Heteromere P2X2/3-Rezeptoren befinden sich neben homomeren P2X3-Rezeptoren an peripheren und zentralen Endigungen von nozizeptiven Spinalganglienneuronen und spielen eine Rolle bei der Entstehung von akuten und chronischen Schmerzen, die im Rahmen von Verletzungen, Entzündungen, Tumorerkrankungen und Neuropathien auftreten. Bislang ging man davon aus, dass P2X2/3-Rezeptoren eine festgelegte Untereinheitenstöchiometrie von (P2X2)1/(P2X3)2 aufweisen. In der vorliegenden Arbeit wird an transient mit der cDNA von hP2X2 und hP2X3 transfizierten HEK293-Zellen untersucht, inwiefern sich heteromere P2X2/3-Rezeptoren in Abhängigkeit vom gewählten Transfektionsverhältnis P2X2/P2X3-1:2 und -4:1 in Bezug auf ihre pharmakologischen Eigenschaften funktionell unterscheiden und somit wahrscheinlich auch in einer alternativen Untereinheitenstöchiometrie von (P2X2)2/(P2X3)1 vorkommen. Die Ergebnisse der durchgeführten Ca2+-Imaging-Experimente legen die Schlussfolgerung nahe, dass bei P2X2/3-Rezeptoren abhängig vom jeweiligen Expressionslevel der beteiligten P2X-Subtypen beide Untereinheitenstöchiometrien 1:2 und 2:1 existieren, dass sie sich aber in ihren funktionellen Eigenschaften nicht wesentlich voneinander unterscheiden. Diese Erkenntnisse tragen zur Vervollständigung des Wissens über P2X2/3-Rezeptoren bei, die ein potenzielles Target für die Entwicklung neuer, analgetisch wirksamer Arzneimittel darstellen.:I Bibliographische Zusammenfassung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 1 Einleitung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 1.1 Das purinerge Signalsystem (engl. purinergic signalling) . . . . . . . . . . . . . . . . 5 1.2 Purinerge Rezeptoren als pharmakologisches Target . . . . . . . . .. . . . . . . . . . 6 1.3 P2X-Rezeptoren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 1.3.1 Aufbau einer P2X-Untereinheit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 1.3.2 3D-Struktur, ATP-Bindung und Kanalöffnung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 1.3.3 Desensitisierung und allosterische Modulation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10 1.3.4 Homo- und Heterotrimere . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11 1.3.5 ATP-Bindungsstellen in Heteromeren und Untereinheitenstöchiometrie . . .12 1.4 Der P2X2/3-Rezeptor und seine Rolle im nozizeptiven System . . . . . .. . . . . 13 1.5 Pharmakologische Eigenschaften von P2X2, P2X3 und P2X2/3 . . . . . . . . . . 15 1.6 Das Ziel meiner Arbeit . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17 2 Material und Methoden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18 2.1 Zellkultur . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18 2.1.1 HEK293-Zellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18 2.1.2 Plasmide . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18 2.1.3 Mutagenese . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19 2.1.4 Transfektion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19 2.2 Ca2+-Imaging . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20 2.2.1 Fura-2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20 2.2.2 Fluoreszenzmikroskopie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21 2.3 Datengewinnung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21 2.3.1 Arbeitsplatz . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21 2.3.2 Ablauf eines Experiments . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22 2.4 Datenauswertung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26 3 Ergebnisse . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27 3.1 Nomenklatur zur Untereinheitenstöchiometrie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27 3.2 Versuchskomplex I: Experimente mit hP2X2- und hP2X3-Mutanten . . . . . . . 27 3.2.1 Konzentrations-Wirkungs-Kurven der Wildtyp-Rezeptorvarianten . . . . . . 28 3.2.2 Inaktivität der verwendeten Mutanten in homomeren Konstellationen . . . . 30 3.2.2.1 P2X2-Mutanten K69A und K307A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30 3.2.2.2 P2X3-Mutanten K63A und K299A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31 3.2.3 Mutationen im NBS1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31 3.2.4 Mutationen im NBS4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32 3.3 Versuchskomplex II: Rezeptormodifikation durch Veränderung des pH-Werts34 3.3.1 Applikation von αβ-meATP . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35 3.3.2 Applikation von 2-MeSATP . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36 3.4 Versuchskomplex III: Einsatz des kompetitiven Antagonisten A-317491 mit αβ-meATP . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37 4 Diskussion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39 4.1 Nullhypothese und Arbeitshypothese . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39 4.2 Transfektionsverhältnis und resultierende Untereinheitenstöchiometrie .. . . 40 4.3 Versuchskomplex I: Experimente mit inaktiven hP2X2- und hP2X3-Mutanten 40 4.4 Versuchskomplex II: Rezeptormodifikation durch Veränderung des pH-Werts43 4.4.1 Vergleich mit den Ergebnissen der Patch-Clamp-Methode . . . . . . . . . . 44 4.4.2 Pathophysiologischer Aspekt von saurem pH in der extrazellulären Matrix 45 4.5 Versuchskomplex III: Einsatz des kompetitiven Antagonisten A-317491 . . . . 45 4.6 Zusammenfassung und Schlussfolgerung . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . 47 5 Ergänzende Daten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49 6 Abkürzungsverzeichnis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52 7 Abbildungsverzeichnis mit Quellenangaben . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54 8 Tabellenverzeichnis mit Quellenangaben . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . 55 9 Zubehör . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56 10 Literaturverzeichnis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58 II Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit . . . . . . . . . . . . . . . . . 66 III Lebenslauf . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67 IV Danksagung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 68

No description available.

