A ocorrência de frutanos em espécies de Asteraceae foi amplamente documentada para a flora da região de cerrado da Reserva Biológica e Estação Experimental de Moji Guaçu. Dentre estas espécies destaca-se Vernonia herbacea, uma planta perene que apresenta órgãos subterrâneos de reserva, denominados rizóforos, que acumulam altos teores de frutanos do tipo inulina. Seu crescimento sazonal é caracterizado pela brotação das gemas existentes nos rizóforos, na primavera, seguida de floração e crescimento vegetativo intenso no verão e dormência no inverno. O conteúdo de frutanos diminui durante a brotação e floração, pois este carboidrato parece ser utilizado para a regeneração dos ramos aéreos que ocorre nesta fase. Estudos preliminares mostraram que a FEH, responsável pela mobilização dos frutanos, apresenta atividade elevada apenas durante a brotação; a despolimerização dos frutanos nos rizóforos de V. herbacea nesta fase foi evidenciada pelo aumento de açúcar redutor, especialmente frutose. O presente estudo teve como objetivo principal a análise da atividade das enzimas envolvidas no metabolismo de frutanos e análise do conteúdo e da composição de frutanos em rizóforos de V. herbacea induzidas à brotação. A brotação foi induzida pela remoção dos ramos aéreos e as atividades das enzimas FEH , SST, FFT e INV foram determinadas a cada quatro dias durante um mês após a poda. Um aumento na atividade da FEH foi observado entre os dias 13 e 20 após a poda, o que coincidiu com o início da brotação dos novos ramos que ocorreu no 13º dia. Este resultado sugere que a despolimerização de frutanos e a brotação são processos concomitantes em V. herbacea, que ocorrem naturalmente durante o ciclo fenológico, mas que também podem ser induzidos em outras fases do ciclo fenológico pela remoção dos ramos aéreos. A FFT parece atuar junto à FEH na diminuição do tamanho das cadeias de frutanos durante a rebrota, enquanto a SST é inibida devido, possivelmente, à interrupção do fornecimento de sacarose aos rizóforos pelos órgãos aéreos. Para a caracterização e purificação parcial da FEH de rizóforos de V. herbacea foram utilizados rizóforos de plantas induzidas à brotação através da remoção dos ramos aéreos. O extrato bruto apresentou, para atividade de FEH, pH ótimo de 4,5, temperatura ótima em 30 ºC e curva sigmoidal de concentração de substrato, sugerindo tratar-se de uma enzima alostérica. Esta enzima também apresentou maior especificidade por ligações do tipo b-2,1 do que sobre ligações b-2,6, e maior afinidade por frutanos de cadeias curtas quando comparadas com frutanos de cadeias longas. Utilizando precipitação com sulfato de amônia, cromatografia de afinidade e cromatografias de troca aniônica e catiônica, quatro frações com atividade de FEH foram purificadas. Destas quatro frações, duas foram submetidas à cromatografia de exclusão molecular, sendo que os pesos moleculares estimados para uma delas foi de 21 kDa e para outra, esta medida situou-se entre 155 e 39 kDa, devido à ampla faixa de exclusão da coluna utilizada. Os pesos moleculares das outras duas frações foram estimados por SDS-PAGE, sendo que as bandas visualizadas corresponderam a 81,3 e 57,5 kDa para uma e 57,5 kDa para a outra fração. / The occurrence of fructans has been reported in native species of a cerrado area of Reserva Biológica e Estação Experimental de Moji Guaçu. Vernonia herbacea, one of these species, presents underground organs named rhizophores which accumulate fructans of the inulin type as reserve carbohydrate. The seasonal growth pattern exhibited by plants of V. herbacea includes sprouting of buds from the rhizophores in spring, followed by a period of flower development and vegetative growth in summer, and dormancy in winter. The fructan content decreases during sprouting and flowering due to mobilization of this carbohydrate during the regeneration of the new shoots. Preliminary studies showed that FEH, the enzyme responsible for the mobilization of fructan, shows high activity only during sprouting. Fructan mobilization was detected by the increase in the amount of reducing sugar