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Einfluss der 3' nichttranslatierten Region von Chikungunya-Virus auf die Replikation in verschiedenen Stechmückenarten

Karliuk, Yauhen 04 November 2022 (has links)
Zusammenfassung Yauhen Karliuk Einfluss der 3' nichttranslatierten Region von Chikungunya-Virus auf die Replikation in verschiedenen Stechmückenarten Institut für Tierhygiene und Öffentliches Veterinärwesen der Veterinärmedizinischen Fakultät, Universität Leipzig Eingereicht im Februar 2022 52 Seiten, 7 Abbildungen, 116 Literaturangaben, 1 Publikation Schlüsselwörter: Chikungunya-Virus; 3′ UTR; direct repeats (DRs); CHIKV 3́ UTR-Deletionsmutante; Vektorkompetenz; Aedes vexans; Culex pipiens Einleitung: Arthropoden-übertragene Viren (Arboviren) spielen weltweit eine große Rolle für die Gesundheit von Menschen und Tieren. Das Chikungunya-Virus (CHIKV) wird v.a. durch Stechmücken der Gattung Aedes übertragen. Die Hauptvektoren sind Aedes aegypti (Ae. aegypti) und Aedes albopictus (Ae. albopictus), wobei letzterer sich zunehmend auch in gemäßigten Breiten etabliert. Ziele der Untersuchungen: Zum einen sollte untersucht werden, ob auch die Stechmückenarten Aedes vexans (Ae. vexans) und Culex pipiens molestus (Cx. pipiens), die in gemäßigten Klimazonen vorkommen, als CHIKV-Vektoren fungieren können. Zum anderen sollte der Einfluss von Deletionen der Sequenzwiederholungen (DR) in der 3‘ nichttranslatierten Region (3‘ UTR) auf die virale Replikation in Zellkultur und in Stechmücken untersucht werden. Tiere, Material und Methoden: Zunächst wurde eine CHIKV 3́ UTR-Deletionsmutante mit einer Deletion von DR1a und DR2a in der 3́ UTR (CHIKV-ΔDR) hergestellt und diese bezüglich der Wachstumskinetik mit Chikungunya-Wildtyp-Virus (CHIKV-WT) in C6/36- und Aag2-Stechmückenzellen sowie in BHK-21/J- Wirbeltier-Zellen verglichen. Um die Vektorkompetenz von beiden Viren in Stechmücken zu untersuchen, wurden Ae. aegypti, Ae. albopictus, Ae. vexans und Cx. pipiens in einem Insektarium gezüchtet. Bei den Infektionsexperimenten im S3-Labor wurden insgesamt 27 Ae. aegypti, 20 Ae. albopictus, 78 Ae. vexans und 62 Cx. pipiens Stechmücken verwendet. In diesen Experimenten wurden diese mit CHIKV-ΔDR und CHIKV-WT sowohl oral mit je 1x 10^6 PFU/ml über eine Fütterungsmembran als auch intrathorakal mit je 200 PFU (zur Umgehung der Mitteldarmbarriere) infiziert und an verschiedenen Tagen nach der Infektion und in verschiedenen Körperteilen sowie im Speichel auf virale RNA mittels Real-Time Reverser Transkription-Polymerase Kettenreaktion (RT-PCR) untersucht. Unterschiede in der Virusreplikation wurden entweder mit Mann-Whitney- oder Fisher’s Exakt-Test überprüft. Das Signifikanzniveau lag bei p < 0,05. Ergebnisse: Beide Viren, das CHIKV-WT und das CHIKV-ΔDR, zeigten ein vergleichbares Wachstum in Wirbeltier-Zellen (BHK-21/J) und erreichten einen Titer von 5x 10^8 PFU/ml. Das Wachstum beider Viren war auch in von Ae. albopictus abgeleiteten C6/36- Stechmückenzellen effizient, wobei CHIKV-WT ein um knapp eine Log-Stufe höheres Wachstum zeigte als CHIKV-ΔDR. In unseren Experimenten zeigte CHIKV-WT ein weniger effizientes Wachstum in von Ae. aegypti abgeleiteten Aag2-Stechmückenzellen, als in Ae. albopictus abgeleiteten C6/36-Stechmückenzellen, obwohl Ae. aegypti als Hauptvektor für CHIKV-WT gilt. In einer intrathorakalen und oralen Infektion konnten sowohl die bekannten CHIKV-Vektoren Ae. aegypti und Ae. albopictus als auch die einheimische Stechmückenarten Ae. vexans und Cx. pipiens erfolgreich infiziert werden. Bei einer intrathorakalen Infektion mit Umgehung der Mitteldarmbarriere wurde bei Ae. vexans oder Cx. pipiens eine effizientere Virusreplikation