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Hohenheim, Univ., Diss., 2008.

Chez les plantes céréalières d'hiver, le temps de floraison est retardé jusqu'à ce que les conditions favorables de croissance arrivent. Ce retard est modulé par les basses températures via le processus de vernalisation. Ce processus est régulé par au moins deux gènes clés, VRN1 et VRN2. Ces gènes sont caractérisés chez le blé diploïde (Triticum monococcum), un blé non cultivé. Le gène VRN1 est aussi caractérisé chez le blé hexaploïde (Triticum aestivum) et il est nommé TaVRT-1(Triticum aestivum Vegetative to Reproductive Phase 1). Un troisième gène nommé TaVRT-2 est identifié chez le blé hexaploïde. L'expression de ce gène durant le processus de la vernalisation est associée à la floraison. Cependant, les interactions entre ces trois gènes clés et leur rôle respectif durant le processus de vernalisation sont peu connus. Pour mieux comprendre leurs relations, nous avons cloné les trois copies de VRN2 (TaVRN2) qui correspondent aux trois génomes A, B et D et déterminé leur patron d'expression durant la vernalisation chez le cultivar de blé d'hiver (cv Norstar) et celui de printemps (cv Manitou). Les résultats montrent que l'expression de TaVRN2 est constitutive chez Manitou alors que son expression est négativement régulée durant le processus de vernalisation chez Norstar. Son expression est aussi régulée par la photopériode. Certains stress abiotiques comme le choc thermique, la déshydratation, le stress salin, les blessures et l'hormone ABA répriment son expression. L'analyse du promoteur révèle la présence d'éléments cis impliqués dans la régulation de ces stress abiotiques. Les études sur la spécificité et localisation tissulaire par hybridation in situ montrent que le gène s'accumule dans les jeunes feuilles et au niveau des cellules du méristème. La séquence codante de la copie B du gène TaVRN2 a été clonée dans un vecteur pTrcHisB contenant une queue histidine et exprimée dans la bactérie Escherichia coli. La protéine recombinante est vérifiée par immuno-buvardage de type western en utilisant un anticorps Anti-His et l'identité de la protéine a été confirmée par séquençage au spectomètre de masse. Les études d'interactions protéiques en utilisant le système de double hybride chez la levure, révèlent que la protéine TaVRN2 interagit avec les protéines TaVRT-1 et TaVRT-2. Des expériences de transrépression du promoteur de TaVRT-1 fusionné avec GFP agissant comme gène rapporteur au niveau des feuilles de tabac et en utilisant la protéine TaVRN2 comme un effecteur ont été menées. Les résultats indiquent que TaVRN2 seul ne réprime pas l'activité du promoteur Tavrt-1. Cependant le complexe TaVRT-2 et TaVRN2 réprime l'activité du promoteur. La surexpression de TaVRN2 chez Arabidopsis thaliana montre un retard de floraison chez les plantes transgéniques de plus de dix jours,ce qui suggère queTaVRN2 peut agir comme répresseur de la floraison chez les dicotylédones.

Thèse de doctorat : Physiologie et biologie des organismes et des populations : Orléans : 2009. / Titre provenant de l'écran-titre.

