O câncer primário de fígado (CPF) apresenta mau prognóstico, o que torna importante sua quimioprevenção. Nesse sentido, a tributirina (TB), um pró-fármaco do ácido butírico (AB), presente em laticínios e no mel, mostrou-se um agente quimiopreventivo promissor da hepatocarcinogênese experimental. Os efeitos inibitórios da TB têm sido relacionados à inibição do desenvolvimento de lesões pré-neoplásicas, bem como indução de apoptose e hiperacetilação de histonas. A quimioterapia é uma das abordagens mais comuns para o tratamento de diversos tipos de câncer, inclusive o CPF. Neste caso, o tratamento com sorafenibe (SO) é capaz de prolongar a sobrevida média dos pacientes com a doença em fases avançadas em aproximadamente apenas três meses. Em vista disso, são necessários estudos da associação do sorafenibe com outros compostos que possam aumentar a eficácia do tratamento quimioterápico. Desta forma, a associação de fármacos anti-neoplásicos com compostos bioativos dos alimentos pode consistir em uma estratégia potencial para aumentar a eficácia contra o câncer. No presente estudo, foi avaliada a atividade anticarcinogênica da TB e do SO, isoladamente ou em associação, na etapa de progressão da hepatocarcinogênese. Para tanto, foram realizados implantes singênicos no flanco de ratos Fischer-344 a partir de células da linhagem tumoral GP7TB. Quando as neoplasias atingiram 1 cm3, os animais foram aleatorizados em grupos experimentais: Grupo controle (CO), constituído por 10 ratos Fischer 344 que receberam Maltodextrina (300mg/ 100 g. p. c.), controle isocolarico e solução de etanol à 12,5% e Cremofor à 12,5% em agua estéril; Grupo Tributirina (TB), constituído por 9 ratos Fischer 344 que receberam TB (200mg/ 100 g. p. c.) e solução de etanol à 12,5% e Cremofor à 12,5% em água estéril; Grupo sorafenibe (SO) constituído por 9 ratos Fischer 344 que receberam Maltodextrina (300 mg/ 100 g. p. c.), controle isocalorico e tosilato de sorafenibe (3mg / 100 g. p. c. ) em água estéril; Grupo associação da tributirina com o sorafenibe (AS) constituído por 9 ratos Fischer 344 que receberam TB (20 mg/ 100 g. p. c.) e tosiliato de sorafenibe (3mg/ 100 g. p. c.); tratados por administração intragástrica (i.g) diariamente por 5 semanas consecutivas. As concentrações de AB e SO foram analisadas por cromatografia gasosa associada à espectrometria de massa e as neoplasias foram caracterizadas por imunoistoquímica. Em relação à evolução do tamanho das neoplasias o grupo AS apresentou menor (p=0,009) tamanho das mesmas em relação ao grupo CO. No entanto, estas diferenças não atingiram diferenças significativas (p>0,05) entre os grupos TB e CO, bem como entre os grupos SO e CO. Contudo, quando ajustados os valores do tamanho da neoplasia pela latência, observou-se alterações significativas (p<0,05) nos diversos grupos quando comparados ao grupo CO. O grupo SO aumentou a área necrótica das neoplasias, embora esta diferença não tenha atingido diferença significativa (p>0,05), enquanto que o grupo TB reduziu essa área necrótica em relação ao grupo CO (p=0,005). O grupo TB e AS apresentaram significativamente maiores (p<0,05) concentrações hepáticas e neoplásicas de AB em relação ao grupo CO. O grupo SO e AS apresentaram significativamente maiores (p<0,05) concentrações neoplásicas de SO em relação ao grupo CO. Os grupos SO e AS reduziram a expressão de PTEN, quando comparados ao grupo CO, embora esta diferença não tenha atingido diferença significativa (p>0,05). O grupo TB por sua vez expressou maiores niveis de PTEN, embora esta diferença não tenha atigindo significância estatística (p>0,05). Todos os grupos expressaram maiores niveis de caspase 3 clivada quando comparada ao grupo CO (p>0,05). OS grupos TB e SO reduziram a expressão de pERK &#189; quando comparados ao grupo CO. embora estas diferenças não tenham atingidos diferença estatística (p>0,05). O grupo AS apresentou maior expressão de pERK &#189; quando comparada ao grupo CO, embora esta diferença não tenha atingido diferença significativa (p>0,05). A caracterização das neoplasias do grupo CO foi padronizada por imunoistoquímica, apresentando-se positivas para CK 7, CK8, CK19 e Arginase e negativas para HepPar1 e CK18. Assim, os resultados sugerem que as neoplasias obtidas por implantes com células da linhagem GP7TB apresentam características de CPF oriundo de células tronco neoplásicas. Além disso, os grupos experimentais TB e AS apresentaram atividade anticarcinogênica promissora no modelo de implantes singênicos com células GP7TB, que eventualmente envolvem mecanismos de ação distintos da atividade quimioterápica apresentada pelo SO. / Primary liver cancer (PLC) presents poor prognosis, which makes its chemoprevention important. In this sense, tributyrin (TB), a prodrug of butyric acid (AB), present in dairy products and honey, has been shown to be a promising chemopreventive agent for experimental hepatocarcinogenesis. The inhibitory effects of TB have been related to inhibition of the development of pre-neoplastic lesions, as well as induction of apoptosis and hyperacetylation of histones. Chemotherapy is one of the most common approaches for treating various types of cancer, including PLC. In this case, treatment with sorafenib (SO) is able to prolong the average survival of patients with the disease in advanced stages in approximately three months. In view of this, studies of the association of sorafenib with other compounds that may increase the efficacy of chemotherapeutic treatment are necessary. Thus, the association of anti-neoplastic drugs with bioactive compounds in food may be a potential strategy to increase efficacy against cancer. In the present study, the anticarcinogenic activity of TB and SO was evaluated, alone or in combination, in the progression stage of hepatocarcinogenesis. For this purpose, syngenic implants were performed on the flank of Fischer-344 mice from GP7TB tumor cells. When the neoplasms reached 1 cm3, the animals were randomized into experimental groups: Control group (CO), consisting of 10 Fischer 344 rats receiving Maltodextrin (300mg / 100 g.p.c), isocaloric control and 12.5% ethanol solution, and Cremofor to 12.5% in sterile water; Tributyrin group (TB), consisting of 9 Fischer 344 rats that received TB (200mg / 100 g.p.c.) and 12.5% ethanol solution and Cremofor 12.5% in sterile water; Sorafenib group (SO) consisting of 9 Fischer 344 rats receiving maltodextrin (300 mg / 100 g, w / w), isocaloric control and sorafenib tosylate (3 mg / 100 g, w / w) in sterile water; The association group of tributyrin and sorafenib (AS) consisted of 9 Fischer 344 rats receiving TB (20 mg / 