beobachtet als bei einer oralen Infektion. CHIKV-WT zeigte eine signifikant höhere Replikation in Ae. vexans im Vergleich zu CHIKV-ΔDR am Tag 7 und am Tag 14 nach der Infektion. Bei Cx. pipiens wurden signifikante Unterschiede für CHIKV-WT im Vergleich zu CHIKV-ΔDR nur am Tag 7 beobachtet. Schlussfolgerungen: Das beeinträchtigte Wachstum in C6/36- und Aag2-Zellen von CHIKV-ΔDR deutet darauf hin, dass die deletierten Sequenzwiederholungen spezifisch mit noch unbekannten Faktoren in Stechmückenzellen interagieren. Dennoch konnte CHIKV-ΔDR die bekannten CHIKV-Vektoren Ae. aegypti und Ae. albopictus problemlos nach intrathorakaler und oraler Infektion infizieren. Die Mitteldarm-Entweichungsbarriere scheint also nicht der einzige Faktor zu sein, der die Vektorkompetenz von Stechmücken beeinflusst. Auch die Replikationskinetik des Virus in den Sekundärgeweben scheint bei den verschiedenen Stechmückenarten unterschiedlich zu sein. Zwar umfassten unsere Studien zur oralen Infektion mit CHIKV nur einige einheimische Ae. vexans und Cx. pipiens Stechmücken, jedoch deuten die Ergebnisse darauf hin, dass diese Stechmücken potenziell als Vektoren für CHIKV dienen können.:Inhaltsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis 1 Einleitung 1 2 Literaturübersicht 2 2.1 Alphaviren 2 2.1.1 Klassifikation 2 2.1.2 Virusmorphologie und Genomaufbau 2 2.1.3 Virusreplikation 4 2.2 Chikungunya-Virus 5 2.2.1 Übertragungszyklus 5 2.2.2 Epidemiologie 7 2.2.3 Genotypen und die 3′ UTR Region 9 2.2.4 Chikungunya-Fieber 12 2.3 Stechmücken 13 2.3.1 Taxonomie und Stechmückenarten in Deutschland 13 2.3.2 Allgemeine Morphologie, Biologie und Ökologie 14 2.3.2.1 Eiablage und Schlüpfen der Larven 15 2.3.2.2 Aquatische Entwicklungsstadien 16 2.3.2.3 Adulte 17 2.3.2.4 Flugverhalten und Überwinterungsstrategien 19 2.3.3 Arboviren in Deutschland 20 3 Publikation 26 3.1 Stellungnahme zum Eigenanteil an den Arbeiten zur Publikation 26 3.2 Publikation 27 4 Diskussion 42 5 Zusammenfassung 49 6 Summary 51 7 Literaturverzeichnis 53 8 Danksagung 66
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Vector Competence of German Mosquito Species for West Nile Virus and Usutu Virus and the Impact of Co-Infections

Körsten, Christin 13 November 2023 (has links)
Einleitung: Das West Nil-Virus (WNV) und das Usutu-Virus (USUV) zirkulieren seit vielen Jahren in Europa und sind auch in Deutschland endemisch geworden. Beide Viren können schwere Erkrankungen in Vögeln auslösen. Zudem kann insbesondere WNV auch zu schweren neurologischen Erkrankungen bei Menschen und Pferden führen, und unentdeckte WNV-Infektionen sind ein Risiko für die Sicherheit von Blutspenden. WNV und USUV werden von Stechmücken als biologische Vektoren übertragen, wobei sich verschiedene Mückenspezies in ihrer Vektorkompetenz unterscheiden können. Die Kenntnis über die Vektorkompetenz von Mückenspezies ist essentiell für die effiziente Überwachung und Bekämpfung dieser Viren. Weitgehend unbekannt ist jedoch, welche Auswirkungen Ko-Infektionen mit WNV und USUV auf die Vektorkompetenz von Stechmücken haben. Ziele der Untersuchungen: Ziel der ersten Studie war es, die Vektorkompetenz der bislang wenig untersuchten Mückenspezies Aedes punctor für WNV zu bestimmen. Mit der zweiten Studie sollten Mono- und simultane Ko-Infektionen mit WNV und USUV in verschiedenen Stechmückenarten (Culex pipiens Biotyp pipiens, Culex pipiens Biotyp molestus, Aedes vexans) durchgeführt werden, um die Auswirkungen von Ko-Infektionen auf die Übertragung beider Viren zu bestimmen. Tiere, Material und Methoden: Die für die Versuche verwendeten Stechmücken wurden entweder in Deutschland gesammelt oder stammten aus den Laborkolonien am