La floraison, une des étapes cruciales du cycle de vie des plantes, est influencée par les facteurs environnementaux tels que la température et la durée d'ensoleillement. La majorité des espèces végétales évoluant en zones tempérées ont fort avantageusement développé des mécanismes d'adaptation leur permettant de mieux synchroniser leur développement en condition de basses températures et de courte durée d'ensoleillement. En réponse au stress causé par une longue exposition aux basses températures, les plantes induisent un processus nommé vernalisation qui consiste à induire une floraison précoce chez les plantes sensibles. Cette capacité à promouvoir la floraison peut également être acquise selon la sensibilité de chaque plante par une longue ou courte exposition de lumière (photopériode). Ces mécanismes d'adaptation favorisent une floraison au moment opportun et assurent une bonne reproduction. Chez Arabidopsis, des analyses génétiques et moléculaires ont démontré que l'expression de nombreux gènes était modulée en réponse aux variations de basses températures et de lumière afin de bien synchroniser la transition florale. La plupart des gènes ayant un rôle majeur dans la régulation de la floraison en réponse aux variations de températures et de lumière code pour des protéines conservées chez les eucaryotes et impliquées dans divers aspects du développement et la reproduction des espèces: les facteurs de transcription de type MADS-box. D'ailleurs, toutes les voies de régulation de la floraison chez Arabidopsis convergent vers un répresseur central, le gène FLC (Flowering locus C) qui code pour un facteur de transcription de type MADS-box. Chez les céréales, aucun homologue de FLC n'est, à ce jour, identifié et très peu de gènes MADS-box ont une fonction connue. Afin de pousser la caractérisation des gènes MADS-box chez les céréales et d'élucider leurs rôles lors de la régulation de la floraison, l'identification de cette famille de gènes a été entreprise chez le blé. Le blé hexaploïde a été choisi comme modèle d'étude à cause de sa grande variabilité de réponses face aux stress, ce qui lui confère une grande résistance et aptitude à pousser dans des zones où le climat et les saisons sont variables. De plus. il est plus intéressant au niveau agronomique, nutritif et économique qu'Arabidopsis. Par contre, ce choix s'accompagne d'un grand défi du fait de la taille et de la complexité du génome du blé. mais également des caractéristiques structurales et évolutives de la famille de gènes MADS-box. Pour ces raisons, une approche génomique combinant des outils bioinformatiques et des études moléculaires a été utilisée. L'identification d'ADNc de MADS-box chez le blé hexaploïde, par recherche de bases de données, par PCR ou criblage de banques, montre que plus d'une cinquantaine de facteurs MADS-box sont codés par ses génomes. En général, ces facteurs présentent une grande conservation de structures et de fonctions durant l'évolution chez les angiospermes. Une analyse moléculaire sommaire de membres de la famille MADS-box, en réponse à la vernalisation et à la photopériode, a permis d'identifier et d'associer un de ces facteurs, nommé TaVRT-2, à la régulation de la floraison. En réponse à la vernalisation, l'ARNm de TaVRT-2 s'accumule seulement durant la phase végétative du blé d'hiver et ce profil est inversement proportionnel à celui du gène majeur de vernalisation VRNl/TaVRT-l. Ce résultat suggérait que TaVRT-2 pouvait retarder la transition florale en réprimant l'expression de TaVRT-l ou bien que Ta VRT-I induisait la floraison après la répression de TaVRT-2. Or, les études génétiques indiquaient que l'accumulation de TaVRT-l était un des événements les plus tardifs dans l'induction de la floraison. De plus, les études d'interactions protéiques indiquent que TaVRT-2 est capable de former des hétérodimères, surtout avec TaVRT-l. Enfin, la présence au niveau de son promoteur d'un élément cis spécifique au MADS-box suggérait plutôt que TaVRT-2 régule négativement l'expression de TaVRT-l. Toutes ces données soutenaient l'hypothèse que TaVRT-2 est un régulateur négatif de TaVRT-l et donc de la transition florale chez le blé. Grâce à des études de liaisons in vitro et par expression transitoire in vivo, il est démontré que la protéine TaVRT-2 réprime la transcription du gène TaVRT-l en se liant directement sur le promoteur et probablement en recrutant d'autres facteurs importants. Des études chez des plantes transgéniques confirment que TaVRT-2 est capable de retarder la floraison et qu'il est impliqué dans la voie autonome de régulation de la floraison. Le clonage des gènes MADS-box de blé a permis de voir que les acteurs majeurs impliqués dans la régulation de la vernalisation sont différents entre espèces monocotylédones et dicotylédones. En ce sens, l'identification de TaVRT-2 constitue une contribution importante dans l'étude des mécanismes de régulation de la floraison. L'implication de TaVRT-2 dans les voies de régulation de la floraison (vernalisation, photopériode et autonome) démontre qu'il est un répresseur central de la floraison chez les céréales à l'instar de FLC chez Arabidopsis. Ces résultats montrent à quel point une meilleure compréhension des mécanismes d'adaptation des plantes face aux changements environnementaux peut contribuer à une bonne synchronisation de la floraison et du développement chez les céréales. En perspective, cette étude offre des avenues intéressantes sur le plan de l'amélioration des stratégies agricultrices et de l'augmentation de la productivité céréalière. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Blé hexaploïde, Facteurs de transcription, MADS-box, Floraison, Vernalisation, Photopériode.