released, namely fructose. The aim of this work was to analyze the activities of the enzymes of fructan metabolism, FEH, SST, FFT and invertase and the fructan contents in rhizophores of plants induced to sprouting by defoliation. The enzyme activities were measured every 4 th day for a month after defoliation. Sprouting of new shoots started around the 13 th day, while an increase in FEH activity was detected between 13 and 20 days after defoliation. The results suggest that fructan depolimerization and sprouting are concomitant processes in V. herbacea that occur naturally during the phenological cycle; however, these processes can also be induced by defoliation during other stages of the phenological cycle. FFT seems to act together with FEH by catalyzing the decrease in fructan chain size during shoot regrowth, while SST was inhibited, possibly, due to interruption of sucrose supply to rhizophores from the aerial organs. The characterization and partial purification of FEH were done using rhizophores from plants which were induced to sprouting by defoliation. The optimal pH and temperature for FEH activity were pH4,5 and 30ºC, respectively. The substrate concentration curve exhibited a sigmoid shape, suggesting that FEH of V. herbacea is an alosteric enzyme. Additionally, this enzyme shows more specificity to b-2,1 than to b-2,6 linked fructan and higher affinity for short chain when compared to long chain fructans. Four fractions presenting FEH activity were partially purified by a combination of ammonium sulfate precipitation, affinity chromatography, and anion and cation exchange chromatographies. Two of these were submitted to size exclusion chromatography and the apparent molecular size for one of them was 21 kDa and for the other it was estimated to be between 39 and 155 kDa, due to the wide exclusion limit of the column used. The molecular size of the next two fractions were estimated by SDS- PAGE and the visualized bands corresponded to 81.3 and 57.5 kDa for the first fraction and to 57.5 kDa for the second one.

A ocorrência de frutanos em espécies de Asteraceae foi amplamente documentada para a flora da região de cerrado da Reserva Biológica e Estação Experimental de Moji Guaçu. Dentre estas espécies destaca-se Vernonia herbacea, uma planta perene que apresenta órgãos subterrâneos de reserva, denominados rizóforos, que acumulam altos teores de frutanos do tipo inulina. Seu crescimento sazonal é caracterizado pela brotação das gemas existentes nos rizóforos, na primavera, seguida de floração e crescimento vegetativo intenso no verão e dormência no inverno. O conteúdo de frutanos diminui durante a brotação e floração, pois este carboidrato parece ser utilizado para a regeneração dos ramos aéreos que ocorre nesta fase. Estudos preliminares mostraram que a FEH, responsável pela mobilização dos frutanos, apresenta atividade elevada apenas durante a brotação; a despolimerização dos frutanos nos rizóforos de V. herbacea nesta fase foi evidenciada pelo aumento de açúcar redutor, especialmente frutose. O presente estudo teve como objetivo principal a análise da atividade das enzimas envolvidas no metabolismo de frutanos e análise do conteúdo e da composição de frutanos em rizóforos de V. herbacea induzidas à brotação. A brotação foi induzida pela remoção dos ramos aéreos e as atividades das enzimas FEH , SST, FFT e INV foram determinadas a cada quatro dias durante um mês após a poda. Um aumento na atividade da FEH foi observado entre os dias 13 e 20 após a poda, o que coincidiu com o início da brotação dos novos ramos que ocorreu no 13º dia. Este resultado sugere que a despolimerização de frutanos e a brotação são processos concomitantes em V. herbacea, que ocorrem naturalmente durante o ciclo fenológico, mas que também podem ser induzidos em outras fases do ciclo fenológico pela remoção dos ramos aéreos. A FFT parece atuar junto à FEH na diminuição do tamanho das cadeias de frutanos durante a rebrota, enquanto a SST é inibida devido, possivelmente, à interrupção do fornecimento de sacarose aos rizóforos pelos órgãos aéreos. Para a caracterização