Les progrès technologiques dans l'industrie de la viande ont des répercussions considérables sur les agents pathogènes de ces environnements. Parmi ceux-ci, Streptococcus suis occupe une place prédominante dans l’industrie porcine. En effet, S. suis, colonisateur naturel des voies respiratoires et digestives du porc, peut infecter son hôte en provoquant des méningites, septicémies, endocardites, arthrites ou pneumonies. De surcroît, S. suis peut également infecter l’humain en provoquant majoritairement des méningites et septicémies, et a notamment été la cause de deux épidémies en Chine en 1998 et 2005. La pathogenèse des infections à S. suis demeure partiellement connue à l’heure actuelle, rendant difficile le contrôle des infections. Il est par conséquent essentiel de caractériser les facteurs de virulence chez S. suis puisqu'ils pourraient représenter des cibles d’intérêt pour des applications préventives ou thérapeutiques. Ce projet de doctorat consiste donc en la caractérisation fonctionnelle de facteurs de virulence chez S. suis. Dans un premier temps, la capacité de S. suis à moduler son potentiel pro-inflammatoire en présence de concentrations sous-inhibitrices d'amoxicilline a été mise en évidence. Dans un second temps, la caractérisation plus avancée de la hyaluronate lyase de S. suis a permis de démontrer que son activité ne contribue pas à la virulence de la bactérie étant donné son absence au sein de souches les plus virulentes, mais que les interactions avec l'acide hyaluronique pourraient moduler la virulence de S. suis. Par la suite, l'étude fonctionnelle d’une DNase de S. suis a permis de démontrer son implication comme facteur de virulence et suggère son intérêt dans le développement de vaccins. Finalement, le dernier objectif du projet a permis la mise en évidence de la production de microvésicules fortement immunogéniques par S. suis. La présence de facteurs de virulence dans leur contenu protéique représente un élément encourageant dans le développement de vaccins contre l'agent pathogène. Ce projet a donc permis d'élargir les connaissances sur le potentiel néfaste de l'utilisation des antibiotiques à faible concentration dans l'industrie porcine, sur le rôle des activités hyaluronate lyase et DNase dans la virulence de S. suis, et de découvrir un nouveau mécanisme impliqué dans la virulence de la bactérie par le biais des microvésicules. / Technological progress in the meat industry has a substantial impact on pathogens within these environments. Among these pathogens, Streptococcus suis is of utmost importance in the swine industry. S. suis, natural colonizer of the respiratory and digestive tracts of porks, can infect its host causing mainly meningitis and septicemia as well as endocarditis, arthritis and pneumonia. Furthermore, S. suis can infect humans causing mainly meningitis and septicemia, and was the cause of two major outbreaks in China in 1998 and 2005. The pathogenesis of S. suis infections remains partially understood, making the control of infections challenging. Consequently, it is of utmost importance to characterize virulence factors that could represent targets of interest for preventive or therapeutic applications. This project focused on the functional charaterization of virulence factors produced by S. suis. First, the ability of S. suis to modulate its pro-inflammatory potential in the presence of sub-inhibitory concentrations of amoxicillin was demonstrated. Then, a further characterization of S. suis hyaluronate lyase brought evidence that this activity does not contribute to the bacterium's virulence since it is absent in most virulent strains. However, interactions with hyaluronic acid could modulate S. suis virulence. The functional study of S. suis DNase showed its implication as a virulence factor and suggested its interest in vaccine development. Finally, the last objective of this project lead to the discovery of the production of highly immunogenic microvesicles by S. suis. The presence of major virulence factors associated with these structures also represents an exciting fact for the development of vaccines against S. suis. This project allowed to expand the knowledge on the noxious potential of the use of low concentrations of antibiotics in the swine industry, on the role of hyaluronate lyase and DNase activities in S. suis virulence as well as on the production of microvesicles by S. suis that represents a new virulence mechanism.