La betterave sucrière est une plante bisannuelle dont le besoin de vernalisation est absolu. Ce processus correspond à l’acquisition de l’aptitude à la montaison et à la floraison et résulte d’une exposition prolongée à de basses températures. La durée de froid requise pour induire la montaison puis la floraison varie suivant les génotypes et reflète leur tolérance à la montaison, qui constitue donc un caractère agronomique essentiel. Cette thèse visait à (i) mettre en évidence un éventuel contrôle épigénétique (méthylation ADN) de l‘induction de la montaison chez des génotypes de betterave sucrière résistants ou sensibles à la montaison, (ii) identifier les séquences ciblées par des remaniements de méthylation de l’ADN et d’expression associés, et (iii) caractériser certaines séquences candidates en vue de leur utilisation comme marqueurs de la montaison. Nos travaux ont montré que l’amplitude et la cinétique des variations de méthylation de l’ADN observées au cours de la vernalisation semblent être des éléments critiques de l’induction et de la tolérance à la montaison. Par une approche ciblée, des séquences dont la méthylation de l’ADN est remaniée ont été identifiées. L’implication dans la transition florale de deux BvRNMT (RNA METHYLTRANSFERASES) et de la méthylation des ARN, tels que l’ARNm de BvFL1, un répresseur floral, a ainsi été mise en évidence chez la betterave sucrière. Enfin, grâce à une approche génomique, un réseau de gènes intégratif incluant la réponse à l’environnement, la signalisation hormonale et l’induction de la floraison a été identifié. La cinétique d’activation de ces gènes définirait le niveau de tolérance à la montaison des différents génotypes de betterave sucrière. / Sugar beet is a biennial plant with an absolute requirement of vernalization, corresponding to the acquisition of the competence to bolt and flower after a prolonged exposure to low temperatures. The cold duration needed to induce bolting and flowering varies depending on the genotypes, reflecting their bolting tolerance, which is an essential agronomic trait. This work aimed at (i) investigating a possible epigenetic control of bolting induction in bolting sensitive and bolting resistant sugar beet genotypes, (ii) identifying sequences targeted by DNA methylation and expression remodeling, and (iii) characterizing candidate sequences which could be used in marked-assisted selection for plant breeding. Our data suggest that the time course and amplitude of DNA methylation variations are critical points for the induction of sugar beet bolting and represent an epigenetic component of the genotypic bolting tolerance. In addition, we identified differentially methylated sequences exhibiting variations of gene-body DNA methylation and expression during cold exposure and/or between genotypes. Among them, two RNA METHYLCYTOSINE TRANSFERASES, in association with RNA methylation such as BvFL1 mRNA, a floral repressor, were shown to play a role in floral transition. Finally, using microarrays we identified an integrative network of genes including response to environment, phytohormone signalling and flowering induction. The activation kinetics of these genes could define the bolting tolerance level of sugar beet genotypes.