e purificação parcial da FEH de rizóforos de V. herbacea foram utilizados rizóforos de plantas induzidas à brotação através da remoção dos ramos aéreos. O extrato bruto apresentou, para atividade de FEH, pH ótimo de 4,5, temperatura ótima em 30 ºC e curva sigmoidal de concentração de substrato, sugerindo tratar-se de uma enzima alostérica. Esta enzima também apresentou maior especificidade por ligações do tipo b-2,1 do que sobre ligações b-2,6, e maior afinidade por frutanos de cadeias curtas quando comparadas com frutanos de cadeias longas. Utilizando precipitação com sulfato de amônia, cromatografia de afinidade e cromatografias de troca aniônica e catiônica, quatro frações com atividade de FEH foram purificadas. Destas quatro frações, duas foram submetidas à cromatografia de exclusão molecular, sendo que os pesos moleculares estimados para uma delas foi de 21 kDa e para outra, esta medida situou-se entre 155 e 39 kDa, devido à ampla faixa de exclusão da coluna utilizada. Os pesos moleculares das outras duas frações foram estimados por SDS-PAGE, sendo que as bandas visualizadas corresponderam a 81,3 e 57,5 kDa para uma e 57,5 kDa para a outra fração. / The occurrence of fructans has been reported in native species of a cerrado area of Reserva Biológica e Estação Experimental de Moji Guaçu. Vernonia herbacea, one of these species, presents underground organs named rhizophores which accumulate fructans of the inulin type as reserve carbohydrate. The seasonal growth pattern exhibited by plants of V. herbacea includes sprouting of buds from the rhizophores in spring, followed by a period of flower development and vegetative growth in summer, and dormancy in winter. The fructan content decreases during sprouting and flowering due to mobilization of this carbohydrate during the regeneration of the new shoots. Preliminary studies showed that FEH, the enzyme responsible for the mobilization of fructan, shows high activity only during sprouting. Fructan mobilization was detected by the increase in the amount of reducing sugar released, namely fructose. The aim of this work was to analyze the activities of the enzymes of fructan metabolism, FEH, SST, FFT and invertase and the fructan contents in rhizophores of plants induced to sprouting by defoliation. The enzyme activities were measured every 4 th day for a month after defoliation. Sprouting of new shoots started around the 13 th day, while an increase in FEH activity was detected between 13 and 20 days after defoliation. The results suggest that fructan depolimerization and sprouting are concomitant processes in V. herbacea that occur naturally during the phenological cycle; however, these processes can also be induced by defoliation during other stages of the phenological cycle. FFT seems to act together with FEH by catalyzing the decrease in fructan chain size during shoot regrowth, while SST was inhibited, possibly, due to interruption of sucrose supply to rhizophores from the aerial organs. The characterization and partial purification of FEH were done using rhizophores from plants which were induced to sprouting by defoliation. The optimal pH and temperature for FEH activity were pH4,5 and 30ºC, respectively. The substrate concentration curve exhibited a sigmoid shape, suggesting that FEH of V. herbacea is an alosteric enzyme. Additionally, this enzyme shows more specificity to b-2,1 than to b-2,6 linked fructan and higher affinity for short chain when compared to long chain fructans. Four fractions presenting FEH activity were partially purified by a combination of ammonium sulfate precipitation, affinity chromatography, and anion and cation exchange chromatographies. Two of these were submitted to size exclusion chromatography and the apparent molecular size for one of them was 21 kDa and for the other it was estimated to be between 39 and 155 kDa, due to the wide exclusion limit of the column used. The molecular size of the next two fractions were estimated by SDS- PAGE and the visualized bands corresponded to 81.3 and 57.5 kDa for the first fraction and to 57.5 kDa for the second one.