100 g p.o.) and sorafenib tosylate (3 mg / 100 g p.o.); treated intragastric (i.g) daily for 5 consecutive weeks. The concentrations of AB and SO were analyzed by gas chromatography associated with mass spectrometry and the neoplasms were characterized by immunohistochemistry. In relation to the evolution of the size of the neoplasias, the AS group presented smaller (p = 0.009) size of the same ones in relation to the CO group. However, these differences did not reach significant differences (p> 0.05) between the TB and CO groups, as well as between the SO and CO groups. However, when adjusted for size of the neoplasm by latency, significant changes (p <0.05) were observed in the different groups when compared to the CO group. The SO group increased the necrotic area of the neoplasias, although this difference did not reach a significant difference (p> 0.05), while the TB group reduced this necrotic area in relation to the CO group (p = 0.005). The TB and AS groups presented significantly higher (p <0.05) hepatic and neoplastic AB concentrations than the CO group. The SO and AS groups presented significantly higher (p <0.05) neoplastic concentrations of SO in relation to the CO group. The SO and AS groups reduced the PTEN expression when compared to the CO group, although this difference did not reach a significant difference (p> 0.05). The TB group in turn expressed higher levels of PTEN, although this difference did not increase statistical significance (p> 0.05). All groups expressed higher levels of caspase 3 cleaved when compared to the CO group (p> 0.05). The TB and SO groups reduced the expression of pERK &#189; when compared to the CO group. although these differences did not reach statistical difference (p> 0.05). The AS group presented higher pERK &#189; expression when compared to the CO group, although this difference did not reach a significant difference (p> 0.05). Characterization of the neoplasias of the CO group was standardized by immunohistochemistry, presenting positive for CK 7, CK8, CK19 and Arginase and negative for HepPar1 and CK18. Thus, the results suggest that the neoplasias obtained by implants with GP7TB cells present CPF characteristics originating from neoplastic stem cells. In addition, the experimental groups TB and AS presented promising anticarcinogenic activity in the model of syngeneic implants with GP7TB cells, which eventually involve mechanisms of action distinct from the chemotherapy activity presented by SO.

O câncer primário de fígado (CPF) apresenta mau prognóstico, o que torna importante sua quimioprevenção. Nesse sentido, a tributirina (TB), um pró-fármaco do ácido butírico (AB), presente em laticínios e no mel, mostrou-se um agente quimiopreventivo promissor da hepatocarcinogênese experimental. Os efeitos inibitórios da TB têm sido relacionados à inibição do desenvolvimento de lesões pré-neoplásicas, bem como indução de apoptose e hiperacetilação de histonas. A quimioterapia é uma das abordagens mais comuns para o tratamento de diversos tipos de câncer, inclusive o CPF. Neste caso, o tratamento com sorafenibe (SO) é capaz de prolongar a sobrevida média dos pacientes com a doença em fases avançadas em aproximadamente apenas três meses. Em vista disso, são necessários estudos da associação do sorafenibe com outros compostos que possam aumentar a eficácia do tratamento quimioterápico. Desta forma, a associação de fármacos anti-neoplásicos com compostos bioativos dos alimentos pode consistir em uma estratégia potencial para aumentar a eficácia contra o câncer. No presente estudo, foi avaliada a atividade anticarcinogênica da TB e do SO, isoladamente ou em associação, na etapa de progressão da hepatocarcinogênese. Para tanto, foram realizados implantes singênicos no flanco de ratos Fischer-344 a partir de células da linhagem tumoral GP7TB. Quando as neoplasias atingiram 1 cm3, os animais foram aleatorizados em grupos experimentais: Grupo controle (CO), constituído por 10 ratos Fischer 344 que receberam Maltodextrina (300mg/ 100 g. p. c.), controle isocolarico e solução de etanol à 12,5% e Cremofor à 12,5% em agua estéril; Grupo Tributirina (TB), constituído por 9 ratos Fischer 344 que receberam TB (200mg/ 100 g. p. c.) e solução de etanol à 12,5% e Cremofor à 12,5% em água estéril; Grupo sorafenibe (SO) constituído por 9 ratos Fischer 344 que receberam Maltodextrina (300 mg/ 100 g. p. c.), controle isocalorico e tosilato de sorafenibe (3mg / 100 g. p. c. ) em água estéril; Grupo associação da tributirina com o sorafenibe (AS) constituído por 9 ratos Fischer 344 que receberam TB (20 mg/ 100 g. p. c.) e tosiliato de sorafenibe (3mg/ 100 g. p. c.); tratados por administração intragástrica (i.g) diariamente por 5 semanas consecutivas. As concentrações de AB e SO foram analisadas por cromatografia gasosa associada à espectrometria de massa e as neoplasias foram caracterizadas por imunoistoquímica. Em relação à evolução do tamanho das neoplasias o grupo AS apresentou menor (p=0,009) tamanho das mesmas em relação ao grupo CO. No entanto, estas diferenças não atingiram diferenças significativas (p>0,05) entre os grupos TB e CO, bem como entre os grupos SO e CO. Contudo, quando ajustados os valores do tamanho da neoplasia pela latência, observou-se alterações significativas (p<0,05) nos diversos grupos quando comparados ao grupo CO. O grupo SO aumentou a área necrótica das neoplasias, embora esta diferença não tenha atingido diferença significativa (p>0,05), enquanto que o grupo TB reduziu essa área necrótica em relação ao grupo CO (p=0,005). O grupo TB e AS apresentaram significativamente maiores (p<0,05) concentrações hepáticas e neoplásicas de AB em relação ao grupo CO. O grupo SO e AS apresentaram significativamente maiores (p<0,05) concentrações neoplásicas de SO em relação ao grupo CO. Os grupos SO e AS reduziram a expressão de PTEN, quando comparados ao grupo CO, embora esta diferença não tenha atingido diferença significativa (p>0,05). O grupo TB por sua vez expressou maiores niveis de PTEN, embora esta diferença não tenha atigindo significância estatística (p>0,05). Todos os grupos expressaram maiores niveis de caspase 3 clivada quando comparada ao grupo CO (p>0,05). OS grupos TB e SO reduziram a expressão de pERK &#189; quando comparados ao grupo CO. embora estas diferenças não tenham atingidos diferença estatística (p>0,05). O grupo AS apresentou maior expressão de pERK &#189; quando comparada ao grupo CO, embora esta diferença não tenha atingido diferença significativa (p>0,05). A caracterização das neoplasias do grupo CO foi padronizada por imunoistoquímica, apresentando-se positivas para CK 7, CK8, CK19 