Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2012-10-16T07:13:18Z (GMT). No. of bitstreams: 0

Orientador: Nelson Eduardo Duran Caballero / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Quimica / Made available in DSpace on 2018-07-27T06:44:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Bromberg_Natalia_M.pdf: 3622328 bytes, checksum: 9b72c2330df993f4a2f0dfe082c29828 (MD5) Previous issue date: 2000 / Mestrado

Orientador : Nelson E. Duran Caballero / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Quimica / Made available in DSpace on 2018-07-14T03:49:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 RiverosGonzales_RaulAlberto_D.pdf: 2661099 bytes, checksum: 084b29ad42d1ea64e79daa6daca580ed (MD5) Previous issue date: 1989 / Doutorado

Orientador : Nelson E. Duran Caballero / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Quimica / Made available in DSpace on 2018-07-17T22:22:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 RiverosGonzalez_RaulAlberto_M.pdf: 2735291 bytes, checksum: 31a08518aeaf853ca860dce74296c416 (MD5) Previous issue date: 1986 / Mestrado

Chromobacterium violaceum é uma bactéria de vida livre, móvel, que habita fontes de água e solos pobres de regiões tropicais e subtropicais. Nestes habitats, em que a concentração de fosfato é baixa, o regulon PHO encontra-se ativado. No laboratório, esta bactéria é capaz de crescer razoavelmente bem, apesar da limitação de fosfato, atingindo um rendimento celular similar ao observado na abundância deste nutriente. Mutações nos genes pstS, phoU, phoA1 e phoA2 foram construídas. As mutações pstS e phoU não causaram qualquer alteração no padrão de expressão da fosfatase alcalina, sugerindo que estes genes não participam da repressão dos genes de PHO. Porém, o mutante pstS mostrou-se deficiente na captação de Pi. Os mutantes phoA1 e phoA2 apresentaram, cada um, severa redução na atividade da fosfatase alcalina. Foi investigada a possibilidade de PhoA1 e PhoA2 formarem uma proteína heterodimérica. Fusões transcricionais entre phoU e phoB ao gene lacZ, revelaram que estes genes respondem à carência de Pi. Surpreendentemente, C. violaceum se mostrou pouco resistente a estresses ambientais. / Chromobacterium violaceum is a free-living, mobile bacterium that inhabits water sources and soils of tropical and subtropical regions, where the phosphate concentration is low. The PHO regulon is activated in response to low phosphate concentration in the environment. Surprisingly, the growth yield of C. violaceum under phosphate excess or under phosphate limitation is very similar. Mutations in pstS, phoU, phoA1 and phoA2 genes were constructed. The expression of alklaine phosphatase was not affected by the phoU and pstS mutations, suggesting that these genes do not participate in the repression of the PHO regulon. However, the pstS mutant was deficient in the uptake of Pi. The phoA1 and phoA2 mutants presented each one a severe reduction in alkaline phosphatase activity. The hypothesis that PhoA1 and PhoA2 form a heterodimeric protein was investigated. Transcriptional fusions between the promoters of phoB and phoU to lacZ showed that these genes respond to Pi starvation. Stress resistance assays showed that C. violaceum is generally sensitive to environmental stresses.