Homotrimeric P2X3 and heteromeric P2X2/3 receptors are present in sensory ganglia and participate in pain perception. In order to develop pharmacological antagonists for these receptors, it is important to clarify which amino acid (AA) residues constitute the agonist binding pouch as well as to learn the stoichiometry of the receptor subunits forming a heteromeric receptor. We expressed the homomeric human (h)P2X3 receptor or its mutants in HEK293 cells and measured the ATP-induced responses by the whole-cell patch-clamp method. For the binding-site mutants, all conserved and some non-conserved AAs in the four nucleotide binding segments (NBSs) of the P2X3 subunit were sequentially replaced by alanine. Especially the positively charged AAs Lys and Arg appeared to be of critical importance for the agonist effects. We concluded that groups of AAs organized in NBSs rather than individual amino acids appear to be responsible for agonist binding at the P2X3 receptor. These NBSs are located at the interface of the three subunits forming a functional receptor. We were also interested to find out, whether two heteromeric receptors (P2X2/3 and P2X2/6), where P2X2 combines with two different partners, have an obligatory subunit stoichiometry of 1:2 or whether the subunit stoichiometry may be variable. For this purpose we used non-functional P2X2, P2X3 and P2X6 subunit-mutants to investigate the composition of heteromeric P2X2/3 and P2X2/6 receptors. The subunit stoichiometry of P2X2/3 and P2X2/6 was found to be 1:2 and 2:1, respectively. Thus, recognitions sites between P2X2 and its partners rather than random association may govern the subunit compositions of the receptor trimers.

Homotrimeric P2X3 and heteromeric P2X2/3 receptors are present in sensory ganglia and participate in pain perception. In order to develop pharmacological antagonists for these receptors, it is important to clarify which amino acid (AA) residues constitute the agonist binding pouch as well as to learn the stoichiometry of the receptor subunits forming a heteromeric receptor. We expressed the homomeric human (h)P2X3 receptor or its mutants in HEK293 cells and measured the ATP-induced responses by the whole-cell patch-clamp method. For the binding-site mutants, all conserved and some non-conserved AAs in the four nucleotide binding segments (NBSs) of the P2X3 subunit were sequentially replaced by alanine. Especially the positively charged AAs Lys and Arg appeared to be of critical importance for the agonist effects. We concluded that groups of AAs organized in NBSs rather than individual amino acids appear to be responsible for agonist binding at the P2X3 receptor. These NBSs are located at the interface of the three subunits forming a functional receptor. We were also interested to find out, whether two heteromeric receptors (P2X2/3 and P2X2/6), where P2X2 combines with two different partners, have an obligatory subunit stoichiometry of 1:2 or whether the subunit stoichiometry may be variable. For this purpose we used non-functional P2X2, P2X3 and P2X6 subunit-mutants to investigate the composition of heteromeric P2X2/3 and P2X2/6 receptors. The subunit stoichiometry of P2X2/3 and P2X2/6 was found to be 1:2 and 2:1, respectively. Thus, recognitions sites between P2X2 and its partners rather than random association may govern the subunit compositions of the receptor trimers.:Index of contents Introductory remarks „Wissenschaftlicher Anteil des Promovenden an der Publikation“ „Bibliographische Beschreibung“ I. Introduction Pain as a sensory quality Neuronal circuitry for pain processing and sensation in the PNS and CNS Transformation of thermal, mechanical and chemical stimuli into electrical activity by nociceptors; nociceptor-targeted therapeutic approaches Release mechanisms for nucleotides and their fate in the extracellular space Nucleotide receptor-types ATP-sensitive P2 receptors and pain-sensation References II. Scientific background and aims of my thesis ATP binding-sites of P2X3 receptors; subunit composition of P2X2/3 and P2X2/6 heteromeric receptors The aims of the present work III. Publications IV. Summary and conclusions Amino acid residues constituting the agonist binding site of the human P2X3 receptor ATP binding site mutagenesis reveals different subunit stoichiometry of functional P2X2/3 and P2X2/6 receptors „Eigenständigkeitserklärung“ Curriculum vitae Acknowledgements

Pathophysiologische und therapeutische Bedeutung der a1- und a2-Untereinheiten des GABAA-Rezeptors für Dystonien: Untersuchungen im dtsz Hamstermodell

No description available.