De 50 à 100 millions de cas de maladie de dengue sont recensés chaque année dans le monde. Le virus de la dengue présente aujourd’hui un problème de santé publique avec son émergence en Europe et particulièrement en France. L’infection par le virus peut être asymptomatique ou être responsable de trois pathologies: l’une avec des symptômes grippaux (DF), une autre avec des hémorragies modérées (DHF) et une dernière avec des hémorragies sévères entraînant un syndrome de choc (DSS).Les facteurs de l’hôte jouent un rôle important dans le développement de formes sévères mais les facteurs viraux impliqués restent peu décrits. Le but de ce travail de thèse était de mieux comprendre ces facteurs viraux au travers de l’étude des dynamiques de circulation de souches de dengue 3 génotype III en Afrique et de la caractérisation de trois souches de dengue de sérotype I du Cambodge. Ce travail nous a permis de mettre en évidence la circulation de variants pendant les épidémies, permettant de supposer que la présence de variants permet une meilleure dissémination, ainsi que des caractéristiques génotypiques et phénotypiques particulières in vitro aux souches associées aux formes hémorragiques et aux formes avec syndrome de choc chez l’homme. Ces travaux ont été complétés par le développement d’un système original de détection du virus de la dengue et des autres virus du genre Flavivirus. Ce travail de thèse a permis d’identifier de potentiels facteurs de virulence propres au virus, ouvrant la voie à la recherche sur le rôle de certaines protéines virales dans la pathogénicité. / From 50 to 100 million cases of dengue illness occurred every year in the world. Today, dengue virus is a public health problem with its emergence in Europe, particularly in France. DENV infection can be asymptomatic or be responsible for three distinct pathologies: one with flu-like symptoms (DF), another with moderate hemorrhage (DHF) and the last one with severe bleeding leading to shock syndrome (DSS). Host factors have an important role in the development of severe forms but implicated viral virulence factors stay not well described. The aim of this research work was to better understand these viral factors through study of dengue serotype 3 genotype III dynamics of circulation in Africa and through the characterization of three dengue serotype 1 strains in Cambodia. This work highlighted the circulation of variants during epidemics, allowing us to suppose that the presence of variants permits a better dissemination, as well as specific phenotypic and genotypic characteristics in vitro of strains associated with hemorrhagic forms or forms with shock syndrome in humans. These works were completed by the development of an original system of detection of dengue virus and other viruses of genus Flavivirus. This research work allowed identifying potential virulence factor specific to virus, opening the way for research on the role of certain viral proteins in pathogenicity.

Photorhabdus luminescens est une entérobactérie retrouvée en symbiose avec les nématodes du genre Heterorhabditis. Dans les sols, ce complexe némato-bactérien est pathogène d’insectes ravageurs et est utilisé en contrôle biologique. Le nématode pénètre dans l’insecte et libère la bactérie dans l’hémolymphe. Photorhabdus va ensuite se multiplier et secréter divers facteurs de virulence comme des toxines. L’insecte meurt de septicémie puis le nématode et la bactérie vont se nourrir du cadavre. Une fois les ressources épuisées, le complexe némato-bactérien va se reformer et sortir du cadavre à la recherche d’une nouvelle cible. Plusieurs exemples d’hétérogénéité phénotypique ont été décrits chez cette bactérie amenant chacun à la présence de sous-populations dans une culture bactérienne. Cette hétérogénéité phénotypique peut-être causée par des mécanismes épigénétiques et plus précisément par la méthylation de l’ADN. Chez les entérobactéries, la méthyltransférase Dam est très conservée. Elle méthyle les adénines des sites GATC et est impliquée dans la réparation des erreurs lors de la réplication de l’ADN, la régulation du cycle cellulaire mais aussi la régulation de divers gènes. Cette méthyltransférase est en compétition avec certain régulateurs transcriptionnel. Selon qui de la méthyltransférase ou du régulateur se fixera en premier, le gène sera ou non exprimé donnant naissance à deux sous-populations. Cette thèse a pour objectif de mettre en évidence les rôles de la méthyltransférase Dam chez Photorhabdus luminescens. Dans un premier temps, j’ai montré que la surexpression de Dam (Dam+) amène une diminution de la mobilité et du pouvoir pathogène de la bactérie mais à l’inverse augmente sa capacité à former des biofilms. Une analyse transcriptomique (RNAseq) a montré des différentiels d’expression de certains gènes impliqués dans les phénotypes observés. En recombinant la souche de Photorhabdus Dam+ avec les nématodes hôtes, l’effet sur la pathogénicité a été augmenté en comparaison des résultats après injection de la bactérie seule. L’établissement de la symbiose némato-bactérienne avec cette souche Dam+ n’est pas significativement impacté par rapport à la souche sauvage. Enfin l’analyse du méthylome (détection de tous les sites méthylés sur le génome grâce à la technique SMRT) de Photorhabdus dans diverses phases de croissance nous a permis de déterminer que la méthylation par Dam semble être stable aux différents temps de la croissance bactérienne testés chez Photorhabdus. Le méthylome de la souche Dam+ a confirmé l’hypothèse que cette