e Arginase e negativas para HepPar1 e CK18. Assim, os resultados sugerem que as neoplasias obtidas por implantes com células da linhagem GP7TB apresentam características de CPF oriundo de células tronco neoplásicas. Além disso, os grupos experimentais TB e AS apresentaram atividade anticarcinogênica promissora no modelo de implantes singênicos com células GP7TB, que eventualmente envolvem mecanismos de ação distintos da atividade quimioterápica apresentada pelo SO. / Primary liver cancer (PLC) presents poor prognosis, which makes its chemoprevention important. In this sense, tributyrin (TB), a prodrug of butyric acid (AB), present in dairy products and honey, has been shown to be a promising chemopreventive agent for experimental hepatocarcinogenesis. The inhibitory effects of TB have been related to inhibition of the development of pre-neoplastic lesions, as well as induction of apoptosis and hyperacetylation of histones. Chemotherapy is one of the most common approaches for treating various types of cancer, including PLC. In this case, treatment with sorafenib (SO) is able to prolong the average survival of patients with the disease in advanced stages in approximately three months. In view of this, studies of the association of sorafenib with other compounds that may increase the efficacy of chemotherapeutic treatment are necessary. Thus, the association of anti-neoplastic drugs with bioactive compounds in food may be a potential strategy to increase efficacy against cancer. In the present study, the anticarcinogenic activity of TB and SO was evaluated, alone or in combination, in the progression stage of hepatocarcinogenesis. For this purpose, syngenic implants were performed on the flank of Fischer-344 mice from GP7TB tumor cells. When the neoplasms reached 1 cm3, the animals were randomized into experimental groups: Control group (CO), consisting of 10 Fischer 344 rats receiving Maltodextrin (300mg / 100 g.p.c), isocaloric control and 12.5% ethanol solution, and Cremofor to 12.5% in sterile water; Tributyrin group (TB), consisting of 9 Fischer 344 rats that received TB (200mg / 100 g.p.c.) and 12.5% ethanol solution and Cremofor 12.5% in sterile water; Sorafenib group (SO) consisting of 9 Fischer 344 rats receiving maltodextrin (300 mg / 100 g, w / w), isocaloric control and sorafenib tosylate (3 mg / 100 g, w / w) in sterile water; The association group of tributyrin and sorafenib (AS) consisted of 9 Fischer 344 rats receiving TB (20 mg / 100 g p.o.) and sorafenib tosylate (3 mg / 100 g p.o.); treated intragastric (i.g) daily for 5 consecutive weeks. The concentrations of AB and SO were analyzed by gas chromatography associated with mass spectrometry and the neoplasms were characterized by immunohistochemistry. In relation to the evolution of the size of the neoplasias, the AS group presented smaller (p = 0.009) size of the same ones in relation to the CO group. However, these differences did not reach significant differences (p> 0.05) between the TB and CO groups, as well as between the SO and CO groups. However, when adjusted for size of the neoplasm by latency, significant changes (p <0.05) were observed in the different groups when compared to the CO group. The SO group increased the necrotic area of the neoplasias, although this difference did not reach a significant difference (p> 0.05), while the TB group reduced this necrotic area in relation to the CO group (p = 0.005). The TB and AS groups presented significantly higher (p <0.05) hepatic and neoplastic AB concentrations than the CO group. The SO and AS groups presented significantly higher (p <0.05) neoplastic concentrations of SO in relation to the CO group. The SO and AS groups reduced the PTEN expression when compared to the CO group, although this difference did not reach a significant difference (p> 0.05). The TB group in turn expressed higher levels of PTEN, although this difference did not increase statistical significance (p> 0.05). All groups expressed higher levels of caspase 3 cleaved when compared to the CO group (p> 0.05). The TB and SO groups reduced the expression of pERK &#189; when compared to the CO group. although these differences did not reach statistical difference (p> 0.05). The AS group presented higher pERK &#189; expression when compared to the CO group, although this difference did not reach a significant difference (p> 0.05). Characterization of the neoplasias of the CO group was standardized by immunohistochemistry, presenting positive for CK 7, CK8, CK19 and Arginase and negative for HepPar1 and CK18. Thus, the results suggest that the neoplasias obtained by implants with GP7TB cells present CPF characteristics originating from neoplastic stem cells. In addition, the experimental groups TB and AS presented promising anticarcinogenic activity in the model of syngeneic implants with GP7TB cells, which eventually involve mechanisms of action distinct from the chemotherapy activity presented by SO.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro Tecnológico. Programa de Pós-Graduação em Engenharia de Alimentos. / Made available in DSpace on 2012-10-24T01:11:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 258967.pdf: 4112722 bytes, checksum: 509cc2d1951b381dc94fef2f05121681 (MD5)

O carcinoma hepatocelular (HCC) é o sexto mais frequente e a segunda maior causa de mortalidade por câncer no mundo, além de apresentar alta taxa de recidiva. A associação de sorafenibe (SO) com agentes quimiopreventivos representa uma estratégia importante para aumentar a eficácia do tratamento e minimizar a reincidência da doença. Em estudos anteriores demonstrou-se o potencial quimiopreventivo da tributirina (TB), pró-fármaco do ácido butírico (AB), em modelo de hepatocarcinogênese experimental. A atividade da TB tem sido relacionada à inibição do desenvolvimento de lesões préneoplásicas, bem como à indução de apoptose. Assim, o presente estudo teve como objetivo avaliar a ação anticarcinogênica da TB e do SO, isoladamente ou em associação no HCC. Nesse sentido, implantes singênicos foram realizados no flanco de ratos Fischer- 344 a partir de células da linhagem neoplásica JM-1. Os animais foram distribuídos nos seguintes grupos: Grupo controle isocalórico [CO; Maltodextrina (300 mg/100 g p.c.) e solução veículo (solução de etanol a 12.5% e Cremofor a 12.5% em água estéril)]; Grupo TB (200 mg/100 g p.c. e solução veículo); Grupo SO [Maltodextrina (300 mg/100 g p.c. tosilato de SO (3 mg/100 g p.c.) em solução veículo] e Grupo associação [AS; TB (200 mg/100 g p.c) e tosilato de SO (3 mg/100 g p.c.) em solução veículo]. Os implantes de células JM-1 originaram