Les plantes sont des organismes sessiles, ce qui implique qu'elles doivent passer à travers tous les stades de leur développement au même endroit peu importe les conditions environnementales. La transition de la phase végétative (production de tiges et feuilles) à la phase reproductive (production de fleurs) est une étape cruciale de ce développement. Les facteurs environnementaux tels que la durée de l'ensoleillement, la température, les nutriments et la disponibilité en eau sont des déterminants importants de cette transition, et donc de la floraison. En zones tempérées, la majorité des espèces végétales ont développé des mécanismes d'adaptation leur permettant d'optimiser leur développement en fonction des conditions de température et d'ensoleillement. Des pertes agricoles importantes peuvent être encourues si ces conditions ne sont pas optimales. Le blé est une des espèces céréalières essentielles à cause de son utilisation quotidienne directe et indirecte dans la nourriture de la population humaine mondiale et des animaux. Cette céréale est composée essentiellement de cultivars d'hiver et de cultivars de printemps. Les cultivars d'hiver sont semés en automne et récoltés en début d'été, donc traversant tout l'automne et l'hiver avec le risque de pertes dues au gel. Les cultivars de printemps sont semés au printemps et récoltés en fin d'été avec le risque de pertes dues au gel d'automne et aux attaques d'insectes ravageurs plus abondants à ce moment. La floraison du blé d'hiver requiert une exposition prolongée aux températures basses, un processus appelé vernalisation. Chez le blé hexaploïde (Triticum aestivum L.), le processus de vernalisation est régi par une des voies génétiques qui impliquent trois gènes principaux qui codent pour des facteurs de transcription, Triticum aestivum VERNALIZATION1 (TaVRN1), Triticum aestivum VERNALIZATION2 (TaVRN2) et Triticum aestivum FLOWERING LOCUS T like 1 (TaFT1), également appelé TaVRN3. TaVRN1 et TaVRN3 sont des activateurs de la floraison tandis que TaVRN2 est un répresseur de la floraison. Afin de comprendre la fonction et la régulation de chacun de ces trois gènes dans la floraison du blé hexaploïde, j'ai utilisé une approche génomique (biopuce) combinée à des outils bioinformatiques (analyse de données et de séquences) et une approche de génétique moléculaire (régulation de l'expression génique, épigénétique, et mutagène). Dans une première étude, j'ai testé si VRN2 peut agir comme un répresseur de la floraison chez une espèce de plante différente des céréales tempérées. Pour atteindre cet objectif, nous avons exprimé de façon constitutive chez Arabidopsis thaliana le gène du blé TaVRN2. Les plantes transgéniques obtenues n'ont montré aucune altération de leur morphologie, mais leur date de floraison a été considérablement retardée par rapport aux plantes contrôles. Ces résultats indiquent que TaVRN2, bien que n'ayant pas d'orthologue connu chez les Brassicaceae, agit comme un répresseur de la floraison chez ces espèces. Des études sur la tolérance au gel ont révélé que les plantes transgéniques ont une tolérance au gel plus élevée que les plantes contrôles. Dans l'ensemble, ces données suggèrent que le gène TaVRN2 pourrait moduler des voies de régulation qui régissent le temps de floraison et l'induction de la tolérance au gel. Des études d'expression de la transcription indiquent que l'expression de TaVRN-A1 et TaFT-A1 chez le blé d'hiver est induite par la vernalisation. En utilisant la méthode d'immunoprécipitation sur la chromatine (IPCh ou ChIP) nous avons démontré que cette régulation à la hausse est associée à une augmentation du niveau de méthylation de l'histone-3-lysine-4-triméthylation (H3K4Me3) impliquée dans la régulation épigénétique alors qu'on ne note pas de changement du niveau de l'histone-3-lysine-27-triméthylation (H3K27Me3) à la région promotrice de TaVRN-A1 et TaFT1-A1. Cependant pour les deux marqueurs, leur niveau d'expression est maintenu comparable à la région promotrice TaVRN-B2. H3K4me3 est un marqueur d'activation de la transcription alors que H3K27Me3 est un marqueur de répression de la transcription. Des résultats d'analyses de séquences de promoteur de chaque gène obtenus avec l'utilisation d'outils bioinformatiques révèlent la présence d'éléments cis ciblés par des facteurs de transcription communs chez les espèces de plante qui exigent la vernalisation pour fleurir. Ces données suggèrent l'implication de ces éléments cis ciblés durant la vernalisation. Ces promoteurs possèdent également des éléments de réponse au Polycomb et au Trithorax qui lient les groupes de protéines Polycomb et Trithorax, pour maintenir les états de transcription réprimé ou actif des gènes de développement importants. L'ensemble de ces données indique que la transition de la floraison induite par la vernalisation chez le blé est régulée de façon épigénétique et est médiée par la méthylation des histones au niveau des promoteurs de TaVRN1, TaFT1 et