Submitted by (lucia.rodrigues@ufrpe.br) on 2017-03-27T12:03:26Z No. of bitstreams: 1 Paula Radaelli.pdf: 1280329 bytes, checksum: 00e048f01119106e351e005b652d1b99 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-27T12:03:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Paula Radaelli.pdf: 1280329 bytes, checksum: 00e048f01119106e351e005b652d1b99 (MD5) Previous issue date: 2009-03-09 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / The vegetative propagation of the grapevine (Vitis spp.) facilitates the dissemination of pathogens, such as viruses, favoring the appearance of complex diseases, by accumulation of different virus species in the same plant. Among the diseases that affect the grapevine, those caused by viruses are the most difficult to control because the dissemination and the accumulation of viruses are favored by the transport and use of infected propagative material. Due to advanced studies with molecular biology, evidences suggest that some grapevine viruses, as Rupestris stem pitting-associated virus (RSPaV), Grapevine leafroll-associated virus 2 (GLRaV-2) and Grapevine fanleaf virus (GFLV) frequently present polymorphic sequences, as well as mixing infections with other viruses, making difficult to define the biological properties of the different virus variants. Therefore, one objective of this work was to evaluate the variability of these three important viruses of grapevine using the molecular characterization of the coat protein (CP) gene. Fragments comprising the complete CP genes of RSPaV, GLRaV-2 and of GFLV isolates were amplifiedby RT-PCR, using primers for specific regions of each viral species, allowing the separation of the isolate groups by phylogenetic analyses of the sequences. The isolates of each viral species here studied were additionally detected by non-radioactive probes with digoxigenin, allowing unambiguous identification of infected samples, independently of the isolate used as template for probe synthesis. The methods of diagnosis of the grapevine virus diseases can be divided in three categories. The two traditional ones include the biological tests and the serologic diagnosis. Recently, the molecular methods of diagnosis have been developed, comprising the tests RT-PCR, IC-RT-PCR and real time RT-PCR. This last one is the most advanced technique of diagnose and quantification of nucleic acids, accomplishing amplifications in precisely way and with higher reproducibility, allowing the detention of more than one virus in a single reaction. Considering the difficulties to detect virus in grapevine, and the high cost of the diagnosis methods it was considered the production ofantisera against isolates of GLRaV-2 and Grapevine virus B (GVB), developed from CPs expressed in Escherichia coli and to test the possibility of using themfor detecting these two viruses in infected grapevines. The CP genes were amplified by RT-PCR, cloned, sequenced and later subcloned, where the recombinant plasmids were employed in the transformation of E. coli and in the expression of CPs. The proteins were purified, their identities confirmed by SDS-PAGE and Western blot and used for immunizing rabbit. The antisera produced against these proteins were capable to recognize corresponding recombinant proteins in Western blot and to detect GLRaV-2 and GVB in infected grapevines by indirect ELISA, as well as discriminating healthy and infected grapevines. Many viruses that infect grapevine occur in concentrations under the limit of detention of the diagnostic tests commonly used. Considering this fact, another objective of the present work was to detect important viruses of the genera Closterovirus (GLRaV-2) and Ampelovirus (Grapevine leafroll-associated virus 1 - GLRaV-1 and Grapevine leafroll-associated virus 3- GLRaV-3), family Closteroviridae, as well as the viruses of the genera Foveavirus (RSPaV) and Vitivirus (Grapevine virus A (GVA) and the GVB),family Flexiviridae, by real time RT-PCR (TaqMan®). For ampelovirus, with degenerate primers and specific probes GLRaV-1 and GLRaV-3 were detected in isolates and/or cultivars tested. For closterovirus with degenerate primers and specific probes GLRaV-2 was detected in all cultivars tested and in Nicotiana benthamiana. The members of the family Flexiviridae GVA, GVB and RSPaV were detected by multiplex RT-PCR (TaqMan®), demonstrating that