neoplasias com características pouco diferenciadas. Os tratamentos com SO e AS retardaram (p<0,05) o desenvolvimento das neoplasias, além de reduzirem (p<0,05) suas massa e aumentem (p<0,05) a sobrevida em relação ao grupo CO. Não houve diferença na porcentagem de área necrótica das neoplasias entre os tratamentos. Porém, foi observada uma correlação negativa (p<0,05) entre o tamanho da neoplasia e a área necrótica, sendo que quanto menor a área da neoplasia maior a extensão da necrose, independente do tratamento. Foi observado aumento (p<0,05) das concentrações hepáticas de AB nos grupos TB, SO e AS. Já na neoplasia, apenas os grupos TB e SO demonstraram aumento (p<0,05) na concentração de AB. Além disso, os tratamentos com SO e AS aumentaram (p<0,05) a concentração tecidual de SO na neoplasia em relação ao CO. Nesse sentido, foi observado que grupo AS apresentou 5 vezes mais SO na neoplasia quando comparado ao grupo SO. Os tratamentos com TB e SO isoladamente ou em associação reduziram (p<0,05) a expressão de CK19 em relação ao grupo CO. Em relação à avaliação da proliferação celular, os grupos TB, SO e AS apresentaram redução (p<0,05) do índice de proliferação celular quando comparados ao grupo CO. Foi observado por meio da análise imunoistoquímica para pERK, que os animais tratados com SO e AS reduziram (p<0,05) as áreas positivas quando comparadas às dos animais do grupo CO. Além disso, também foi observada por meio de marcação imunoistoquímica uma redução (p<0,05) nas áreas positivas para CK8 nos grupos SO e AS quando comparadas às do grupo CO. Em relação à caspase-3 clivada, foi observado por imunoistoquímica que o tratamento com TB aumentou (p<0,05) o índice de células positivas para caspase-3 clivada quando comparado ao CO. Esse dado foi comprovado pela análise de western blot. Foi observado por meio da análise imunoistoquímica para H3K9, um aumento (p<0,05) da acetilação no grupo TB quando comparado ao grupo CO. Em relação à expressão em nível proteico de pAKT, foi observado por meio da análise imunoistoquímica uma redução (p<0,05) no grupo TB em comparação ao grupo CO. O presente estudo demonstrou que os implantes de células JM-1 no flanco de ratos Fischer-344 originaram neoplasias com características que lembram a organização hepatocítica de um HCC convencional. O tratamento com TB foi capaz de reduzir a proliferação celular e induzir apoptose. Os tratamentos com SO e com a AS foram capazes de retardar o desenvolvimento, aumentar a sobrevida, reduzir a massa das neoplasias, induzirem diferenciação celular e reduzirem a proliferação celular, melhorando o prognóstico da doença. Os tratamentos com SO e AS apresentaram atividade quimioterápica semelhante. No entanto, a coadministração de SO e TB foi capaz de aumentar a biodisponibilidade do SO para a neoplasia. / Hepatocellular carcinoma (HCC) is the sixth most frequent and the second largest cause of cancer mortality in the world, besides presenting a high rate of recurrence. The association of sorafenib (SO) with chemopreventive agents represents an important strategy to increase the efficacy of the treatment and to minimize recurrence of the disease. In previous studies the chemopreventive potential of tributyrin (TB), a butyric acid prodrug (AB), was demonstrated in a model of experimental hepatocarcinogenesis. TB activity has been linked to inhibition of the development of pre-neoplastic lesions as well as to the induction of apoptosis. Thus, the present study aimed to evaluate the anticarcinogenic action of TB and SO, either alone or in combination in HCC. In this sense, syngeneic implants were performed on the flank of Fischer-344 rats from cells of the JM-1 neoplastic lineage. The animals were divided into the following groups: Control group [CO; Maltodextrin (300 mg / 100g p.c.) and carrier solution (12.5% ethanol solution and 12.5% Cremophor in sterile water)]; TB group (200 mg / 100 g p.c. and carrier solution); Group SO [Maltodextrin (300 mg / 100 g pc tosylate of SO (3 mg / 100 g pc) in vehicle solution] and Association group [AS; TB (200 mg / 100 g pc) and SO tosylate (3 mg / 100 (p <0.05), the development of the neoplasms, as well as the reduction (p <0.05), and the survival rate was higher (p <0.05) than the CO group. There was no difference in the percentage of necrotic area of the neoplasms between the treatments. (p <0.05) of the hepatic AB concentrations in the TB, SO and AS groups, although the size of the neoplasia and the necrotic area were higher. In the neoplasia, only the TB and SO groups showed an increase (p <0.05) in AB concentration. In addition, treatments with SO and AS increased (p <0.05) the tissue concentration of SO in the neoplasia in relation to CO. In this sense, it was observed that AS group presented 5 times more SO in the neoplasia when compared to the SO group. Treatments with TB and SO alone or in combination reduced (p <0.05) the expression of CK19 in relation to the CO group. In relation to the evaluation of cell proliferation, the TB, SO and AS groups presented a reduction (p <0.05) in the cell proliferation index when compared to the CO group. It was observed by the immunohistochemical analysis for pERK that the animals treated with SO and AS reduced (p <0.05) the positive areas when compared to the animals of the CO group. In addition, a reduction (p <0.05) in the CK8 positive areas in the SO and AS groups when compared to the CO groups was also observed by immunohistochemical labeling. In relation to the cleaved caspase-3, it was observed by immunohistochemistry that the TB treatment increased (p <0.05) the index of caspase-3 positive cells cleaved when compared to CO. This was confirmed by western blot analysis. It was observed by immunohistochemical analysis for H3K9, an increase (p <0.05) in the acetylation of the TB group when compared to the CO group. Regarding the protein level expression of pAKT, a reduction (p <0.05) in the TB group was observed through the immunohistochemical analysis when compared to the CO group. The present study demonstrated that JM-1 cell implants in the flank of Fischer-344 mice originated neoplasms with features reminiscent of the hepatocyte organization of a conventional HCC. TB treatment was able to reduce cell proliferation and induce apoptosis. SO and AS treatments were able to delay the development, increase survival, reduce the mass of neoplasms, induce cell differentiation and reduce cell proliferation, improving the prognosis of the disease. SO and AS treatments showed similar chemotherapy activity. However, co-administration of SO and TB was able to increase the bioavailability of SO to the neolasia.