O nitrogênio é um dos elementos mais limitantes no desenvolvimento de plantas. Vernonia herbacea (Vell.) Rusby, Asteraceae do cerrado, possui órgãos subterrâneos (rizóforos) que armazenam frutanos do tipo inulina. Estudos anteriores mostraram que o tratamento com solução nutritiva contendo 1,3 mmol L-1 NO3 - (Nlimitado) promoveu o acúmulo de frutanos nos rizóforos em detrimento do aumento de biomassa aérea e que o inverso ocorreu com plantas que receberam 10,7 mmol L-1 NO3 - (N-suficiente). Entretanto, não foram obtidas informações quanto às atividades das enzimas, em plantas sob esses tratamentos. Considerando a importância de estudos de nutrição mineral para a adequação de tratamentos de fertilização visando à produtividade de plantas de interesse econômico e em vista do teor elevado de frutanos em V. hebacea, este projeto teve como objetivos analisar o efeito do nitrogênio no crescimento e na alocação da biomassa, bem como no conteúdo e na composição de frutanos, nas atividades das enzimas de síntese (SST e FFT) e degradação (FEH e INV) de frutanos nos rizóforos e na atividade da redutase do nitrato (RN) e conteúdo de nitrato em folhas de V.herbacea. No presente trabalho, plantas de V. herbacea tratadas com baixo teor de nitrogênio (2,5 mmolL-1 de nitrato) apresentaram atividades de síntese (SST e FFT) superiores às tratadas com teor mais elevado de nitrogênio (11,9 mmol L-1 de nitrato), enquanto o inverso, ou seja, atividade elevada de despolimerização (FEH) ocorreu nas plantas que receberam 11,9 mmol L-1 de nitrato. O conteúdo de frutanos foi maior em plantas sob condições limitantes de nitrogênio, coerente com a maior atividade de síntese encontrada nestas plantas. Entretanto, maiores biomassas aérea e subterrânea foram encontradas nas plantas que receberam 2,5 mmolL-1 NO3 -, não sendo possível afirmar que baixos níveis de nitrato limitaram o seu crescimento. Dessa forma, para melhor compreensão do efeito do nitrato no crescimento, na alocação de biomassa e no metabolismo de frutanos em V. herbacea, foi conduzido um novo experimento que teve como objetivos analisar o efeito de diferentes concentrações de nitrato (0, 2,5, 5, 10 e 15 mM de KNO3) nos mesmos parâmetros analisados no experimento anterior em rizóforos e folhas de V. herbacea. Assim foi possível concluir que plantas tratadas com 10 mM apresentaram melhor eficiência no acúmulo total de biomassa e de frutanos nos rizóforos. Neste experimento, também foi demonstrado que plantas de V. herbacea, além dos frutanos, acumulam quantidades elevadas de nitrato nos rizóforos, mas assimilam preferencialmente esse mineral nas folhas. Uma vez que as plantas apresentaram maior massa seca aérea e subterrânea quando receberam soluções nutritivas enriquecidas com 10 mM de nitrato, foi realizado outro experimento para verificar a melhor fonte de nitrogênio no cultivo dessa espécie. As plantas foram submetidas ao cultivo com nitrato (KNO3), amônio ((NH4)2SO4) e a mistura de nitrato e amônio(NH4NO3), ambas na concentração de 10 mM, sendo possível verificar que esta espécie não apresentou preferência pela fonte nitrogenada, e sugerindo que o cultivo pode ser realizado em qualquer uma das fontes nitrogenadas estudadas. / Nitrogen is the most limiting element to plant development. Vernonia herbacea (Vell.) Rusby, Asteracea from the cerrado, bears underground organs (rhizophores) which accumulate inulin-type fructans. Previous studies showed that nutrient solution containing 1.3 mmol L-1 NO3 - (N-Limited treatment) promoted fructan accumulation in rhizophores and decrease of aerial biomass, while the opposite occurred in plants treated with nutrient solution containing 10.7 mmol L-1 NO3 - (N-sufficient treatment). However, as the activities of fructan metabolizing enzymes were not measured in these plants, new experiments were designed with this purpose. Thus, considering the importance of studies on mineral nutrition for the adjustment of the fertilization treatment, aiming at high contents of fructan and increase in plant productivity, the aim of this project was to analyse the effect of nitrogen on growth