As proteínas fosfatases desempenham um papel fundamental na modificação pós-traducional reversível de proteínas por fosforilação, ao atuarem na remoção do grupo fosforil estável de resíduos de serina, treonina e tirosina. Embora predominem em eucariotos, as serina/treonina fosfatases (STPs) também existem em bactérias, nas quais atuam controlando diversos aspectos fisiológicos e de virulência. Neste trabalho investigamos o papel das STPs na virulência e fisiologia de Chromobacterium violaceum, uma ?-proteobactéria que atua como um patógeno ocasional de humanos e é amplamente encontrada em água e solos de regiões tropicais e subtropicais. Análises in silico revelaram a presença de quatro STPs no genoma de C. violaceum, sendo que duas possuem apenas o domínio de fosfatase (CV_0881 e CV_3848) e duas possuem um domínio adicional de regulador de resposta (CV_2644 e CV_3505). Mutantes nulos foram construídos para as quatro STPs e todas estas linhagens apresentaram crescimento semelhante ao da linhagem selvagem em meio rico e meio mínimo. As linhagens mutantes ?0881, ?2644 e ?3505 não apresentaram alteração de virulência em camundongos. Os mutantes ?2644 e ?3505 apresentaram menor formação de biofilme, o que sugere papel dessas fosfatases neste processo. Uma caracterização mais aprofundada da linhagem ?3848 por diferentes técnicas de microscopia revelou que este mutante apresenta células de tamanho diminuído, irregularidades no envelope celular e problemas na distribuição do DNA. Estes dados sugerem que CV_3848 tem papel em divisão celular, condensação do material genético e manutenção da parede celular. Nos ensaios de virulência o mutante ?3848 mostrou menor capacidade de causar morte e manter-se no fígado de camundongos, indicando que a STP CV_3848 é importante na patogenicidade de C. violaceum. / Protein phosphatases play a key role in reversible post-translational modification of proteins through phosphorylation since they act removing the stable phosphoryl group of serine, threonine and tyrosine residues. Although dominant in eukaryotes, the serine/threonine phosphatases (STPs) also exist in bacteria, in which they act by controlling various physiological and virulence traits. In this work we investigated the role of STPs on the virulence and physiology of Chromobacterium violaceum, a ?-proteobacterium that occasionally acts as a pathogen of humans and it is widely found in water and soil of tropical and subtropical regions. In silico analyzes revealed the presence of four STPs in the genome of C. violaceum, two of which have only the phosphatase domain (CV_0881 and CV_3848) and two that possess an additional domain of response regulator (CV_2644 and CV_3505). Null mutants were constructed for the four STPs and all of them showed similar growth to the wild type strain on rich and minimal medium. The mutant strains ?0881, ?2644 and ?3505 did not show any change in virulence in mice. The ?2644 and ?3505 mutants had lower biofilm formation, suggesting the role of these phosphatases in this process. Further characterization of ?3848 by different microscopy techniques revealed that this mutant presents cells of diminished size, irregularities in the cellular envelope and problem on the DNA distribution. These data suggest that CV_3848 has role in cell division, condensation of the genetic material and cell wall maintenance. In virulence assays the ?3848 mutant showed a lower ability to cause death and to remain in the liver of mice, indicating that the STP CV_3848 is important for the pathogenicity of C. violaceum.

As proteínas fosfatases desempenham um papel fundamental na modificação pós-traducional reversível de proteínas por fosforilação, ao atuarem na remoção do grupo fosforil estável de resíduos de serina, treonina e tirosina. Embora predominem em eucariotos, as serina/treonina fosfatases (STPs) também existem em bactérias, nas quais atuam controlando diversos aspectos fisiológicos e de virulência. Neste trabalho investigamos o papel das STPs na virulência e fisiologia de Chromobacterium violaceum, uma ?-proteobactéria que atua como um patógeno ocasional de humanos e é amplamente encontrada em água e solos de regiões tropicais e subtropicais. Análises in silico revelaram a presença de quatro STPs no genoma de C. violaceum, sendo que duas possuem apenas o domínio de fosfatase (CV_0881 e CV_3848) e duas possuem um domínio adicional de regulador de resposta (CV_2644 e CV_3505). Mutantes nulos foram construídos para as quatro STPs e todas estas linhagens apresentaram crescimento semelhante ao da linhagem selvagem em meio rico e meio mínimo. As linhagens mutantes ?0881, ?2644 e ?3505 não apresentaram alteração de virulência em camundongos. Os mutantes ?2644 e ?3505 apresentaram menor formação de biofilme, o que sugere papel dessas fosfatases neste processo. Uma caracterização mais aprofundada da linhagem ?3848 por diferentes técnicas de microscopia revelou que este mutante apresenta células de tamanho diminuído, irregularidades no envelope celular e problemas na distribuição do DNA. Estes dados sugerem que CV_3848 tem papel em divisão celular, condensação do material genético e manutenção da parede celular. Nos ensaios de virulência o mutante ?3848 mostrou menor capacidade de causar morte e manter-se no fígado de camundongos, indicando que a STP CV_3848 é importante na patogenicidade de C. violaceum. / Protein phosphatases play a key role in reversible post-translational modification of proteins through phosphorylation since they act removing the stable phosphoryl group of serine, threonine and tyrosine residues. Although dominant in eukaryotes, the serine/threonine phosphatases (STPs) also exist in bacteria, in which they act by controlling various physiological and virulence traits. In this work we investigated the role of STPs on the virulence and physiology of Chromobacterium violaceum, a ?-proteobacterium that occasionally acts as a pathogen of humans and it is widely found in water and soil of tropical and subtropical regions. In silico analyzes revealed the presence of four STPs in the genome of C. violaceum, two of which have only the phosphatase domain (CV_0881 and CV_3848) and two that possess an additional domain of response regulator (CV_2644 and CV_3505). Null mutants were constructed for the four STPs and all of them showed similar growth to the wild type strain on rich and minimal medium. The mutant strains ?0881, ?2644 and ?3505 did not show any change in virulence in mice. The ?2644 and ?3505 mutants had lower biofilm formation, suggesting the role of these phosphatases in this process. Further characterization of ?3848 by different microscopy techniques revealed that this mutant presents cells of diminished size, irregularities in the cellular envelope and problem on the DNA distribution. These data suggest that CV_3848 has role in cell division, condensation of the genetic material and cell wall maintenance. In virulence assays the ?3848 mutant showed a lower ability to cause death and to remain in the liver of mice, indicating that the STP CV_3848 is important for the pathogenicity of C. violaceum.