O carcinoma hepatocelular (HCC) é o sexto mais frequente e a segunda maior causa de mortalidade por câncer no mundo, além de apresentar alta taxa de recidiva. A associação de sorafenibe (SO) com agentes quimiopreventivos representa uma estratégia importante para aumentar a eficácia do tratamento e minimizar a reincidência da doença. Em estudos anteriores demonstrou-se o potencial quimiopreventivo da tributirina (TB), pró-fármaco do ácido butírico (AB), em modelo de hepatocarcinogênese experimental. A atividade da TB tem sido relacionada à inibição do desenvolvimento de lesões préneoplásicas, bem como à indução de apoptose. Assim, o presente estudo teve como objetivo avaliar a ação anticarcinogênica da TB e do SO, isoladamente ou em associação no HCC. Nesse sentido, implantes singênicos foram realizados no flanco de ratos Fischer- 344 a partir de células da linhagem neoplásica JM-1. Os animais foram distribuídos nos seguintes grupos: Grupo controle isocalórico [CO; Maltodextrina (300 mg/100 g p.c.) e solução veículo (solução de etanol a 12.5% e Cremofor a 12.5% em água estéril)]; Grupo TB (200 mg/100 g p.c. e solução veículo); Grupo SO [Maltodextrina (300 mg/100 g p.c. tosilato de SO (3 mg/100 g p.c.) em solução veículo] e Grupo associação [AS; TB (200 mg/100 g p.c) e tosilato de SO (3 mg/100 g p.c.) em solução veículo]. Os implantes de células JM-1 originaram neoplasias com características pouco diferenciadas. Os tratamentos com SO e AS retardaram (p<0,05) o desenvolvimento das neoplasias, além de reduzirem (p<0,05) suas massa e aumentem (p<0,05) a sobrevida em relação ao grupo CO. Não houve diferença na porcentagem de área necrótica das neoplasias entre os tratamentos. Porém, foi observada uma correlação negativa (p<0,05) entre o tamanho da neoplasia e a área necrótica, sendo que quanto menor a área da neoplasia maior a extensão da necrose, independente do tratamento. Foi observado aumento (p<0,05) das concentrações hepáticas de AB nos grupos TB, SO e AS. Já na neoplasia, apenas os grupos TB e SO demonstraram aumento (p<0,05) na concentração de AB. Além disso, os tratamentos com SO e AS aumentaram (p<0,05) a concentração tecidual de SO na neoplasia em relação ao CO. Nesse sentido, foi observado que grupo AS apresentou 5 vezes mais SO na neoplasia quando comparado ao grupo SO. Os tratamentos com TB e SO isoladamente ou em associação reduziram (p<0,05) a expressão de CK19 em relação ao grupo CO. Em relação à avaliação da proliferação celular, os grupos TB, SO e AS apresentaram redução (p<0,05) do índice de proliferação celular quando comparados ao grupo CO. Foi observado por meio da análise imunoistoquímica para pERK, que os animais tratados com SO e AS reduziram (p<0,05) as áreas positivas quando comparadas às dos animais do grupo CO. Além disso, também foi observada por meio de marcação imunoistoquímica uma redução (p<0,05) nas áreas positivas para CK8 nos grupos SO e AS quando comparadas às do grupo CO. Em relação à caspase-3 clivada, foi observado por imunoistoquímica que o tratamento com TB aumentou (p<0,05) o índice de células positivas para caspase-3 clivada quando comparado ao CO. Esse dado foi comprovado pela análise de western blot. Foi observado por meio da análise imunoistoquímica para H3K9, um aumento (p<0,05) da acetilação no grupo TB quando comparado ao grupo CO. Em relação à expressão em nível proteico de pAKT, foi observado por meio da análise imunoistoquímica uma redução (p<0,05) no grupo TB em comparação ao grupo CO. O presente estudo demonstrou que os implantes de células JM-1 no flanco de ratos Fischer-344 originaram neoplasias com características que lembram a organização hepatocítica de um HCC convencional. O tratamento com TB foi capaz de reduzir a proliferação celular e induzir apoptose. Os tratamentos com SO e com a AS foram capazes de retardar o desenvolvimento, aumentar a sobrevida, reduzir a massa das neoplasias, induzirem diferenciação celular e reduzirem a proliferação celular, melhorando o prognóstico da doença. Os tratamentos com SO e AS apresentaram atividade quimioterápica semelhante. No entanto, a coadministração de SO e TB foi capaz de aumentar a biodisponibilidade do SO para a neoplasia. / Hepatocellular carcinoma (HCC) is the sixth most frequent and the second largest cause of cancer mortality in the world, besides presenting a high rate of recurrence. The association of sorafenib (SO) with chemopreventive agents represents an important strategy to increase the efficacy of the treatment and to minimize recurrence of the disease. In previous studies the chemopreventive potential of tributyrin (TB), a butyric acid prodrug (AB), was demonstrated in a model of experimental hepatocarcinogenesis. TB activity has been linked to inhibition of the development of pre-neoplastic lesions as well as to the induction of apoptosis. Thus, the present study aimed to evaluate the anticarcinogenic action of TB and SO, either alone or in combination in HCC. In this sense, syngeneic implants were performed on the flank of Fischer-344 rats from cells of the JM-1 neoplastic lineage. The animals were divided into the following groups: Control group [CO; Maltodextrin (300 mg / 100g p.c.) and carrier solution (12.5% ethanol solution and 12.5% Cremophor in sterile water)]; TB group (200 mg / 100 g p.c. and carrier solution); Group SO [Maltodextrin (300 mg / 100 g pc tosylate of SO (3 mg / 100 g pc) in vehicle solution] and Association group [AS; TB (200 mg / 100 g pc) and SO tosylate (3 mg / 100 (p <0.05), the development of the neoplasms, as well as the reduction (p <0.05), and the survival rate was higher (p <0.05) than the CO group. There was no difference in the percentage of necrotic area of the neoplasms between the treatments. (p <0.05) of the hepatic AB concentrations in the TB, SO and AS groups, although the size of the neoplasia and the necrotic area were higher. In the neoplasia, only the TB and SO groups showed an increase (p <0.05) in AB concentration. In addition, treatments with SO and AS increased (p <0.05) the tissue concentration of SO in the neoplasia in relation to CO. In this sense, it was observed that AS group presented 5 times more SO in the neoplasia when compared to the SO group. Treatments with TB and SO alone or in combination reduced (p <0.05) the expression of CK19 in relation to the CO group. In relation to the evaluation of cell proliferation, the TB, SO and AS groups presented a reduction (p <0.05) in the cell proliferation index when compared to the CO group. It was observed by the immunohistochemical analysis for pERK that the animals treated with SO and AS reduced (p <0.05) the positive areas when compared to the animals of the CO group. In addition, a reduction (p <0.05) in the CK8 positive areas in the SO and AS groups when compared to the CO groups was also observed by immunohistochemical labeling. In relation to the cleaved caspase-3, it was observed by immunohistochemistry that the TB treatment increased (p <0.05) the index of caspase-3 positive cells cleaved when compared to CO. This was confirmed by western blot analysis. It was observed by immunohistochemical analysis for H3K9, an increase (p <0.05) in the acetylation of the TB group when compared to the CO group. Regarding the protein level expression of pAKT, a reduction (p <0.05) in the TB group was observed through the immunohistochemical analysis when compared to the CO group. The present study demonstrated that JM-1 cell implants in the flank of Fischer-344 mice originated neoplasms with features reminiscent of the hepatocyte organization of a conventional HCC. TB treatment was able to reduce cell proliferation and induce apoptosis. SO and AS treatments were able to delay the development, increase survival, reduce the mass of neoplasms, induce cell differentiation and reduce cell proliferation, improving the prognosis of the disease. SO and AS treatments showed similar chemotherapy activity. However, co-administration of SO and TB was able to increase the bioavailability of SO to the neolasia.

