesses the capacity to restore its tissue mass and attain optimal volume in response to physical, infectious and toxic injury. The extraordinary ability of liver to regenerate is the effect of cross-talk between growth factors, cytokines, matrix components and many other factors. Adult liver normally has a very low level of hepatocyte cell division. However, most hepatocytes will rapidly proliferate in response to liver mass reduction. In this study the differences in gene expression in rat liver at 1, 2, 4 and 6 hours after the partial hepatectomy were analyzed using cDNA microarrays. These time points correspond to quiescent liver and early G1 phase in this system. The experiments showed that 309 genes had significantly altered expression for at least one of the analyzed time-points. Differentially expressed genes were clustered according to their temporal expression profiles. PAINT analysis identified several TF binding sites (~20) enriched in specific individual expression patterns. We have obtained time series data on the activity of nine transcription factors (NF-κB, HNF-1, CREB, C/EBP-α, C/EBP-β, AP-2α, PAX-6, GATA-1, STAT-3) that were implicated in our analysis. An early transient activation of NF-κB, HNF-1 and C/EBP-β was observed. By contrast, C/EBP-α rapidly declined. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) assay was performed to examine the binding of NF-κB to the promoter regions of Sod2, Mt1a and Cebpb. We see increased NF-κB binding to both Sod2 and... [to full text] / Infekcijos, toksinų ar fizinių veiksnių pažeistos kepenys gali gana greitai atstatyti prarastą audinio masę. Mitozė vyksta tik labai nedidelėje suaugusio organizmo kepenų ląstelių dalyje. Tačiau sumažėjus kepenų masei hepatocitai ima sparčiai proliferuoti. Kepenų gebėjimą regeneruoti lemia sudėtinga augimo veiksnių, citokinų ir kitų ląstelės veiklą reguliuojančių junginių sąveika. Šiame darbe buvo tiriami genų raiškos pokyčiai žiurkės kepenų ląstelėse pradiniame kepenų regeneracijos tarpsnyje. Genų raiškai nustatyti buvo panaudotos DNR mikrogardelės. Buvo nustatyti 309 genai, kurių raiška patikimai pakinta per pirmąsias 6 valandas po dalinės hepatektomijos operacijos. Nustatytieji 309 genai buvo suskirstyti į šešias grupes pagal laikinius raiškos pokyčius. PAINT programos pagalba buvo nustatyti 22 transkripcijos veiksniai, galimai lemiantys laikinius genų raiškos pokyčius po dalinės hepatektomijos operacijos. Devynių transkripcijos veiksnių (NF-κB, GATA-1, HNF-1, C/EBP-α ir C/EBP-β, STAT-3, PAX-6, AP-2α ) aktyvumo pokyčiai buvo įvertinti eksperimentiškai. Nustatyta, kad aktyvių NF-κB, HNF-1 ir C/EBP-β kiekis hepatocitų branduoliuose staigiai padidėja po dalinės hepatektomijos operacijos. Priešingai, aktyvios C/EBP-α formos kiekis sumažėja. Chromatino imunoprecipitacijos (ChIP) metodu buvo tiriamas NF-κB jungimasis prie Sod2, Mt1a ir Cebpb promotorių sričių praėjus 1 valandai po hepatektomijos. Regeneruojančių kepenų mėginiuose rasta daugiau NF-κB prisijungusio prie Sod2... [toliau žr. visą tekstą]

Infekcijos, toksinų ar fizinių veiksnių pažeistos kepenys gali gana greitai atstatyti prarastą audinio masę. Mitozė vyksta tik labai nedidelėje suaugusio organizmo kepenų ląstelių dalyje. Tačiau sumažėjus kepenų masei hepatocitai ima sparčiai proliferuoti. Kepenų gebėjimą regeneruoti lemia sudėtinga augimo veiksnių, citokinų ir kitų ląstelės veiklą reguliuojančių junginių sąveika. Šiame darbe buvo tiriami genų raiškos pokyčiai žiurkės kepenų ląstelėse pradiniame kepenų regeneracijos tarpsnyje. Genų raiškai nustatyti buvo panaudotos DNR mikrogardelės. Buvo nustatyti 309 genai, kurių raiška patikimai pakinta per pirmąsias 6 valandas po dalinės hepatektomijos operacijos. Nustatytieji 309 genai buvo suskirstyti į šešias grupes pagal laikinius raiškos pokyčius. PAINT programos pagalba buvo nustatyti 22 transkripcijos veiksniai, galimai lemiantys laikinius genų raiškos pokyčius po dalinės hepatektomijos operacijos. Devynių transkripcijos veiksnių (NF-κB, GATA-1, HNF-1, C/EBP-α ir C/EBP-β, STAT-3, PAX-6, AP-2α ) aktyvumo pokyčiai buvo įvertinti eksperimentiškai. Nustatyta, kad aktyvių NF-κB, HNF-1 ir C/EBP-β kiekis hepatocitų branduoliuose staigiai padidėja po dalinės hepatektomijos operacijos. Priešingai, aktyvios C/EBP-α formos kiekis sumažėja. Chromatino imunoprecipitacijos (ChIP) metodu buvo tiriamas NF-κB jungimasis prie Sod2, Mt1a ir Cebpb promotorių sričių praėjus 1 valandai po hepatektomijos. Regeneruojančių kepenų mėginiuose rasta daugiau NF-κB prisijungusio prie Sod2... [toliau žr. visą tekstą] / Liver possesses the capacity to restore its tissue mass and attain optimal volume in response to physical, infectious and toxic injury. The extraordinary ability of liver to regenerate is the effect of cross-talk between growth factors, cytokines, matrix components and many other factors. Adult liver normally has a very low level of hepatocyte cell division. However, most hepatocytes will rapidly proliferate in response to liver mass reduction. In this study the differences in gene expression in rat liver at 1, 2, 4 and 6 hours after the partial hepatectomy were analyzed using cDNA microarrays. These time points correspond to quiescent liver and early G1 phase in this system. The experiments showed that 309 genes had significantly altered expression for at least one of the analyzed time-points. Differentially expressed genes were clustered according to their temporal expression profiles. PAINT analysis identified several TF binding sites (~20) enriched in specific individual expression patterns. We have obtained time series data on the activity of nine transcription factors (NF-κB, HNF-1, CREB, C/EBP-α, C/EBP-β, AP-2α, PAX-6, GATA-1, STAT-3) that were implicated in our analysis. An early transient activation of NF-κB, HNF-1 and C/EBP-β was observed. By contrast, C/EBP-α rapidly declined. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) assay was performed to examine the binding of NF-κB to the promoter regions of Sod2, Mt1a and Cebpb. We see increased NF-κB binding to both Sod2 and... [to full text]