Introduktion: Immunologisk trombocytopeni, ITP är en autoimmun sjukdom. Hos ITP patienter bildas autoantikroppar mot trombocyter som leder till trombocyt eliminering och därmed till trombocytopeni. ITP kan delas in i olika grupper beroende på durationen. Duration i mindre än tre månader kallas för nydiagnostiserad ITP, duration mellan 3 och 12 månader kallas för persistent ITP och duration i mer än 12 månader kallas för kronisk ITP. ITP kan behandlas med olika terapier som anti-CD20-antikroppar som rituximab och trombopoietin-receptor-agonister eltrombopag.  Syfte: Examensarbetes syfte är att undersöka samt jämföra effektivitet mellan rituximab och eltrombopag mot kronisk ITP patienter. Metod: Det här arbetet är baserat på en litteratursökning via databasen PubMed med sökord ”eltrombopag and immune thrombocytopenia” och ” rituximab and immune thrombocytopenia” och därefter valdes 4 Randomized Controlled Trial studier.  Resultat: Studie 1 visade bra effektivitet av rituximab mot kronisk ITP och 28% av patienter kunde nå trombocytantal över 50 x109/L i över 6 månader efter behandlingens slut. Studie 2 visade bra effektivitet av rituximab mot kronisk ITP och 30,8% av patienter kunde nå trombocytantal över 50 x109/L i över 6 månader efter behandlings slut. Studie 3 visade mycket bra effektivitet av eltrombopag mot kroniskt ITP och 60% av patienter kunde nå trombocytantal över 50 x109/L under behandlingstiden. Effekten försvann efter 2 veckor av behandlingens slut.  Studie 4 visade mycket bra effektivitet av eltrombopag mot kroniskt ITP och 59% av patienter kunde nå trombocytantal över 50 x109/L under behandlingstiden. Effekten försvann efter 2 veckor av behandlingens slut.  Slutsats: Både rituximab och eltrombopag visade bra effekt hos ITP patienter, men eltrombopag visade bättre effekt mot kronisk ITP än rituximab. Eltrombopag kunde ge bättre effektivitet samt snabbare svar på ökning av trombocytantalet hos de flesta patienter som behandlades i jämförelse med rituximab. Dock försvann effekten av eltrombopag snabbare efter utsatt behandling. / Introduction: Immunological thrombocytopenia, ITP is an autoimmune disease that can develop in our bodies. Autoantibodies develop in ITP patients against platelets, which are small cells without a nucleus and are formed from the megakaryocytes and play an important role in hemostasis and blood clotting. This leads to platelet elimination and thus to thrombocytopenia. Thrombocytopenia is a condition that means low levels of platelets in the individual and which can lead to various severe symptoms such as bleeding and can even cause death. The cause of ITP may be unknown and then it is called primary ITP. Other reasons can be such as acquired immune deficiency syndrome (AIDS) and then the immune system against platelets is triggered, this is called secondary ITP. ITP can also be divided into different groups depending on the duration in each patient. Duration of less than three months is called newly diagnosed ITP, duration between 3 and 12 months is called persistent ITP and duration of more than 12 months is called chronic ITP. ITP can be treated with various therapies. First line therapy is glucocorticoids, and second line therapy is splenectomy, anti-CD20 antibodies rituximab and thrombopoietin receptor agonists such as eltrombopag. Aim: The purpose of the study is to investigate and compare the efficacy of rituximab and eltrombopag patients with chronic ITP. Method: This work is based on a literature search via the database PubMed with the keywords "eltrombopag and immune thrombocytopenia" and "rituximab and immune thrombocytopenia" and then 4 Randomized Controlled Trial studies were selected, 2 studies deal with rituximab and 2 studies deal with eltrombopag. Results: Study 1 showed good efficacy of rituximab compared to placebo against chronic ITP and 28% of patients were able to reach platelet counts above 50 x109/L for more than 6 months after cessation of treatment. Study 2 showed good efficacy of rituximab in chronic ITP and 30.8% of patients were able to reach platelet counts above 50 x109/L for more than 6 months after treatment. Study 3 showed very good efficacy of eltrombopag against chronic ITP and 60% of patients were able to reach platelet counts above 50 x109/L during the treatment period. The effect disappeared after 2 weeks of treatment discontinuation. Study 4 showed very good efficacy of eltrombopag against chronic ITP and 59% of patients were able to reach platelet counts above 50 x109/L during the treatment period. The effect disappeared after 2 weeks of treatment discontinuation. Conclusion: Both rituximab and eltrombopag showed good efficacy against ITP patients, but eltrombopag showed better efficacy against chronic ITP than rituximab. The NNT number showed that more patients need to be treated with rituximab compared to eltrombopag in order for only one of the patients to be able to achieve a platelet count above 50 x109/L, which means a greater chance for those treated with eltrombopag to achieve a platelet count above 50 x109/L. Eltrombopag was able to provide better efficacy and a faster response to increase in platelet count in most patients treated compared to rituximab.

