CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / A viscossuplementaÃÃo à uma tÃcnica terapÃutica utilizada no tratamento de osteoartrite, a qual busca substituir o lÃquido sinovial (lubrificante das articulaÃÃes) por soluÃÃes viscoelÃsticas de derivados do Ãcido hialurÃnico com propriedades reolÃgicas melhores que a deste lÃquido. Este tratamento à caro e comercialmente sà se utilizada o Ãcido hialurÃnico. O estudo de outros polissacarÃdeos, tais como a goma guar e a quitina, para aplicaÃÃo em viscossuplementaÃÃo, aumenta a possibilidade de substituir o Ãcido hialurÃnico por outros de fontes mais abundantes e viÃveis. A goma guar (GGNP) foi purificada por vÃrios mÃtodos com a finalidade de reduzir contaminantes, como polissacarÃdeos (que nÃo galactomanana) e principalmente proteÃnas. O mÃtodo de maior eficiÃncia na reduÃÃo destes contaminantes foi o mÃtodo fÃsico+Fehling, resultando em uma guar (GGFISFEH) com 96% de galactomanana e 0% de proteÃnas. A goma comercial (GGNP) e a purificada (GGFISFEH) foram reticuladas com glutaraldeÃdo para originar hidrogÃis fluidos de alta viscosidade. O aumento da viscosidade do polissacarÃdeo com o tempo de reaÃÃo de reticulaÃÃo à gradativo e pode ser interrompido no momento em que se obtÃm um hidrogel fluido, por diÃlise contra Ãgua. Os hidrogÃis obtidos tem viscosidade quarenta vezes (GelGGNP) e oitocentas vezes (GelGGFISFEH) a viscosidade das soluÃÃes iniciais das gomas. A goma guar purificada (GGFISFEH) foi modificada por reaÃÃo de oxidaÃÃo com reagente TEMPO e por reaÃÃo de sulfataÃÃo, com a finalidade de introduzir grupos carboxilato e sulfato, assemelhando a estrutura desta ao Ãcido hialurÃnico e ao condroitim sulfato. As reaÃÃes foram eficientes na modificaÃÃo, resultando em grau de substituiÃÃo (GS) de 0,36 para a goma oxidada (GGOXID) e 0,60 para a sulfatada (GGSULF). AnÃlises de RMN de 13C e 1H indicam que a sulfataÃÃo ocorreu no C6 da galactose e a oxidaÃÃo no C6 da manose. A quitina foi carboximetilada para originar um polieletrÃlito solÃvel em Ãgua e com grupo acetil glicosamina semelhante ao do Ãcido hialurÃnico. Esta reaÃÃo foi testada em vÃrias condiÃÃes reacionais, resultando em GS diferentes. O melhor rendimento foi de 92% com um GS de 0,53. Os testes farmacolÃgicos foram realizados em ratos Wistar. Avaliou-se o efeito per si na cavidade articular de GGNP e GGFISFEH, ambas em soluÃÃo e gel. A GGNP causou incapacitaÃÃo e influxo celular dosedependente, efeito nÃo demonstrado por GGFISFEH. A incapacitaÃÃo articular foi maior com a administraÃÃo do GelGGNP. Avaliou-se tambÃm, o efeito terapÃutico da GGFISFEH em soluÃÃo e gel, e Hilano G-F20 em osteoartrite induzida pelo modelo de transecÃÃo do ligamento cruzado anterior. A inibiÃÃo da incapacitaÃÃo articular obtida pelo gel ou pela soluÃÃo de guar foram absolutamente semelhantes ao resultado obtido com o Hilano G-F 20. A goma guar apresenta potencial como agente viscossuplementador. / The viscosupplementation is a therapeutic technique used in the osteoarthritis treatment, in which the sinovial fluid (lubricant of the ligaments) is replaced by viscoelastic solutions derived from hyaluronic acid with rheological properties better than the starting material. This treatment is expensive and commercially, only hialuronic acid is used. The research of other polysaccharides such as the guar gum and chitin, for the application on viscosupplementation, increases the possibility of substituting the hyaluronic acid with other from more abundant sources and more viable. The guar gum (GGNP) was purified through various methods with the aim to reduce contaminants, such as polysaccharides (but not galactomannan) and most importantly, proteins. The method with best efficiency in the reduction of these contaminants was the physic+Fehling method, resulting in a guar (GGFISFEH) with 96% of galactomannan and 0% of proteins. The commercial gum (GGNP) and the purified (GGFISFEH) were crosslinked with glutaraldehyde to originate fluids hydrogel of high viscosity. The increase in viscosity of the