Chromobacterium violaceum é uma bactéria de vida livre, móvel, que habita fontes de água e solos pobres de regiões tropicais e subtropicais. Nestes habitats, em que a concentração de fosfato é baixa, o regulon PHO encontra-se ativado. No laboratório, esta bactéria é capaz de crescer razoavelmente bem, apesar da limitação de fosfato, atingindo um rendimento celular similar ao observado na abundância deste nutriente. Mutações nos genes pstS, phoU, phoA1 e phoA2 foram construídas. As mutações pstS e phoU não causaram qualquer alteração no padrão de expressão da fosfatase alcalina, sugerindo que estes genes não participam da repressão dos genes de PHO. Porém, o mutante pstS mostrou-se deficiente na captação de Pi. Os mutantes phoA1 e phoA2 apresentaram, cada um, severa redução na atividade da fosfatase alcalina. Foi investigada a possibilidade de PhoA1 e PhoA2 formarem uma proteína heterodimérica. Fusões transcricionais entre phoU e phoB ao gene lacZ, revelaram que estes genes respondem à carência de Pi. Surpreendentemente, C. violaceum se mostrou pouco resistente a estresses ambientais. / Chromobacterium violaceum is a free-living, mobile bacterium that inhabits water sources and soils of tropical and subtropical regions, where the phosphate concentration is low. The PHO regulon is activated in response to low phosphate concentration in the environment. Surprisingly, the growth yield of C. violaceum under phosphate excess or under phosphate limitation is very similar. Mutations in pstS, phoU, phoA1 and phoA2 genes were constructed. The expression of alklaine phosphatase was not affected by the phoU and pstS mutations, suggesting that these genes do not participate in the repression of the PHO regulon. However, the pstS mutant was deficient in the uptake of Pi. The phoA1 and phoA2 mutants presented each one a severe reduction in alkaline phosphatase activity. The hypothesis that PhoA1 and PhoA2 form a heterodimeric protein was investigated. Transcriptional fusions between the promoters of phoB and phoU to lacZ showed that these genes respond to Pi starvation. Stress resistance assays showed that C. violaceum is generally sensitive to environmental stresses.