O carcinoma hepatocelular (HCC) é a 3&#170; causa de morte por neoplasias no mundo, sendo também o 5º tipo de neoplasia mais frequente. Seu tratamento limitado juntamente com o mau prognóstico tornam importante a adoção de medidas preventivas. A prevenção das etapas iniciais da hepatocarcinogênese pela administração de compostos bioativos de alimentos (CBAs) atualmente vem sendo observada em diversos estudos. Sugere-se que o processo de carcinogênese envolva alterações genéticas e epigenéticas, como a hipometilação do DNA e a desacetilação de histonas. Nesse sentido, o tratamento com ácido fólico (AF), precursor indireto de grupamento metil, e tributirina (TB), inibidora de enzimas desacetilases de histonas, quando em associação, poderia agir em adição potencializando os efeitos quimiopreventivos dos mesmos comparados às suas ações isoladas. A eventual atividade quimiopreventiva da TB (100mg/100g de peso corpóreo), do AF (0,08mg/100g de peso corpóreo), ambos com a metade da dose utilizada na literatura, e da associação entre os mesmos (AS) foi analisada durante a etapa de promoção da hepatocarcinogênese em ratos Wistar submetidos ao modelo do hepatócito resistente (HR). Para avaliação de GST-P, da proliferação celular, da apoptose, bem como a localização da histona H3K9 foi utilizada a técnica de imunohistoquímica; para a quantificação de H3K9, western blot. Em relação à análise macroscópica, os grupos tratados apresentaram menor número de nódulos em relação a MD (sem significância estatística), além de menor porcentagem de LPN menores do que 1mm nos grupos TB e AS. Na análise microscópica foi observado que os grupos TB, AF e AS apresentaram menor número de lesões pré neoplásicas persistentes (pLPN) em relação ao grupo controle isocalórico (MD, maltodextrina), assim como menor porcentagem de área ocupada por pLPN e por lesões em remodelação (rLPN). Quanto a proliferação celular, os grupos AF e AS apresentaram menor número de núcleos em fase S/mm2 quando comparados aos grupos MD e TB. Em relação à apoptose, os grupos TB e AS apresentaram maior número de hepatócitos em apoptose e corpúsculos apoptóticos/mm2 quando comparados aos grupos MD e AF. No resultado da metilação global do DNA não houve diferença entre os grupos. Em adição, os grupos AF e AS apresentaram maiores concentrações séricas de folato; o mesmo não ocorrendo para B12. No que diz respeito à acetilação de H3K9, os grupos TB e AS apresentaram maior porcentagem de acetilação quando comparados aos grupos N, MD e AF. Em conclusão, os grupos tratados com TB, AF e a associação entre eles apresentaram quimioprevenção pronunciada, sendo que o grupo AS apresentou mecanismos aditivos dos tratamentos isolados. / The hepatocellular carcinoma (HCC) is the third leading cause of death by cancer in the world, and the fifth most frequent type of neoplasm. Its limited treatment along with poor prognosis make it important to adopt preventive measures. The prevention of the initial stages of hepatocarcinogenesis by the administration of bioactive food compounds (BFCs) is currently being observed in several studies. It is suggested that the process of carcinogenesis involves genetic and epigenetic modifications, such as DNA hypomethylation and deacetylation of histones. Accordingly, treatment with folic acid (FA), indirect precursor of methyl grouping, and tributyrin (TB), a histone deacetylases inhibiting enzyme, when associated could act in addition to enhance the chemopreventive effects compared to their isolated actions. The possible chemopreventive activity of TB (100mg/100g body weight), FA (0.08 mg/100 g body weight) and the association between them (AS) were studied during the promotion stage of hepatocarcinogenesis in Wistar rats submitted to resistant hepatocyte model (RH).For evaluation of GST-P, cell proliferation, apoptosis, and the location of histone H3K9 was used immunohistochemistry, to quantify H3K9, western blot. Regarding the macroscopic analysis, the treated groups showed a lower number of nodules compared to MD (not statistically significant), and a lower percentage smaller than 1mm in groups TB and AS. Under microscopic examination the groups TB, FA and AS showed a lower number of persistent pre-neoplastic lesions (pLPN) compared to the isocaloric control group (MD, maltodextrin), as well as a lower percentage of the area occupied by pLPN and remodeling lesions (rLPN). As cell proliferation, FA and AS groups had fewer S phase nuclei/mm2 compared to MD and TB groups. Regarding apoptosis, TB and AS groups showed higher numbers of hepatocytes in apoptosis and apoptotic corpuscles/mm2 compared to MD and FA groups. Global DNA methylation did not differ between groups. In addition, AF and AS groups had higher serum concentrations of folate, which did not occur for B12.Concerning the H3K9 acetylation, the groups TB and AS showed higher percentage of acetylation when compared with the groups N, MD and FA. In conclusion, the groups treated with TB, FA and the association of both showed pronounced chemoprevention, and the AS group showed additive mechanisms compared with isolated treatments.