polysaccharides with the increase of the crosslinking reaction time is gradual and can be interrupted at the moment a hydrogel fluid is obtained through dialysis against water. The hydrogels obtained have viscosity forty times (GelGGNP) and eight hundred times (GelGGFISFEH) than the initial viscosities of the gums. The purified guar gum (GGFISFEH) was modified through oxidative reaction with a TEMPO reagent and through a sulfatation reaction, with the aim of introducing carboxylated and sulphate groups, making their structure similar to the one from the hyaluronic acid and the chondroitin sulfate. The reactions were efficient in the modification, resulting in degree of substitution (DS) of 0.36 for the oxidated gum (GGOXID) and 0.60 for the sulfated gum(GGSULF). 13C and 1H NMR analyses indicated that the sulfatation occurred in C6 of galactose and the oxidation on C6 of mannose The chitin was carboxylated to form a water soluble polyeletrolite and with a group of acetyl glucosamine similar to the hyaluronic acid. This reaction was tested in various conditions, resulting in different DS. The best yield was of 92% with a DS of 0.53. The pharmacological tests were conducted on rats Wistar. The effect, per si, in the articulate cavity of GGNP and GFISFEH, both in solution and gel was also studied. The GGNP caused incapacitation and dosage-dependant cell influx, an effect not demonstrated by GGFISFEH. The articular incapacitation was greater with the administration of GelGGNP. It was also evaluated the therapeutic effect of GGFISFEH in solution and gel, and Hilano G-F20 in osteoarthritis induced by the transection of the anterior cruciate ligament. The inhibition of the articular incapacitation obtained through gel or through the guar solution were entirely similar to the results obtained with the Hilano G-F20. The guar gum presents potential as a viscosuplemented agent.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Animal models have been employed for the study of osteoarthritis (OA), but the articular hyperalgesia has received little attention. In this study, we standardized a method to study hyperalgesia in an OA model in rats, through the anterior cruciate ligament transection (ACLT), as well as the role of Nitric Oxide (NO). High molecular weight (MW) polysaccharides, such as Hylan G-F 20, as a gel preparation, have been used to relive pain in OA patients. Whether their activity is due to the high MW or to the gel state (viscossuplementation) is a matter of debate. We used the ACLT model to evaluate the effect of a polysaccharide from gum guar (GG) in the hyperalgesia. Wistar rats were subjected to ACLT (OA group). The hyperalgesia was measured using the test for articular incapacitation (AI) in rats (Tonussi & Ferreira, 1992), until 28 days. The joint lavage was used for determining cell influx (CI) and NO levels. The activity of the inducible NO synthase enzyme (iNOS) was evaluated by immunohistochemistry of the synovia. The articular cartilage was evaluated by quantifying the glycosaminoglycans (GAG) content of the cartilage of the femoral condyles. The animals of the OA group were compared to a sham group and to naive animals. Animals of the OA group received indomethacin (2mg/kg/d s.c.), L-NAME (30mg/kg i.p.) or 1400W (0,5mg/kg/d s.c.), NOS inhibitors, 30 min before the surgery and until sacrifice, at 7 days (prophylactic intervention). Animals of the OA group were compared to sham and naive groups. Other animals of the OA group received L-NAME or 1400W 3 days after the surgery, until sacrifice, at 7 days (therapeutic intervention). Still other animals of the OA group received GG (100&#956;g i. art.), as a gel or as solution, from 4 through 7 days of OA and were compared to both a sham group and to a group that received Hylan G-F 20 (100microg i. art.), as a gel. Control groups received the vehicles. The OA group displayed significantly increased AI during the first 7 days (P<0.001). There was no difference in CI among all groups. NO release, at 7 days, was increased in