Orientador: Nora Marcela Haun Quiros / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-20T23:09:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Melo_PatriciadaSilva_M.pdf: 29401299 bytes, checksum: 332e5428465f8888ffa7ea12b727bca7 (MD5) Previous issue date: 1996 / Resumo: Chromobacterium violaceum é um microrganismo de larga distribuição podendo ser encontrado no solo, água e no Rio Negro (Amazônia). Esta bactéria Gram negativa produz um pigmento denominado violaceína, que apresenta alguma atividade tripanocida. Como a violaceína é produzida em pequena quantidade o propósito inicial desse estudo foi investigar cepas diferentes provenientes do Rio Negro que produzissem a violaceína em um maior rendimento. Um sedimento coletado do Rio Negro foi inoculado em caldo simples, 30°C/24 h e posteriormente inoculado através de estrias em ágar nutriente. Somente três tipos de colônias - branca, amarela e vermelha cresceram (todas bactérias Gram negativas). Após dois dias de incubação a colônia branca adquiriu tonalidade violeta indicando a produção de violaceína. Análises espectrais, UV/Vis, IV (Infra Vermelho) e RMN (Ressonância Magnética Nuclear), confirmaram a presença da violaceína. Para determinar as características de C. violaceum e sua variante não pigmentada, testes laboratoriais foram realizados. A coloração pelo Gram, motilidade e estudos bioquímicos e de crescimento indicaram que as colônias branca/violeta e amarela eram C. violaceum. A colônia vermelha era Serratia marcescens (Chromobacterium prodigiosum) a qual produz o pigmento com ação antibiótica chamado prodigiosina. Os dados espectrais (UV/Vis, IV e RMN) reforçam essa conclusão. O pequeno número de bactérias isoladas na amostra confirma a alta atividade antibiótica dos pigmentos produzidos pela C. violaceum (violaceína) e S. marcescens (prodigiosina) na água do Rio Negro. A quimioterapia da doença de Chagas permanece um problema sem solução, e a pesquisa para drogas alternativas está em andamento. A terapia atual dessa doença é insatisfatória e somente o Nifurtimox está em uso, com diversas restrições na administração em pacientes crônicos, devido aos seus efeitos colaterais. Desse modo é de importância fundamental a pesquisa de novas drogas com mecanismos de ação diferentes do Nifurtimox com o objetivo de evitar esses problemas. A violaceína e a prodigiosina extraída da C. violaceum e da S. marcescens, respectivamente apresentam atividade tripanocida, a primeira possui um ID50. de 46 mM e a segunda, menos que 100 mM. A avaliação da titotoxicidade foi realizada através da inibição da síntese de DNA, redução do MTT e captação do Vermelho Neutro (VN), utilizada em células de hamster chinês V-79 (M8). No teste de viabilidade através da redução do MTT o ID50 foi de 6 mM para a prodigiosina, 7mM para a violaceína e 500 mM para o Nifurtimox, no teste do VN o ID50 para a prodigiosina foi de 1,0 mM, 12 mM para a violaceína e 250 mM para o Nifurtimox. A prodigiosina resultou em um valor de ID50 de 20 mM, o Nifurtimox de 100 mM e a violaceína de 5 mM obtidos através da inibição da síntese de DNA / Abstract: Chromobacterium violaceum is a widely distributed microorganism. It is in soil, water and in the Rio Negro (Amazon). This Gram negative rod shaped bacteria produces the pigment violacein, which has shown trypanocide activity. Since violacein is produced in small quantity, the inicial purpose of this study was to investigate differents strains of bacteria from Rio Negro which may produce violacein in highest yield. Sediment was collected from Rio Negro, inoculated in simple broth, 30°C /24 h and striated in simple agar. Only three kinds of colonies - white, yellow, and red grew (rod Gram negative bacteria). After two days the white strain changed to violet indicating violacein production. Spectral analysis, UV/Vis (UV/Visible), IR (Infra Red) and NMR (Nuclear Ressonance Magnetic), confirmed the presence of violacein. In order to determine of C. violaceum characteristics and its non pigmented variants, laboratories tests were undertaken. Gram'stainning, motility, morphological, growth and biochemical studies indicated that the white, yellow and violet colonies were C. Violaceum. The red one was Serratia marcescens (Chromobacterium prodigiosum) which produces the red pigment antibiotic prodigiosin. The spectral data (UV/Vis, IR and NMR) reinforce this conclusion. The low number of microorganisms isolated in the sample confirm the high antibiotic activity of the pigments produced by C. Violaceum (violacein) and Serratia marcescens (prodigiosin) in the Rio Negro water. The chemotherapy of Chagas' disease remains an unsolved problem, and the search for alternative drugs is in course. Current therapy of this disease is unsatisfactory and only Nifurtimox is in general used, with several restricted applicability for chronic patients, as well being deleterious effects. Thus, it is of fundamental importance to search for new drugs with different mechanism of action of Nifurtimox in order to avoid these problems. We have found a potential compounds for the treatment of Chagas' disease, the pigments extracted from S. marcescens and C. violaceum, respectively prodigiosin (ID50 of less 100 mM) and violacein (ID50 of 46 mM). Evaluation ID50 through DNA synthesis inhibition, soluble tetrazolium/formazan (MTT) and Neutral Red (NR) tests on V-79 Chinese hamster (M-8) cells were carried out. Using MTT viability test, ID50 was 6 mM for prodigiosin, 7 mM for violacein and 500 mM for Nifurtimox, and for NR test the ID50 was 1.0 mM, 12 mM and 250 mM for prodigiosin, violacein and Nifurtimox, respectively. Prodigiosin resulted in a ID50 value of 20 mM, for violacein of 5 mM and for Nifurtimox of 300 mM obtained through DNA synthesis inhibition / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Ciências Biológicas

Orientador: Nelson Eduardo Duran Caballero / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Quimica / Made available in DSpace on 2018-07-21T11:03:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Rettori_Daniel_M.pdf: 1599329 bytes, checksum: aed98aebab06459e3c12b58b794e9dae (MD5) Previous issue date: 1996 / Mestrado