and biomass allocation, on fructan content and composition, on the activity of enzymes involved in fructan metabolism (SST, FFT, FEH and INV) in rhizophores, as well as on the activity of nitrate reductase (NR) and nitrogen content in leaves and rhizophores of V. herbacea. In the present work, plants treated with a low nitrogen concentration (2.5 mmol L-1 NO3 -) presented higher fructan biossynthetic activities than those treated with higher nitrogen concentration (11.9 mmol L-1 NO3 -). Oppositely, a higher mobilization activity occurred under high nitrogen concentration. Fructan content was higher in plants under low nitrogen concentration, in accordance with the higher biosynthetic activity in this treatment. However, higher aerial and underground biomass were detected in the 2.5 mmol L-1 NO3 - plants, indicating that growth was not limited under low levels of nitrate. Therefore, in order to improve the understanding of the effect of nitrate on growth, biomass allocation and fructan metabolism in V. herbacea, a new experiment was performed in which different concentrations of nitrate concentration (0, 2.5, 5.0, 10.0, 15.0 mM) were supplied in the same conditions mentioned above. The results showed that 10 mM nitrate was the most efficient concentration for total plant biomass and fructan accumulation in the rhizophore. It was also shown that, besides fructan, nitrate is accumulated in the rhizophores, but is preferably assimilated in leaves, where RN activity is higher. Considering results obtained with 10 mM nitrate, a third experiment was done in order to compare the effect of different nitrogen sources on growth of V. herbacea. The plants were treated with nutrient solutions containing ammoniun ((NH4)2SO4), nitrate(KNO3) and a mixture of nitrate and ammoniun (NH4NO3), both at a final concentration of 10 mM. No preference for the nitrogen source was observed when growth parameters were analysed. Therefore, the results suggest that plants of V. herbacea can be cultivated under any of the nitrogen sources used in this study.

O nitrogênio é um dos elementos mais limitantes no desenvolvimento de plantas. Vernonia herbacea (Vell.) Rusby, Asteraceae do cerrado, possui órgãos subterrâneos (rizóforos) que armazenam frutanos do tipo inulina. Estudos anteriores mostraram que o tratamento com solução nutritiva contendo 1,3 mmol L-1 NO3 - (Nlimitado) promoveu o acúmulo de frutanos nos rizóforos em detrimento do aumento de biomassa aérea e que o inverso ocorreu com plantas que receberam 10,7 mmol L-1 NO3 - (N-suficiente). Entretanto, não foram obtidas informações quanto às atividades das enzimas, em plantas sob esses tratamentos. Considerando a importância de estudos de nutrição mineral para a adequação de tratamentos de fertilização visando à produtividade de plantas de interesse econômico e em vista do teor elevado de frutanos em V. hebacea, este projeto teve como objetivos analisar o efeito do nitrogênio no crescimento e na alocação da biomassa, bem como no conteúdo e na composição de frutanos, nas atividades das enzimas de síntese (SST e FFT) e degradação (FEH e INV) de frutanos nos rizóforos e na atividade da redutase do nitrato (RN) e conteúdo de nitrato em folhas de V.herbacea. No presente trabalho, plantas de V. herbacea tratadas com baixo teor de nitrogênio (2,5 mmolL-1 de nitrato) apresentaram atividades de síntese (SST e FFT) superiores às tratadas com teor mais elevado de nitrogênio (11,9 mmol L-1 de nitrato), enquanto o inverso, ou seja, atividade elevada de despolimerização (FEH) ocorreu nas plantas que receberam 11,9 mmol L-1 de nitrato. O conteúdo de frutanos foi maior em plantas sob condições limitantes de nitrogênio, coerente com a maior atividade de síntese encontrada nestas plantas. Entretanto, maiores biomassas aérea e subterrânea foram encontradas nas plantas que receberam 2,5 mmolL-1 NO3 -, não sendo possível afirmar que baixos níveis de nitrato limitaram o seu crescimento. Dessa forma, para melhor compreensão do efeito do nitrato no crescimento, na alocação de biomassa e no metabolismo de frutanos em V. herbacea, foi conduzido um novo