A construção de bibliotecas metagenômicas tornou possível o acesso ao potencial biotecnológico de micro-organismos não cultiváveis. O solo é um habitat pouco explorado, com elevada diversidade bacteriana que possuem genes codificadores de enzimas de interesse industrial, chamadas de biocatalisadores naturais. Dentre estas, destacam-se as enzimas lipolíticas, lipases e esterases, por promoverem a hidrólise de matérias-primas de alto valor agregado e com muitas aplicações biotecnológica. Devido a necessidade, existe uma constante busca para isolar novos genes com diferentes especificações. Neste trabalho, o gene lip4, isolado de biblioteca metagenômica de solo, foi superexpresso, purificado e identificado como membro da família V das lipases bacterianas. Tem atividade ótima hidrolisando triacilglicerol de cadeia média em pH alcalino sem presença de íons. A estrutura cristalográfica obtida identificou o dobramento conservado das &alpha;/&beta; hidrolases e a tríade catalítica, Ser94-Asp217-His245, além da presença do domínio CAP, comum nas esterases. / Metagenomic libraries construction make possible the access to the biotechnological potential of not cultivated microorganisms. Soil environment has a big bacterial diversity with genes encoding industrial interest enzymes, named natural biocatalysts. Among these, lipolytic enzymes, that includes lipases and estarases, are able to catalyse different biochemistry reaction and promoting raw material hydrolysis with added values. In this overview, a search for new genes with different specifications, allowed isolation by functional screening in tributyrin agar, a gene lip4 from a soil metagenomic library. These gene was overexpressed, purified and identified as a member to family V of bacterial lipases. Presents better activity in alkaline pH with medium chain triacyglycerol without ions. Three dimensional structure of Lip4 identified a conserved &alpha;/&beta; hydrolase backbone and the catalytic triad Ser94-Asp217-His245, besides the presence of CAP domain, common structure in esterase.

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:22:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PABLINE RAFAELLA MELLO BUENO.pdf: 1762715 bytes, checksum: 47172765b0a4f2dd240878d5f1652bde (MD5) Previous issue date: 2012-03-12 / The present work was to isolate, select and cultivate microorganisms that produce lipases to apply the wastewater treatment industry of potato chips. For the isolation of microorganisms was used for industrial effluent and sewage treatment plant. The selection of the strain producing lipase was performed on solid medium containing tributyrin and in liquid medium, with p-nitrofenolpalmitato. Optimization of lipase production was performed as variables, the concentration of corn steep liquor, soybean oil and different mineral sources. The enzyme extract and the commercial enzyme selected strain were characterized on the optimal activity and stability at different temperatures and pH values and determined the molecular weight of the commercial enzyme. For the treatment of sewage, it has been characterized and has been the optimization of hydrolysis of triglycerides of the effluent having as variables, pH, enzyme concentration, emulsifier and the influence of fed batch and batch processes. Twenty-nine were isolated microorganisms were acquired and eleven research institutes. Of these, four microorganisms were pre-selected for their higher enzymatic activity. In the selection in submerged fermentation, enzymatic activity was the best strain of Burkholderia cepacia ATCC 25416. Optimization of lipase production was obtained with corn steep liquor (13.8 to 26.2 g.L-1) and sodium nitrate (1.5 to 3.9 g.L-1). In the characterization of the lipase enzyme extract and immobilized lipase from Burkholderia cepacia, the best results were found at 37ºC and pH 8.0. Were stable at 40°C, and thermosensitive at 50 and 60°C. The inactivation of lipases template denaturation followed first order. The molecular mass of commercial enzyme was 33 kDa. For the treatment of effluent, the maximum hydrolytic activity (0.310 U.mL-1) was observed when the volume of 7% gum arabic was set at 3 mL of pH between 7.47 to 7.92 and the concentration of enzyme 0.111 to 0.148 g.mL-1. The mathematical model obtained can be used for batch process and the predictive largest possible hydrolysis of the triglycerides present in the effluent. / O presente trabalho teve como objetivo isolar, selecionar e cultivar microrganismos produtores de lipases para aplicar no tratamento de efluente de indústria de batata frita. Para o isolamento de microrganismos foi utilizado efluente industrial e de Estação de Tratamento de Esgotos. A seleção da cepa produtora de lipase foi realizada em meio sólido, contendo tributirina e em meio líquido, com paranitrofenolpalmitato. A otimização da produção de lipase foi realizada tendo como variáveis, a concentração de água de maceração de milho, óleo de soja e diferentes fontes minerais. O extrato enzimático e a enzima comercial da cepa selecionada foram caracterizados acerca da atividade ótima e estabilidade em diferentes temperaturas e pHs e determinada a massa molecular da enzima comercial. Para o tratamento do efluente, o mesmo foi caracterizado e realizou-se otimização da hidrólise dos triacilglicerídeos do efluente, tendo como variáveis, o pH, concentração de enzima, agente emulsificante e a influência dos processos descontínuo e descontínuo alimentado. Foram isolados vinte e nove microrganismos e onze foram adquiridos de institutos de pesquisa. Destes, quatro microrganismos foram préselecionados por apresentarem maior atividade enzimática. Na seleção em fermentação submersa, a melhor atividade enzimática foi da cepa Burkholderia cepacia ATCC 25416. A otimização da produção de lipase foi obtida utilizando-se água de maceração de milho (13,8 a 26,2 g.L-1) e nitrato de sódio (1,5 a 3,9 g.L-1). Na caracterização das lipases do extrato enzimático e da lipase comercial de Burkholderia cepacia, os melhores resultados foram encontrados a 37°C e pH 8,0. Foram estáveis a 40ºC, e termossensíveis a 50 e 60ºC. A inativação das lipases seguiu modelo de desnaturação de primeira ordem. A massa molecular da enzima comercial foi de 33 kDa. Para o tratamento do efluente, a atividade hidrolítica máxima (0,310 U.mL-1) foi observada quando o volume de goma arábica a 7% foi fixado em 3 mL, entre o pH de 7,47 a 7,92 e concentração de enzima de 0,111 a 0,148 g.mL-1. O modelo matemático obtido pode ser utilizado para fins preditivos e o processo descontínuo possibilitou maior hidrólise dos triacilglicerídeos presentes no efluente.