TaVRN2. Ceci peut représenter une partie de la mémoire cellulaire de vernalisation chez le blé. Afin d'étudier l'impact de l'absence du gène VRN1 sur des gènes associés à la floraison, nous avons utilisé une approche génomique basée sur une analyse du transcriptome des plantes d'un mutant mvp-1 (maintained vegetative phase) contenant une délétion de gènes incluant VRN1. Les résultats de cette analyse indiquent que cette délétion conduit à la régulation de 368 gènes. Parmi les gènes hautement régulés, on compte ceux associés à la réponse aux pathogènes (PR) et aux jasmonates. Ces résultats suggèrent que cette délétion dans les plantes du mutant mvp-1 causant l'absence de floraison est associée à l'activation de la réponse moléculaire du mécanisme de défense modulée par la biosynthèse de l'hormone méthyl jasmonate (MeJA). Pour confirmer l'implication du MeJA dans la floraison, nous avons mesuré la teneur en MeJA dans les plantes homozygotes du mutant mvp-1 et des plantes de type sauvage. Le contenu en MeJA était six fois plus élevé dans les plantes du mutant mvp-1 en comparaison du contenu du MeJA dans les plantes de type sauvage. Un traitement avec 150 µM de MeJA sur du blé de printemps hexaploïde (cv Manitou) montre un retard de floraison de deux semaines et une croissance réduite des plantes traitées. Ce retard dans la floraison était associé à la répression significative du gène Triticum aestivum FLOWERING LOCUS T like 1 (TaFT1) supportant ainsi le rôle possible du MeJA dans le contrôle de la floraison. Les résultats obtenus dans le cadre de ces travaux de doctorat montrent l'importance du rôle des gènes VRN1, VRN2 et VRN3 ainsi que de l'hormone MeJA dans la mise en place des mécanismes d'adaptation pour mieux synchroniser la floraison et le développement du blé face aux changements environnementaux. En perspective, cette étude offre des avenues prometteuses afin d'améliorer des stratégies agricoles et la productivité céréalière. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Acclimatation au froid, Biopuce, Blé, Épigénétique, Facteurs de transcription, Floraison, Immunoprécipitation de chromatine, Mutant, Photopériode, Transgénique, Tolérance au gel, Vernalisation.

La diversité génétique est à l’origine de l'évolution et de l'adaptation des pop. et des espèces. Dans les agrosystèmes, la div. gén. intra-population est d'une importance majeure : d'une part, elle peut fournir un effet tampon contre les variations climatiquesinterannuelles et les stress biotiques, et d'autre part cette div. peut permettre l’adaptation locale des pop., du fait de leur évolution sous l’effet des pressions sélectives spécifiques aux conditions locales de la région, particulièrement dans le cas d’uneintrod. dans un nouvel environnement. En raison de son importance socio-économique et de son aire de culture étendue, le blé a été choisi comme espèce modèle dans cette étude, en se focalisant sur l’étude de la précocité de de floraison, un caractère adaptatif majeur qui permet au blé de croître sur une large gamme de conditions écologiques et climatiques. Ce projet de thèse a pour objet l’analyse de l'impact de la diversité int.-pop. sur la réponse adaptative à court terme de pop. soumises à des conditions agro-climatiques contrastées, ce par l'étude des variations génétiques, épigénétiques et phénotypiques.L'absence de marqueurs épig. disponible pendant la thèse a conduit à développer 2 études complémentaires. Dans une 1ère partie, sept var. pays. (pop. conservées à la ferme) et une variété moderne ont été distribuées et cultivées pendant trois ans dans sept fermes localisées dans trois pays d'Europe, puis étudiées pour leur réponse aux différentes conditions agro-climatiques, sous l’angle de leurs variations phénotypiques et génotypiques. Dans une 2nde partie, l'effet de la vernalisation sur le profil de méth. de l'ADN du gène VRN-A1 a été étudié, constituant une 1ère étape vers le développement de marqueurs épig. Les résultats de la 1ère partie de l'étude ont révélé que l'histoire de la conservation des var. pays. a fortement influencé leur div. gén. et leur structure génétique fine. Les var. pays. conservées ex situ montrent une faible div. gén., avec une struct. génétique simple. Les var. pays. et les mélanges conservés in situ révèlent une div. gén. plus élevée, avec une struct. génétique complexe. Une différenc. spatio-temporelle génétique et phénotypique a été observée, en relation avec le niveau de diversité initial et avec la complexité de structure des var. pays. Les variétés traditionnelles se différencient plus nettement que les var. modernes, ce qui plaide en faveur de utilisation dans des systèmes d'agriculture biologique et à bas intrants. De façon intéressante, une différenc. phénotypique significative a été observée pour les var. qui présentaient une div. gén. initiale très faible, ce qui suggère que d’autres facteurs, par exemple épig., pourraient intervenir dans les adaptations misesen évidence. La 2nde partie a permis