Humana trombocytantigen (Human Platelet Antigens, HPA) är genetiska polymorfismer som uttrycks på trombocyters membranglykoproteiner. Om icke-kompatibla trombocytantigen införs i blodcirkulationen kan alloimmunisering uppstå där antikroppar produceras mot främmande antigen, det kan därför vara av betydelse att registrera blodgivares antigen. Studiens syfte var att utvärdera prevalensen av HPA1a-negativa blodgivare i Jönköpings- och Östergötlands län med hjälp av flödescytometrisk fenotypning. Studien inkluderade totalt 300 blodgivare, varav 150 från Jönköpings län och 150 från Östergötlands län. Fluorokrommärkta antikroppar riktade mot CD42a och CD61 användes för att detektera HPA1a-negativitet med flödescytometrisk metod. I Jönköpings län detekterades fyra (2,7 %) HPA1a-negativa blodgivare och i Östergötlands län detekterades sex (4,0 %) HPA1a-negativa blodgivare. Statistisk analys visade ingen signifikant skillnad mellan antal HPA1a-negativa blodgivare i de undersökta länen. Länens prevalens av HPA1a-negativitet motsvarade den genomsnittliga prevalensen i Sverige och nya HPA1a-negativa blodgivare har registrerats vilket är en viktig tillgång då patienter är i behov av trombocytkoncentrat. Då studien begränsades av dess ringa storlek samt att kvinnor exkluderats bör vidare studier med större populationer och fler län i Sverige utföras.

HPA1a är ett antigen på trombocytytan som kan orsaka alloimmunisering, såsom neonatal alloimmun trombocytopeni och post-transfusion purpura, vilket kan ge svåra blödningssymptom. I fall med antikroppar mot HPA1a måste kompatibla trombocyter finnas tillgängliga. Syftet med studien var att etablera en flödescytometrisk screeningmetod för fenotypning av HPA1a antigen på trombocyter samt att finna HPA1a negativa blodgivare. Före flödescytometrisk analys poolades två till fem blodprover samman till ett prov och vid förekomst av HPA1a negativa trombocyter i poolen analyserades proverna individuellt. Fluorokrommärkta anti-humana antikroppar mot CD42a och CD61 användes för att särskilja HPA1a negativa trombocyter från HPA1a positiva. Totalt fenotypades 177 blodprover varav sju (4%) typades som HPA1a negativa. Av de sju fynden genotypades fyra vid ett externt laboratorium vilket bekräftade att de var HPA1a negativa. Flödescytometrisk screening av HPA1a är snabb, pålitlig och lämplig för storskalig screening. För att fastställa prevalensen av HPA1a negativa individer behöver mer omfattande studier utföras där en större population ingår. Att ha flera HPA1a negativa blodgivare registrerade ger möjligheten att hjälpa patienter i andra regioner. / HPA1a is an antigen on the platelet surface that can cause alloimmunization, such as neonatal alloimmune thrombocytopenia and post transfusion purpura, which can cause severe bleeding symptoms. In case of antibodies against HPA1a, compatible platelets must be available. The purpose of the study was to establish a flow cytometric screening method for phenotyping HPA1a antigen on platelets and to find HPA1a negative donors. Before the flow cytometric analysis, two to five blood samples were pooled into one sample and in the presence of HPA1a negative platelets in the pool, the samples were analyzed individually. Fluorochrome –labeled anti-human antibodies to CD42a and CD61 were used to distinguish HPA1a negative platelets from HPA1a positive. A total of 177 blood samples were phenotyped, of which 7 (4%) were HPA1a negative. Of the seven findings, four samples were genotyped at an external laboratory confirming that they were HPA1a negative. Flow cytometric screening of HPA1a is fast, reliable and suitable for large scale screening. In order to determine the prevalence of HPA1a negative individuals, more extensive studies need to be performed involving a larger population. By having many registered HPA1a negative donors, it can provide opportunities to help patients in other regions.

