Seminario de Título entregado a la Universidad de Chile en cumplimiento parcial de los requisitos para optar al Título de Ingeniero en Biotecnología Molecular. / N6-Metiladenosina (m6A) es la modificación química más abundante encontrada en los ARN mensajeros (ARNm) de células eucariontes. Esta modificación regula el metabolismo de los ARNm a diferentes niveles incluidos el corte y empalme de exones, traducción, estabilidad y degradación. Existen tres grupos de proteínas que regulan estos procesos: aquellas que catalizan la adición de la modificación, las proteínas metiltransferasas METTL3 y METTL14, las que remueven la metilación, las desmetilasas FTO y ALKBH5, y finalmente, las que reconocen m6A y actúan como efectoras de esta modificación, las proteínas lectoras YTHDF1,2 y 3. Recientemente se ha descrito la presencia de m6A en el ARN de diferentes virus que replican en el citoplasma, como los virus de la hepatitis C, virus Zika e influenza A, donde la modificación m6A regula la expresión de proteínas virales, estabilidad de los ARN virales (genómicos y mensajeros) y por ende la replicación viral. Sin embargo, se desconoce su rol en la replicación de otros virus de importancia clínica, como el virus respiratorio sincicial humano (VRSh). VRSh es uno de los principales causantes de enfermedades respiratorias en menores de 3 años, adultos mayores e inmunodeprimidos. Es un virus que infecta células del tracto respiratorio replicando en el citoplasma de estas. Posee un ARN genómico de simple hebra de polaridad negativa y actualmente no existen vacunas licenciadas ni tratamientos antivirales para combatir su infección. El objetivo de este trabajo fue determinar si las proteínas que participan en la adición, remoción y reconocimiento de m6A, tienen un impacto en la replicación del VRSh. Para esto, se sobreexpresaron las proteínas metiltransferasas, desmetilasas y lectoras en células HEK293T infectadas con VRSh y se estudió la expresión de la proteína viral de fusión (F) por Western Blot (WB). Además, se cuantificó los niveles del ARNm de F y el ARN genómico intra y extracelular mediante RT-qPCR bajo las mismas condiciones. Los resultados obtenidos muestran que la sobreexpresión de las metiltransferasas disminuyó la expresión de la proteína F y los niveles del ARNg viral, mientras que la sobreexpresión de las desmetilasas tuvo el efecto contrario, sugiriendo que m6A afecta de forma negativa la expresión de proteínas virales y la replicación del genoma de VRSh. Por otra parte, la sobrexpresión de las proteínas YTHDF1, 2 y 3 aumentó los niveles del ARNm de la proteína F, aunque disminuyó los niveles del ARNg del virus. Además, mediante ensayos de inmunoprecipitación de estas proteínas se observó que tanto YTHDF1, 2 y 3 se unen al ARNg de VRSh, sugiriendo que la modificación m6A se encuentra en el ARNg de VRSh. En conjunto, estos resultados sugieren la presencia de m6A en el ARN de VRSh, posiblemente regulando la síntesis de ARN mensajeros y ARN genómico, al igual que la expresión de proteínas virales, mediado por la actividad de las proteínas YTHDF1, 2 y 3. / Octubre 2019

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / RESÚMEN Introducción. El virus respiratorio sincicial (VRS) es el principal agente de infección respiratoria aguda infantil a nivel mundial y nacional. Diversos estudios han asociado patologías previas como factores asociados a la gravedad del cuadro; sin embargo, algunos niños sanos también se enferman gravemente mientras que otros cursan con una enfermedad leve. Ciertos genotipos de VRS han sido asociados con cuadros más graves mientras que otros estudios no encuentran ninguna asociación en particular. Por otro lado la respuesta inmune del hospedero parece ser el factor más relevante en la evolución clínica de los lactantes, según estudios en modelos animales y otros estudios in vitro; pero existen muy poco estudios in vivo en los pacientes afectados. Este trabajo plantea como hipótesis que la gravedad de la primoinfección por VRS en lactantes menores de 1 año se asocia a un perfil de respuesta inmune celular Th1 disminuida y no al genotipo viral. Objetivos. Caracterizar el perfil de la respuesta inmune celular en lactantes hospitalizados por primoinfección respiratoria aguda baja por VRS adquirida en la comunidad en relación a la gravedad de la enfermedad y detectar genotipos virales involucrados. Material y métodos. Se estudiaron 83 lactantes sanos con primoinfección por VRS durante los brotes de invierno de los años 2005 y 2006, los cuales fueron clasificados según su evolución en pacientes graves o leves. Se efectuaron técnicas de inmunotipificación a través de citometría de flujo para cuantificar las subpoblaciones linfocitarias y se midieron algunos marcadores de activación de linfocitos T (LT) y natural killer. También se cuantificaron los niveles de citoquinas de la respuesta de tipo Th1 y Th2 a través de la técnica de ELISA. Las cepas de VRS fueron genotipificadas mediante PCR y análisis filogenéticos del gen G. Resultados. La inmunotipificación demostró una disminución de la población de LT en el grupo de pacientes graves con respecto a lactantes leves y controles sanos. Esta disminución fue manifiesta especialmente en la subpoblación de linfocitos T citotóxicos/supresores (LTc/s). TambienTambién estuvieron disminuidos en el grupo grave los marcadores de linfocitos de memoria CD45RO, el marcador de activación de LT CD25 y el antígeno CD94 en la población natural killer que se asocia al sistema MHC clase I. Los niveles de citoquinas fueron en general bajos, excepto los niveles de IL-6 que fueron mayores en lactantes graves y los niveles de IL-8 mayores en pacientes con VRS con respecto a los controles sanos. Los genotipos del grupo B fueron más prevalentes en el 2005, especialmente del genotipo BA 4 (76,6%) y del grupo A durante el 2006, especialmente el GA2 (77,2%). Sin embargo, no hubo asociación