de mettre en évidence un profil de méth. intéressant de l’ADN de VRN-A1 : sur plantes non-vernalisées, ce gène présente des niveaux élevés de méth. dans la partie centrale du gène, mais pas en début et fin de gène. De plus, une partie du 1er intron montre une augmentation significative du niveau de méth. de l'ADN suite au traitement au froid. Ce changement de méth. est positivement associé au niveau d'expression du gène. Si la compréhension du rôle de cette méth. sur la régulation de VRN-A1 nécessite des analyses complémentaires, cette étude a permis de caractériser les modifications de méth. de VRN-A1 en réponse au froid et constitue une 1ère étape vers l’identification de possibles epiallèles dans nos pop. et fournit une base à la construction de marqueurs permettant de suivre la variabilité épig. dans différentes pop. En conclusion, cette étude apporte des connaissances utiles pour une meilleure compréhension de l’origine et l'évolution de la div. gén. présente dans les var. pays. Elles permettront de dvper des méthodes de conservation et desélection à la ferme, en tenant compte de l'importance de la div. int.-pop., afin de rép. aux contraintes posées par l'agriculture bio. / Biodiversity provides the raw material for evolution and adaptation of populations and species. In agricultural biodiversity, the within-population genetic diversity is of major importance. On one hand, it can provide a buffering effect against the year-to-year variation of climate or biotic pressures and on the other hand diversity serves as a resource for the population to respond to selective pressures due to specific local conditions, thus allowing for local adaptation, particularly in the case where a population is introduced into a new location. Due to its wide geographic distribution indicating a high adaptiveotential and its socio-economic importance, wheat was chosen as model crop in this study. Flowering time is a major adaptive trait which has allows wheat to grow over a wide range of ecological and climatic conditions. This PhD study was designed to gain insights about the influence of within population diversity on the short term response of populations to contrasting agro-climatic conditions by studying the genetic, epigenetic and phenotypic variation. But due to the lack of prior existence of epigenetic markers, this thesis study is divided of two parts: In the first part, European wheat populations coming from a set of seven farmer and one modern varieties, each of which was grown on seven farms (distributed across Europe) for three years, were used to study their short term response to contrasting agro-climatic conditions in Europe by analysing their phenotypic and genotypic variations. For the second part the effect of vernalization on the DNA methylation profile of theVRN-A1 gene in winter wheat was studied as a first step towards the development for the epigenetic marker in this gene.The results from the first part of the study revealed that conservation history of these farmer varieties strongly influenced the genetic diversity and fine genetic structure. Ex situ conserved farmer varieties showed low genetic diversity and simpler structure whereas in situ conserved farmer varieties and mixtures revealed higher level of genetic diversity and complex genetic structure. Genetic and phenotypic spatio-temporal differentiation depending upon the level of diversity and structural complexity of the farmer variety was observed. The traditional varieties tend to become more differentiated than the modern variety arguing in favour of use of these diverse traditional (farmer) varieties in organic and low input agriculture systems. Interestingly, a significant phenotypic differentiation for varieties with very low genetic diversity has also been observed in this study, which gives indication of a possible role of epigenetic variation in the process of evolution.From the second part of the study (effect of vernalization on the DNA methylation profile of the VRN-A1 gene), it was found that in addition to the detection of gene body methylation across the VRN-A1 gene, we identified a region within intron 1 that shows significant increase in DNA methylation in response to vernalization treatment that is positively correlated with the gene expression. Although the role of this shift in gene regulation is still unclear due to time limitations in the thesis and the small number of genotypes analysed, this study will provide a good material towards future identification of new epialleles and the development of epigenetic markers to study the epigenetic variability of these populations.This study at large provides useful knowledge on the understanding of farmers' varieties evolutionary response to be used in the development of different breeding and conservation approaches for organic agriculture, taking into consideration of the importance of within population diversity, to satisfactorily address the problems of organic agriculture.