A construção de bibliotecas metagenômicas tornou possível o acesso ao potencial biotecnológico de micro-organismos não cultiváveis. O solo é um habitat pouco explorado, com elevada diversidade bacteriana que possuem genes codificadores de enzimas de interesse industrial, chamadas de biocatalisadores naturais. Dentre estas, destacam-se as enzimas lipolíticas, lipases e esterases, por promoverem a hidrólise de matérias-primas de alto valor agregado e com muitas aplicações biotecnológica. Devido a necessidade, existe uma constante busca para isolar novos genes com diferentes especificações. Neste trabalho, o gene lip4, isolado de biblioteca metagenômica de solo, foi superexpresso, purificado e identificado como membro da família V das lipases bacterianas. Tem atividade ótima hidrolisando triacilglicerol de cadeia média em pH alcalino sem presença de íons. A estrutura cristalográfica obtida identificou o dobramento conservado das &alpha;/&beta; hidrolases e a tríade catalítica, Ser94-Asp217-His245, além da presença do domínio CAP, comum nas esterases. / Metagenomic libraries construction make possible the access to the biotechnological potential of not cultivated microorganisms. Soil environment has a big bacterial diversity with genes encoding industrial interest enzymes, named natural biocatalysts. Among these, lipolytic enzymes, that includes lipases and estarases, are able to catalyse different biochemistry reaction and promoting raw material hydrolysis with added values. In this overview, a search for new genes with different specifications, allowed isolation by functional screening in tributyrin agar, a gene lip4 from a soil metagenomic library. These gene was overexpressed, purified and identified as a member to family V of bacterial lipases. Presents better activity in alkaline pH with medium chain triacyglycerol without ions. Three dimensional structure of Lip4 identified a conserved &alpha;/&beta; hydrolase backbone and the catalytic triad Ser94-Asp217-His245, besides the presence of CAP domain, common structure in esterase.

O carcinoma hepatocelular (HCC) é a 3&#170; causa de morte por neoplasias no mundo, sendo também o 5º tipo de neoplasia mais frequente. Seu tratamento limitado juntamente com o mau prognóstico tornam importante a adoção de medidas preventivas. A prevenção das etapas iniciais da hepatocarcinogênese pela administração de compostos bioativos de alimentos (CBAs) atualmente vem sendo observada em diversos estudos. Sugere-se que o processo de carcinogênese envolva alterações genéticas e epigenéticas, como a hipometilação do DNA e a desacetilação de histonas. Nesse sentido, o tratamento com ácido fólico (AF), precursor indireto de grupamento metil, e tributirina (TB), inibidora de enzimas desacetilases de histonas, quando em associação, poderia agir em adição potencializando os efeitos quimiopreventivos dos mesmos comparados às suas ações isoladas. A eventual atividade quimiopreventiva da TB (100mg/100g de peso corpóreo), do AF (0,08mg/100g de peso corpóreo), ambos com a metade da dose utilizada na literatura, e da associação entre os mesmos (AS) foi analisada durante a etapa de promoção da hepatocarcinogênese em ratos Wistar submetidos ao modelo do hepatócito resistente (HR). Para avaliação de GST-P, da proliferação celular, da apoptose, bem como a localização da histona H3K9 foi utilizada a técnica de imunohistoquímica; para a quantificação de H3K9, western blot. Em relação à análise macroscópica, os grupos tratados apresentaram menor número de nódulos em relação a MD (sem significância estatística), além de menor porcentagem de LPN menores do que 1mm nos grupos TB e AS. Na análise microscópica foi observado que os grupos TB, AF e AS apresentaram menor número de lesões pré neoplásicas persistentes (pLPN) em relação ao grupo controle isocalórico (MD, maltodextrina), assim como menor porcentagem de área ocupada por pLPN e por lesões em remodelação (rLPN). Quanto a proliferação celular, os grupos AF e AS apresentaram menor número de núcleos em fase S/mm2 quando comparados aos grupos MD e TB. Em relação à apoptose, os grupos TB e AS apresentaram maior número de hepatócitos em apoptose e corpúsculos apoptóticos/mm2 quando comparados aos grupos MD e AF. No resultado da metilação global do DNA não houve diferença entre os grupos. Em adição, os grupos AF e AS apresentaram maiores concentrações séricas de folato; o mesmo não ocorrendo para B12. No que diz respeito à acetilação de H3K9, os grupos TB e AS apresentaram maior porcentagem de acetilação quando comparados aos grupos N, MD e AF. Em conclusão, os grupos tratados com TB, AF e a associação entre eles apresentaram quimioprevenção pronunciada, sendo que o grupo AS apresentou mecanismos aditivos dos tratamentos isolados. / The hepatocellular carcinoma (HCC) is the third leading cause of death by cancer in the world, and the fifth most frequent type of neoplasm. Its limited treatment along with poor prognosis make it important to adopt preventive measures. The prevention of the initial stages of hepatocarcinogenesis by the administration of bioactive food compounds (BFCs) is currently being observed in several studies. It is suggested that the process of carcinogenesis involves genetic and epigenetic modifications, such as DNA hypomethylation and deacetylation of histones. Accordingly, treatment with folic acid (FA), indirect precursor of methyl grouping, and tributyrin (TB), a histone deacetylases inhibiting enzyme, when associated could act in addition to enhance the chemopreventive effects compared to their isolated actions. The possible chemopreventive activity of TB (100mg/100g body weight), FA (0.08 mg/100 g body weight) and the association between them (AS) were studied during the promotion stage of hepatocarcinogenesis in Wistar rats submitted to resistant hepatocyte model (RH).For evaluation of GST-P, cell proliferation, apoptosis, and the location of histone H3K9 was used immunohistochemistry, to quantify H3K9, western blot. Regarding the macroscopic analysis, the treated groups showed a lower number of nodules compared to MD (not statistically significant), and a lower percentage smaller than 1mm in groups TB and AS. Under microscopic examination the groups TB, FA and AS showed a lower number of persistent pre-neoplastic lesions (pLPN) compared to the isocaloric control group (MD, maltodextrin), as well as a lower percentage of the area occupied by pLPN and remodeling lesions (rLPN). As cell proliferation, FA and AS groups had fewer S phase nuclei/mm2 compared to MD and TB groups. Regarding apoptosis, TB and AS groups showed higher numbers of hepatocytes in apoptosis and apoptotic corpuscles/mm2 compared to MD and FA groups. Global DNA methylation did not differ between groups. In addition, AF and AS groups had higher serum concentrations of folate, which did not occur for B12.Concerning the H3K9 acetylation, the groups TB and AS showed higher percentage of acetylation when compared with the groups N, MD and FA. In conclusion, the groups treated with TB, FA and the association of both showed pronounced chemoprevention, and the AS group showed additive mechanisms compared with isolated treatments.