RT-PCR TaqMan® is a fast method for molecular diagnosis, quantitative, reliable, sensitive and applicable for detecting more than one virus in the same reaction. / A videira (Vitis spp.), por ser propagada vegetativamente, facilita a disseminação de patógenos, como os vírus, favorecendo o aparecimento de doenças complexas, pelo acúmulo de diferentes espécies virais numa mesma planta. Entre as doenças que afetam a videira, as viroses são as mais difíceis de controlar, pois a disseminação e o acúmulo de vírus são favorecidos pelo transporte e emprego de material propagativo infectado. Devido a avançados estudos por meio da biologia molecular, evidências sugerem que alguns vírus em videira, como Rupestris stem pitting-associated virus (RSPaV), Grapevine leafroll-associated virus 2 (GLRaV-2) e Grapevine fanleaf virus (GFLV) frequentemente apresentam muitas seqüências variáveis, bem como infecções mistas com outros vírus, dificultando a definição das propriedades biológicas das diferentes variantes deste vírus. Um dos objetivos do presente trabalho foiavaliar a variabilidade genética destes três importantes vírus da videira através da caracterização molecular do gene da proteína capsidial (CP). Foram amplificados fragmentos que compreendem os genes completos da CP de isolados de RSPaV, GLRaV-2 e de GFLV por RT-PCR, utilizando-se primers específicos para cada espécie viral, permitindo a separação em grupos dos isolados estudados por análise filogenética das seqüências obtidas. Os diferentes isolados das três espécies virais estudadas também foram detectados utilizando-se hibridização com sondas não radioativas, marcadas com digoxigenina, possibilitando identificar de forma inequívoca as amostras infectadas, independentemente dos isolados virais empregados para síntese das sondas. Os métodos de diagnóstico das viroses da videira podem ser divididos em três categorias. As duas tradicionais incluem os testes biológicos e o diagnóstico sorológico. Mais recentemente, desenvolveram-se os métodos de diagnóstico molecular, com os testes RT-PCR, IC-RT-PCR e RT-PCR em tempo real. Este último é o mais avançado para diagnose e quantificação deácidos nucléicos, pois realiza amplificações de maneira precisa e com maior reprodutibilidade, além de permitir a detecção de mais de um vírus em uma só reação. Devido às dificuldades em detectar vírus em videira, além do custo elevado dos métodos de diagnose, propôs-se a produção de antissorosespecíficos contra isolados de GLRaV-2 e Grapevine virus B (GVB), desenvolvidos a partir da proteína capsidial expressa em Escherichia coli, e testar seu possível uso para a detecção destes dois vírus, em videiras infectadas. Os genes das CPs foram amplificados via RT-PCR, clonados, seqüenciados e posteriormente subclonados, onde os plasmídeos recombinantes foram empregados na transformação de E. coli e na expressão das proteínas capsidiais. Estas foram purificadas, suas identidades confirmadas em SDS-PAGE e “Western blot”, utilizadas para imunizar coelho. Os antissoros produzidos contra estas proteínas foram capazes de reconhecer as proteínas recombinantes correspondentes em “Western blot” e detectar GLRaV-2 e GVB em tecidos infectados de videiras pelo ELISA indireto, bem como discriminar videiras sadias e infectadas. Muitos vírus que infectam a videira ocorrem em concentrações abaixo do limite de detecção dos testes diagnósticos comumente utilizados. Com isso, um outro objetivo deste trabalho foi detectar importantes vírus dos gêneros Closterovirus (GLRaV-2) eAmpelovirus (Grapevine leafroll-associated virus 1- GLRaV-1 e Grapevine leafroll-associated virus 3 - GLRaV-3), família Closteroviridae, bem como os vírus dos gêneros Foveavirus (RSPaV) e Vitivirus (Grapevine virus A (GVA) e GVB), família Flexiviridae, através de RT-PCR em tempo real (TaqMan®). Para ampelovírus, com primers degenerados e sondas específicas, foram detectados GLRaV-1 e GLRaV-3 nos isolados e /ou cultivares testados. Para closterovírus, com primers degenerados e sonda específica, detectou-se GLRaV-2 em todas as cultivares testadas e em Nicotiana benthamiana. Os membros da família Flexiviridae GVA, GVB e RSPaV foram detectados através de multiplex RT-PCR (TaqMan®), demonstrando-se assim, que a RT-PCR TaqMan® é um método de diagnóstico molecular rápido, quantitativo, confiável, sensível e capaz de detectar mais de um vírus na mesma reação.