La betterave sucrière est une plante bisannuelle dont le besoin de vernalisation est absolu. Ce processus correspond à l'acquisition de l'aptitude à la montaison et à la floraison et résulte d'une exposition prolongée à de basses températures. La durée de froid requise pour induire la montaison puis la floraison varie suivant les génotypes et reflète leur tolérance à la montaison, qui constitue donc un caractère agronomique essentiel. Cette thèse visait à (i) mettre en évidence un éventuel contrôle épigénétique (méthylation ADN) de l'induction de la montaison chez des génotypes de betterave sucrière résistants ou sensibles à la montaison, (ii) identifier les séquences ciblées par des remaniements de méthylation de l'ADN et d'expression associés, et (iii) caractériser certaines séquences candidates en vue de leur utilisation comme marqueurs de la montaison. Nos travaux ont montré que l'amplitude et la cinétique des variations de méthylation de l'ADN observées au cours de la vernalisation semblent être des éléments critiques de l'induction et de la tolérance à la montaison. Par une approche ciblée, des séquences dont la méthylation de l'ADN est remaniée ont été identifiées. L'implication dans la transition florale de deux BvRNMT (RNA METHYLTRANSFERASES) et de la méthylation des ARN, tels que l'ARNm de BvFL1, un répresseur floral, a ainsi été mise en évidence chez la betterave sucrière. Enfin, grâce à une approche génomique, un réseau de gènes intégratif incluant la réponse à l'environnement, la signalisation hormonale et l'induction de la floraison a été identifié. La cinétique d'activation de ces gènes définirait le niveau de tolérance à la montaison des différents génotypes de betterave sucrière.

Onset of flowering is a major transition in the plant life cycle and is controlled by environmental factors including photoperiod, light quality and temperature. Prevalence of controlling factors depends on species, hence physiological models were selected for their strong requirement for one or another environmental cue. Among Brassicaceae, Sinapis alba was intensively studied for its strong response to photoperiod while molecular-genetic analyses of Arabidopsis thaliana disclosed complex interactions between pathways inducing flowering in response to photoperiod and other environmental cues, such as vernalization. We were therefore interested in studying the vernalization process in S. alba and its interactions with the previously characterized floral response to long days (LDs). Two-week old seedlings grown in non-inductive short days (SDs) were vernalized at 7°C for increasing durations and a strong promotive effect of vernalization was observed. In contrast to the common view of vernalization as a preliminary step bringing the competence to flower, we observed that vernalization had a direct inductive effect on flowering: floral buds were initiated during cold-exposure. Floral integrator genes SaMADSA (homologous to SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CO 1) and SaLEAFY were up-regulated in the shoot apex after 3-4 weeks of vernalization. To monitor the vernalization process at the molecular level, we isolated SaFLC which, based on sequence analysis, expression patterns and complementation test, appeared as orthologous to FLOWERING LOCUS C. Down-regulation of SaFLC by vernalization was fast since transcript level was already very low after one week of vernalization, but stability of the repression required longer exposure to cold. To test the physiological significance of these observations, we studied the floral response to 16-h LDs after unstable and stable repression of SaFLC. We observed that one week of vernalization which was sufficient for SaFLC repression but not for maintenance of the silenced state - increased the flowering response of S. alba to LDs when the LDs just followed the cold treatment. This effect was lost after two weeks post-vernalization. In contrast, the promotive effect of longer vernalization on flowering response to LDs was maintained post-vernalization. These results suggested that vernalization not only works when plants experience long exposure to cold in winter: short cold periods might stimulate flowering of LD-plants if occurring when photoperiod is increasing, i.e. in spring.