surexpression augmentait le taux de méthylation des sites GATC sur le génome. La comparaison combinée entre le RNAseq et les sites GATC différentiellement méthylés entre la souche contrôle et Dam+ a mis en évidence certains gènes candidats ressortant de ces deux analyses. En effet, certains gènes sont différentiellement exprimés dans les deux souches et ont un différentiel de méthylation au niveau de sites GATC dans leur région promotrice, l’étude détaillée de leur régulation par la méthylation fait maintenant partie des perspectives et permettront peut-être d’expliquer une partie des phénotypes observés chez Photorhabdus luminescens. / Photorhabdus luminescens is an Enterobacteriaceae found in soils in symbiosis with a nematode from the genus Heterorhabditis. This nemato-bacterial complex is highly pathogenic against insect pest crops and so used in biocontrol. The nematode enters into the insect and releases Photorhabdus in the hemolymph of the insect. Photorhabdus multiplies and produces diverse virulence factors as toxins. Insect die from septicemia and both nematodes and bacteria feed on the nutrients in the cadaver. Once nutrients are lacking, the nematodes and the bacteria reassociate and exit from the cadaver to find new insects to infect. Photorhabdus is switching between pathogenic and symbiotic state. This bacterium displays phenotypic heterogeneity as we observe subpopulations coexisting in a same bacterial culture. Phenotypic heterogeneity can be explained by epigenetic mechanisms such as DNA methylation. In Enterobacteriaceae, Dam methyltransferase is broadly distributed. It methylates the adenine of GATC sites. Dam is involved in post-replicative mismatch repair, cell-cycle regulation and also gene transcription regulation. This methyltransferase can be in competition with some transcriptional regulators. Depending on which will bind first on the promoter region, gene will be expressed or not, leading to the rise of two subpopulations. This thesis aims to understand roles of Dam in Photorhabdus luminescens. Overexpression of the methyltransferase leads to a decrease in motility and pathogenicity of Photorhabdus Dam+ strain whereas it increases biofilms formation. A transcriptomic analysis (RNAseq) revealed differential expression of genes involved in the observed phenotypes. Symbiosis establishment does not seem to be strongly impacted in Dam+ strain as the only difference observed when compared to the nematode associated with the control strain is the same as with bacteria alone (a delayed virulence). A methylome analysis was also done (screening of all methylated sites in the genome using SMRT sequencing) in several growth conditions which revealed that DNA methylation is stable over growth kinetics. Dam+ strain methylome analysis confirmed the hypothesis that Dam overexpression increases GATC methylation over the genome. Comparative analysis of methylome and RNAseq experiments between control and Dam+ strains highlighted several common genes. In fact, some genes are differentially expressed between both strains and also have GATC sites differentially methylated in their promoter region. Their transcription regulation by methylation is a future aim and may give some explanation for a part of the phenotypes observed in Photorhabdus luminescens.

Magnaporthe oryzae est un champignon filamenteux responsable de la principale maladie du riz, la pyriculariose. Ce pathosystème est très étudié, notamment dans le but de contribuer à l’identification de facteurs pouvant permettre le développement de résistances efficaces. Si certaines hormones végétales, comme l’acide salycilique, sont requises pour la mise en place des défenses de la plante, d’autres sont impliquées dans des processus développementaux. Parmi elles, les cytokinines (CKs) sont des dérivés d’adénine décrites pour participer à la croissance et la différenciation de l’appareil aérien et racinaire. Elles contribuent à la répartition des nutriments et impactent également la viabilité des cellules, en retardant la senescence ou en induisant la mort cellulaire. Des études précédentes ont montré que les CKs pouvaient perturber la résistance de la plante hôte dans différents pathosystèmes. Chez le riz, les CKs agissent en synergie avec l’acide salicylique pour induire l’expression des gènes marqueurs des défenses. Cependant aucun phénotype de résistance associé aux CKs n’a été observé in planta. Mes travaux montrent qu’un apport exogène de CKs (kinétine, BAP) affecte la résistance du riz à Magnaporthe avant infection, de manière dose dépendante. Le phénotype de résistance observé est corrélé avec une plus forte expression des défenses pendant infection, limitant la pénétration et l’invasion du champignon. Des plantes de riz mutées pour une probable cytokinine UDP-glucosyl transferase (CK-UGT) ont été obtenues. Ces mutants ck-ugt sont affectés dans le métabolisme des CKs et sont également plus résistants à M. oryzae. Hors infection, une plus forte expression des gènes de défense a été mesurée chez les plantes mutantes, confirmant que les CKs endogènes affectent directement ou indirectement les défenses de l’hôte. En parallèle de ces analyses sur la plante, mes travaux ont aussi porté sur le rôle des CKs produites par M.oryzae. En effet, leur rôle dans l’interaction ainsi que la voie de leur biosynthèse chez le champignon n’était pas caractérisé. Conservées au sein des différents organismes, les tRNA-IPT (isopentenyl transferase) sont décrites pour participer à la biosynthèse de CKs. Un seul gène homologue a été identifié