Friedrich-Loeffler-Institut. Die Infektionen erfolgten oral über Blut, welches ein oder beide Viren enthielt und über Wattestäbchen angeboten wurde. Blutgesogene Weibchen wurden über einen definierten Zeitraum unter definierten Umweltbedingungen inkubiert. Nach Ablauf der Inkubationszeit wurden die noch lebenden Tiere durch das Entfernen der Beine und Flügel immobilisiert, um die Gewinnung von Speichel zu ermöglichen. Ein Teil der Speichelprobe wurde auf eine Zellkultur gegeben, um infektiöse Viruspartikel nachzuweisen. Zur Bestimmung der Infektion, Dissemination und potenzieller Übertragung wurden die Körper, die Beine und Flügel, die Speichelproben sowie der Überstand der Zellkultur mit einer quantitativen Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR) auf virale RNA untersucht. Im Falle der Ko-Infektionsstudie wurden zeitgleich Mono-Infektionen durchgeführt und die Ergebnisse verglichen, um potenzielle Veränderungen in Empfänglichkeit oder Übertragung feststellen zu können. Ergebnisse: In der ersten Studie zeigte sich, dass Ae. punctor nicht vektorkompetent für WNV ist. Von insgesamt 155 untersuchten Weibchen waren nur 7 Tiere mit WNV infiziert. In den Speichelproben wurden weder infektiöse Viruspartikel noch virale RNA nachgewiesen. In der zweiten Studie konnte gezeigt werden, dass sowohl Cx. pipiens Biotyp pipiens als auch Cx. pipiens Biotyp molestus effektive Vektoren für WNV und USUV sein können. Im Gegensatz dazu waren Ae. vexans Weibchen nicht empfänglich für eine Infektion durch WNV oder USUV. In den Ko-Infektionen zeigte sich, dass die Empfänglichkeit für USUV in Cx. pipiens Biotyp pipiens verringert und in Ae. vexans erhöht war. In Cx. pipiens Biotyp molestus waren hingegen keine Unterschiede zwischen Mono- und Ko-infektionen festzustellen. Bei Cx. pipiens Biotyp molestus wurden infektiöse Partikel beider Viren in Speichelproben gefunden, was auf eine potenzielle Ko-Übertragung hindeutet. Schlussfolgerung: Aufgrund der Ergebnisse kann davon ausgegangen werden, dass Ae. punctor und Ae. vexans derzeit keine Rolle bei der Übertragung von WNV oder USUV spielen und daher vorerst bei Überwachungsprogrammen in Deutschland nicht berücksichtigt werden müssen. Für Cx. pipiens Mücken konnte hingegen die Rolle als Hauptvektoren für WNV und USUV durch Infektionsstudien bestätigt werden. Es konnte zudem gezeigt werden, dass die Interaktion zwischen WNV und USUV in der Stechmücke speziesabhängig variiert. Aufgrund dessen ist eine Untersuchung von Ko-Infektionen in weiteren potenziellen Vektorspezies notwendig, um ein besseres Verständnis der Interaktionen zu bekommen. Die Studie zeigt auch, dass unter Umständen auch nicht vektorkompetente Spezies durch eine Ko-Infektion eine Rolle in der Übertragung der Viren spielen könnten. In Gebieten, in denen WNV und USUV sympatrisch zirkulieren, sollte diese Erkenntnis in den Überwachungs- und Bekämpfungsstrategien berücksichtigt werden. Eine potenzielle Ko-Übertragung beider Viren wurde zwar beobachtet, trat innerhalb dieser Studie aber selten auf und scheint daher eher eine geringe Rolle spielen. / Introduction: West Nile virus (WNV) and Usutu virus (USUV) have been circulating in Europe for many years and have also become endemic in Germany. Both viruses can cause severe diseases in birds. In addition, WNV in particular can also lead to severe neurological diseases in humans and horses, and undetected WNV infections pose a risk to the safety of blood donations. Both WNV and USUV are transmitted by mosquitoes as biological vectors, whereby different mosquito species can differ in their vector competence. Knowledge of the vector competence of various mosquito species is essential for efficient