de algún genotipo viral con cuadros clínicos de mayor gravedad. Conclusión: La gravedad del cuadro clínico en la infección por VRS se asocia a una respuesta inmune celular deficiente con un perfil de citoquinas Th1 disminuido y no al genotipo viral. / ABSTRACT Introduction. The respiratory sincicial virus (RSV) is the principal agent of acute infantile respiratory infection on a global and national scale. Several studies have associated previous pathologies as factors associated with the gravity of the clinical disease; nevertheless, some healthy children also fall seriously ill whereas others have a slight illness. Certain genotypes of RSV have been associated with more serious clinical disease whereas other studies do not find any connection in particular. On the other hand the immune response of the host seems to be the most important factor in the clinical evolution of the infants, according to studies in animal models and other studies in vitro; but there are very few studies in vivo in the affected patients. This work raises as hypothesis that the gravity of the primoinfection for RSV in infants younger than 1-yearold is related to a profile of diminished Th1 cellular immune response and not to the viral genotype. Objectives. To characterize the profile of the cellular immune response in infants hospitalized for low acute respiratory primoinfection by RSV acquired in the community in relation to the gravity of the illness and to detect viral genotypes involved. Material and methods. 83 healthy infants with primoinfection by RSV were studied during the winter sprouts of the years 2005 and 2006, which were classified according to their evolution under severe or mild patients. Techniques of immune typification were carried out through flow cytometry to quantify the subpopulations of lymphocytes and some markers of activation of lymphocytes T (LT) and natural killers were measured. Also the levels of cytokines of the response of type Th1 and Th2 were quantified through the ELISA technique. The straines of RSV were genotyped by means of PCR and phylogenetics analysis of the gene G. Results. The immune typification demonstrated a decrease of the LT population in the group of severe patients in comparisson to mild infants and healthy control. This decrease was clear especially in the subpopulation of lymphocytes T cytotoxics/supresors (LTc/s). The markers of lymphocytes of memory CD45RO, the activation marker of LT CD25 and the antigen CD94 in the population of natural killer that is associated to the system MHC class I were also diminished in the severe group. The levels of cytokines were generally low, except the levels of IL-6 that were higher in severe infants and the levels of IL-8 higher in patients with RSV with regard to the healthy control. The genotypes of the group 6 B were more prevalents in 2005, especially of the genotype BA (76,6 %) and of the group A during the year 2006, especially the GA2 (77,2 %). Nevertheless, there was no association of any viral genotype with clinical disease of major gravity. Conclusion: The gravity of the clinical disease in the infection by RSV is associated to an deficient cellular immune response with a diminished profile of cytokines Th1 and not to the viral genotype.

El documento digital no refiere asesor / Publicación a texto completo no autorizada por el autor / Determina la prevalencia y las características clínicas, epidemiológicas y laboratoriales de los virus en infecciones respiratorias bajas en pacientes internados en el Hospital Militar Central en el periodo 2013. El estudio es de tipo descriptivo, transversal de casos. La muestra estuvo constituida por 150 casos de menores de 2 años que ingresaron al Servicio de Hospitalización Pediátrica del Hospital Militar Central con diagnóstico de infección respiratoria baja en el periodo que corresponde al estudio. Se usó una ficha de datos la cual fue validada por los médicos asistentes del Servicio de Pediatría del Hospital Militar Central. Para el análisis de datos se utilizó el programa SPSS versión 21. El 59,3% fueron varones y el 40,7% mujeres. La media de la edad global fue de 11,3+/-6,0 meses, siendo la mínima de un mes y la máxima de 24 meses. El diagnóstico de ingreso de mayor frecuencia fue SOBA (45,3%).La mayoría de pacientes tuvieron estancias entre los 4 a 7 días (59,3%).El 7,3% de los pacientes ingresó a la Unidad de Cuidados Intensivos. Se usó antibióticos en el 32% de los casos. Se usó beta agonistas en el 63,3%.El 55,3% de los pacientes uso corticoides. En el 5,3% se usó ventilador mecánico. Hubo SOB recurrente en el 6,7% de los casos. Los meses de mayor presentación de casos es entre julio a septiembre (40,6%).En invierno se presentó el 50,7% de los casos. El 4% tuvo el antecedente de enfermedad cardiaca. El 6% tuvo el antecedente de prematuridad. El 2,7% tuvo el antecedente de enfermedad pulmonar crónica. Solo 2% de los pacientes tuvieron vacunación antigripal. El 14,7% tuvo contacto epidemiológico. Hubo una mayor frecuencia de signos de atrapamiento de aire en el 42,7% de los casos seguido de compromiso parenquimal (24%). El agente viral de mayor frecuencia fue el virus sincitial respiratorio (26%), seguido del adenovirus (13,3%). La complicación de mayor frecuencia fue la atelectasia (5,3%), seguido de empiema (4%). En el 90% de los casos el método de detección fue la prueba de inmunofluorescencia indirecta. El germen atípico identificado con mayor frecuencia fue la Chlamydia pneumoniae (6,7%). Se concluye la prevalencia de virus en el Hospital Militar Central en los pacientes internados fue de 5.6%. Hubo una mayor frecuencia de virus sincitial respiratorio y adenovirus. El germen atípico de mayor frecuencia fue la Chlamydia pneumoniae. La estacionalidad de los virus en general es en invierno. El método adecuado para identificar al germen involucrado fue la inmunofluorescencia indirecta. / Trabajo académico