chez M. oryzae et nommé CKS1 car sa délétion abolit la production de CKs. Le mutant de Magnaporthe cks1 est moins virulent (pénétration et invasion in planta réduites) que la souche témoin complémentée. Il induit une plus forte accumulation des espèces actives de l’oxygène et une plus forte expression des défenses chez la plante. Les dosages des acides aminés et des sucres pendant infection ont montré que les concentrations de ces nutriments étaient différemment perturbées par la souche déficiente en CKs. Ces résultats suggèrent que les CKs fongiques pourraient être requises pour affecter la répartition des acides aminés et contribuer une accumulation progressive de sucres au cours de l’infection. Ainsi, chez un champignon qui n’induit pas de tumeurs, les CKs pourraient agir comme des effecteurs qui auraient une double fonction d’inhibition des défenses et de drainage des nutriments. Chez les champignons, ces hormones induisent également des réponses physiologiques comme la résistance à certains stress, les processus de nutrition et la reproduction sexuée. Ces effets ont été étudiés chez Magnaporthe dans différentes conditions de croissance in vitro plus ou moins stressantes. Les résultats indiquent que les CKs augmentent la tolérance au stress osmotique et oxydatif et suggèrent qu’elles affecteraient aussi l’absorption des nutriments ainsi que la reproduction sexuée. Comme le gène CKS1 est conservé, cette mutation peut être caractérisée chez d’autres organismes fongiques présentant des modes de vie différents de manière à mieux comprendre le rôle de ces hormones dans les interactions plante-microorganisme mais également au sein des interactions microbiennes. / The blast disease caused by Magnaporthe oryzae is one of the most devastating diseases on rice leading to important yield loss. Plant hormones, like salicylic acid, play a central role in plant resistance establishment. Among these hormones, cytokinins (CKs) are adenine derivatives well described to modulate root/shoot growth and differentiation, cell viability and nutrient distribution. Previous studies have shown that these hormonal compounds can also affect plant host resistance in different pathosystems involving monocot or dicot host plants and microbes (bacteria, oomycetes or fungi). In rice, CKs were described to act synergistically with the salicylic acid pathway to induce defense marker genes expression. However, no resistance phenotype associated with CKs was observed and the way that CKs could act in planta during infection is still unknown. In this work, a resistance phenotype induced by exogenous application of the CK kinetin was characterized and the role of endogenous CKs in rice resistance was investigated by phenotyping plant CK mutants. An exogenous supply of kinetin before infection led to a higher induction of defense marker genes that was associated with limited fungal penetration and invasion, suggesting. However the way CKs affected resistance or susceptibility (or virulence see below) depended on the timing at which they were applied (before or after inoculation). Rice lines mutated for a putative cytokinin- UDP-glycosyl transferase (CK-UGT) were produced. The ck-ugt mutants were more resistant, suggesting that endogenous CKs can also contribute to resistance. Defense marker genes were expressed higher in the absence of infection in the ck-ugt rice mutants, compared to the WT plants. In parallel of these analyses of CK on the plant side, we studied the possible role of CK produced by Magnaporthe. Indeed M.oryzae produces and secretes CKs. However, the way fungal CKs are involved in the rice blast disease development as well as the biosynthesis pathway in M.oryzae were not established. A putative tRNA-IPT (isopentenyl transferase) conserved across organisms was identified in M.oryzae. Mutant analysis of this gene confirmed that this enzyme, thus named CKS1, is required for CK production. Knock-out cks1 fungal mutants were less virulent on rice, affected in penetration and invasion compared to the control complemented strain. They triggered a stronger accumulation of reactive oxygen species and a higher expression of defense marker genes. Aspartate and glutamate, two amino acids important for M.oryzae growth, were differently affected at and around the infected zone by cks1 strain suggesting that fungal CKs could contribute to drain/consume nutrients during infection. Similarly, sugar accumulation was also differently disturbed, indicating that fungal-derived CKs may be required for maintaining a progressive sugar production during host invasion, probably by affecting photosynthesis process. Our results show that fungal CKs, in a non-gall forming fungal pathogen, could act as dual effectors by inhibiting defense and modifying nutrient fluxes. Furthermore, CKs are known to affect some physiological processes in fungi, like stress resistance, nutrition or sexual reproduction. In order to test whether CKs modulate Magnaporthe stress tolerance, the effect of CKs on the mycelial growth in different stressful conditions in vitro was tested. The results indicate that CKs increased osmotic and oxidative stress tolerance and suggest that they also affected nutrient acquisition as well as sexual reproduction. Since the CKS1 gene is highly conserved, the effect of the cks1 mutation could be studied in other fungi showing different lifestyles for improving our knowledge on the role these hormonal compounds play among microbes or in plant-microbe interactions.

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