experimento que teve como objetivos analisar o efeito de diferentes concentrações de nitrato (0, 2,5, 5, 10 e 15 mM de KNO3) nos mesmos parâmetros analisados no experimento anterior em rizóforos e folhas de V. herbacea. Assim foi possível concluir que plantas tratadas com 10 mM apresentaram melhor eficiência no acúmulo total de biomassa e de frutanos nos rizóforos. Neste experimento, também foi demonstrado que plantas de V. herbacea, além dos frutanos, acumulam quantidades elevadas de nitrato nos rizóforos, mas assimilam preferencialmente esse mineral nas folhas. Uma vez que as plantas apresentaram maior massa seca aérea e subterrânea quando receberam soluções nutritivas enriquecidas com 10 mM de nitrato, foi realizado outro experimento para verificar a melhor fonte de nitrogênio no cultivo dessa espécie. As plantas foram submetidas ao cultivo com nitrato (KNO3), amônio ((NH4)2SO4) e a mistura de nitrato e amônio(NH4NO3), ambas na concentração de 10 mM, sendo possível verificar que esta espécie não apresentou preferência pela fonte nitrogenada, e sugerindo que o cultivo pode ser realizado em qualquer uma das fontes nitrogenadas estudadas. / Nitrogen is the most limiting element to plant development. Vernonia herbacea (Vell.) Rusby, Asteracea from the cerrado, bears underground organs (rhizophores) which accumulate inulin-type fructans. Previous studies showed that nutrient solution containing 1.3 mmol L-1 NO3 - (N-Limited treatment) promoted fructan accumulation in rhizophores and decrease of aerial biomass, while the opposite occurred in plants treated with nutrient solution containing 10.7 mmol L-1 NO3 - (N-sufficient treatment). However, as the activities of fructan metabolizing enzymes were not measured in these plants, new experiments were designed with this purpose. Thus, considering the importance of studies on mineral nutrition for the adjustment of the fertilization treatment, aiming at high contents of fructan and increase in plant productivity, the aim of this project was to analyse the effect of nitrogen on growth and biomass allocation, on fructan content and composition, on the activity of enzymes involved in fructan metabolism (SST, FFT, FEH and INV) in rhizophores, as well as on the activity of nitrate reductase (NR) and nitrogen content in leaves and rhizophores of V. herbacea. In the present work, plants treated with a low nitrogen concentration (2.5 mmol L-1 NO3 -) presented higher fructan biossynthetic activities than those treated with higher nitrogen concentration (11.9 mmol L-1 NO3 -). Oppositely, a higher mobilization activity occurred under high nitrogen concentration. Fructan content was higher in plants under low nitrogen concentration, in accordance with the higher biosynthetic activity in this treatment. However, higher aerial and underground biomass were detected in the 2.5 mmol L-1 NO3 - plants, indicating that growth was not limited under low levels of nitrate. Therefore, in order to improve the understanding of the effect of nitrate on growth, biomass allocation and fructan metabolism in V. herbacea, a new experiment was performed in which different concentrations of nitrate concentration (0, 2.5, 5.0, 10.0, 15.0 mM) were supplied in the same conditions mentioned above. The results showed that 10 mM nitrate was the most efficient concentration for total plant biomass and fructan accumulation in the rhizophore. It was also shown that, besides fructan, nitrate is accumulated in the rhizophores, but is preferably assimilated in leaves, where RN activity is higher. Considering results obtained with 10 mM nitrate, a third experiment was done in order to compare the effect of different nitrogen sources on growth of V. herbacea. The plants were treated with nutrient solutions containing ammoniun ((NH4)2SO4), nitrate(KNO3) and a mixture of nitrate and ammoniun (NH4NO3), both at a final concentration of 10 mM. No preference for the nitrogen source was observed when growth parameters were analysed. Therefore, the results suggest that plants of V. herbacea can be cultivated under any of the nitrogen sources used in this study.