surveillance and control of these viruses. What is largely unknown, however, is the impact of co-infections with WNV and USUV on the vector competence of mosquitoes. Objective: The aim of the first study was to determine the vector competence of the mosquito species Aedes punctor for WNV, which has so far been little studied. The second study aimed to perform mono- and simultaneous co-infections with WNV and USUV in different mosquito species (Culex pipiens biotype pipiens, Culex pipiens biotype molestus, Aedes vexans) in order to determine the impact of co-infections on the transmission of both viruses. Animals, material and methods: The mosquitoes used for the experiments were either collected in Germany or were taken from the laboratory colonies at the Friedrich-Loeffler-Institute. Mosquitoes were orally infected via a blood that contained one or both viruses using cotton sticks. Engorged females were incubated over a defined period of time under defined environmental conditions. At the end of the incubation period, surviving animals were immobilized by removing the legs and wings, and saliva was obtained. Part of each saliva sample was placed on cell culture to detect infectious virus particles. To determine infection, dissemination and potential transmission, the bodies, legs and wings, saliva samples and supernatant of the cell culture were analyzed for viral RNA by a quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-qPCR). During the co-infection study, mono-infections were carried out at the same time as the co-infections and results were compared in order to be able to determine potential changes in susceptibility or transmission. Results: In the first study, Ae. punctor showed to be not susceptible for WNV. Of a total of 155 females examined, only 7 females were found infected. Neither infectious viral particles nor viral RNA was found in saliva samples. In the second study it could be shown that Cx. pipiens biotype pipiens as well as Cx. pipiens biotype molestus can be effective vectors for WNV and USUV. In contrast, Ae. vexans was not susceptible to an infection with WNV or USUV. In Co-infections, it was shown that the susceptibility to USUV was reduced in Cx. pipiens biotype pipiens and increased in Ae. vexans. In Cx. pipiens biotype molestus, however, no differences were found between mono- and co-infections. In Cx. pipiens biotype molestus mosquitoes, infectious particles of both viruses were found in saliva samples, indicating a potential co-transmission by this species. Conclusion: Based on the results, it can be assumed that Ae. punctor and Ae. vexans do not play a role in WNV and USUV transmission and therefore currently do not need to be included in a surveillance in Germany. In contrast, the role of Cx. pipiens mosquitoes as main vectors for WNV and USUV could be confirmed by infection studies. It could also be shown that the interaction between WNV and USUV in the mosquito vector varies and is species dependent. Therefore, an investigation of co-infections in various potential vector species and even different populations is essential to get a better understanding of the interactions between both viruses within the mosquito. The study also showed that, under certain circumstances, non-vector-competent species might also play a role in the transmission of the viruses in the event of a co-infection. Thus, in areas where WNV and USUV are both endemic, surveillance and control programs should take this knowledge into account. Potential co-transmission of both viruses was observed, but was rare in this study and therefore seems to play a rather minor role.

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