the OA group (P<0.05), that was associated with an increased activity of the iNOS in the synovia. The GAG content was significantly increased in the OA group, measured at 14 days (P<0.05). Indomethacin significantly reduced the AI, as compared to the OA group (P<0.05). L-NAME and 1400W reduced the AI, only when given prophylactically (P<0.01), that was reversed by the co-administration of L-NAME and L-arginine. GG, either as a gel or as a solution, as well as the Hylan G-F20, significantly reduced the AI (P<0.05), as compared to the OA group. This is the first demonstration of a model to study hyperalgesia, quantitatively, in OA experimental models. There is increased release of NO in the ACLT model, probably via iNOS activation. The administration of NOS inhibitors inhibits the AI only if given prophylactically. This is also the first demonstration that GG promotes analgesia in the ACLT model in rats. Moreover, the anti-nociceptive effect of polysaccharides, at least in this model, is independent of their colloidal state. / Modelos animais sÃo usados para estudo da Osteoartrite (OA), mas a hiperalgesia articular tem sido pouco investigada. Nesse trabalho, padronizamos um mÃtodo para estudo da hiperalgesia no modelo de OA em ratos, por transecÃÃo do ligamento cruzado anterior (TLCA) e investigamos a participaÃÃo do Ãxido NÃtrico (NO). PolissacarÃdeos de alto peso molecular (PM), como o Hilano GF-20, na forma de gel, sÃo usados para reduzir a dor em pacientes com OA, mas nÃo està claro se sua aÃÃo à atribuÃvel ao alto PM ou à forma em gel (viscossuplementaÃÃo). Usamos o modelo de TLCA para avaliar o efeito de um polissacarÃdeo de goma guar (GG) na hiperalgesia. Ratos Wistar foram submetidos à TLCA (grupo OA). A hiperalgesia foi avaliada pelo teste de incapacitaÃÃo articular (IA) para ratos (Tonussi & Ferreira, 1992), por atà 28 dias. O exsudato articular foi usado para medida do influxo celular (IC) e da liberaÃÃo de NO. A atividade da enzima NO sintase indutÃvel (iNOS) foi avaliada por imunohistoquÃmica das sinÃvias. A cartilagem articular foi avaliada pela quantificaÃÃo dos glicosaminoglicanos (GAG) da cartilagem dos cÃndilos femorais. Os animais do grupo OA foram comparados a grupos falso-operados (Sham) e a controles normais (Naive). Animais do Grupo OA receberam indometacina (2mg/kg/d s.c.), L-NAME (30mg/kg i.p.) ou 1400W (0,5mg/kg/d s.c.), inibidores da NOS, 30 min antes da cirurgia e atà o sacrifÃcio, aos 7 dias (intervenÃÃo profilÃtica). Outros animais do grupo OA receberam L-NAME ou 1400W a partir de 3 dias apÃs a cirurgia, atà o sacrifÃcio, aos 7 dias (IntervenÃÃo terapÃutica). Outros grupos OA receberam GG (100microg i. art.), como gel ou soluÃÃo, dos 4 aos 7 dias de OA e foram comparados ao grupo sham e a um grupo que recebeu Hilano G-F 20 (100&#956;g i. art.), como gel. Grupos controle receberam o veÃculo. O grupo OA apresentou IA significantemente maior durante os primeiros 7 dias (p<0,001). NÃo houve diferenÃa no IC entre todos os grupos. A liberaÃÃo de NO, aos 7 dias, foi maior no grupo OA (p<0,05), que foi associada a maior atividade da iNOS na sinÃvia. A quantidade de GAG foi maior no grupo OA, medida aos 14 dias (p<0,05). Indometacina reduziu significantemente a IA, em relaÃÃo ao grupo OA (p<0,05). L-NAME e 1400W inibiram a IA, apenas quando dados profilaticamente (p<0,01) sendo revertida pela co-administraÃÃo de L-NAME e L-arginina. A GG, em gel ou soluÃÃo, da mesma forma que o Hilano G-F 20, reduziu significantemente a IA (p<0,05), em relaÃÃo ao grupo OA. Esta à a primeira demonstraÃÃo de um modelo de estudo de hiperalgesia, de forma quantitativa, em modelos experimentais de OA. Existe aumento na liberaÃÃo de NO no modelo de TLCA, provavelmente via ativaÃÃo da iNOS. A administraÃÃo de inibidores de NOS inibe a IA nesse modelo apenas se feita de forma profilÃtica. Esta à tambÃm a primeira demonstraÃÃo que a GG promove analgesia no modelo de TLCA em ratos. Ainda, o efeito antinociceptivo de polissacarÃdeos, pelo menos nesse modelo, independe do seu estado coloidal.