Hemolytic disease of fetus or newborn (HDFN) är en komplikation där foster eller nyföddas erytrocyter förstörs för tidigt. HDFN uppstår när det föreligger blodgruppsinkompatibilitet mellan moder och barnet. Komplikationerna/ symptomen kan variera allt från mildare symptom till fosterdöd. HDFN orsakas framförallt av antikropp D (RhD-immunisering) och på grund av detta utförs det typning av fetalt RhD i maternell plasma. Utöver RhD-immuniseringar kan svåra fall av HDFN ibland orsakas av andra blodgruppssystem som c (Rh) och K (Kell). Fetal RhD-typning görs idag som screening på alla RhD-negativa gravida mödrar och utförs i Stockholm och Lund. Metoden som används är baserad på realtids-PCR och har använts sedan 2009. Fetal typning av c och K görs när höga titrar av anti-c respektive anti-K påvisas i mammans plasma. För fetal typning av c och K skickas prover från Huddinge till Lund respektive Amsterdam. Motsvarande immunisering mot erytrocytantigen kan även bildas mot trombocytantigen främst Human Platelet Antigene (HPA-1a) som uttrycks hos fostret och leda till fetal neonatal alloimmun trombocytopeni (FNAIT). En next generation sequencing (NGS) baserad metod för genomisktypning av alla kliniskt relevanta blodgruppssystem finns idag på Karolinska universitetssjukhuset. Denna metod är dock inte anpassad för fetal blodgruppstypning där cell-fritt foster- DNA (cffDNA) analyseras. Syftet med det här projektet var att optimera designade oligonukleotider (oligos) anpassade för fetal blodgruppstypning med NGS-metodik. Design av oligos utfördes innan examensarbetet påbörjades. Dessa inkluderade primer- par som amplifierar upp alla blodgruppssystem som kan orsaka HDFN och FNAIT. Utöver det inkluderade designade oligos markörer som amelogenin-XY (Amel-XY) som är könsspecifika markörer och insertion/deletion markörer (Indel-markörer). Med Amel-XY markörerna kan könsspecifika Y-genen påvisas i provet, vilket kommer att fungera som en kontroll på att foster-DNA har analyserats (fungerar endast vid manligt foster). Designade Indel-markörer består av 2 - 3 bp insertioner/deletioner där olika markörerna används till att skilja DNA från foster och modern i framtiden. De designade oligonukleotiderna undersöktes för om de ger tillräckligt bra amplifiering av sökta sekvenser med NGS genom att analysera två slumpmässigt valda försöksprover (genomisk DNA 2 ng/ μL) från en man och en kvinna. Resultatet visade att tillräckligt bra amplifieringar/signaler erhålls från samtliga markörer som ingår i studien. Den totala signalen för samtliga markörer blev 114234 läsningar (”reads”) vilket gav ett medelvärde på 3939 läsningar. För att mäta amplifieringsförmågan hos varje enskild markör beräknades procent av medelvärdet på 3939 läsningar. En signal på 20 – 180 % av medelvärdet ansågs vara godkänt för varje markör. Alla undersökta primer-markörer uppvisade en signal på minst 45 % av medelvärdet vilket var godkänt (godkänt intervall 20 – 180 %). Efter optimering av oligos som ger tillräckligt bra amplifiering genotypades 32 slumpmässigt valda DNA prover från 21 män och 11 kvinnor med hjälp av NGS. Efter NGS-körning och analys av fastQ-filer med hjälp av mjukvaruprogrammet R erhölls resultat i form av signaler. Signaler för respektive markör över 50 läsningar ansågs vara en positiv signal det vill säga att den sökta genen har påvisats. Signal-värde under 50 innebar att det förekom bakgrundssignal då önskat signal-värde vid avsaknad av sökt gensekvens är 0 (åsatt gränsvärde <1 % av högst uppmätta positiva signalen för varje markör). Samtliga undersökta markörer visade låg bakgrundssignal (<1 % ). Bakgrundssignalen beräknades för att veta vilken tillförlitlig nivå varje markör ska ligga på för att kunna detektera känsligt foster-DNA i framtiden. Resultaten i denna studie visade att de optimerade oligos kan användas till genotypning av cffDNA i framtiden eftersom markörerna uppvisade låga bakgrundssignaler vilket indikerar att metoden är tillräckligt effektiv för att kunna detektera känsligt foster-DNA i framtiden.