Der HGF/c-Met-Signalweg wurde bereits seit vielen Jahren als ein wesentlicher Faktor in der Tumorgenese von Kopf-Hals-Karzinomen diskutiert. Allerdings lag der Fokus bisher nur auf den Tumorzellen selbst. In letzter Zeit wurde jedoch mehr über das umgebende Tumormikromilieu und seine bedeutende Rolle in der Tumorprogression bekannt. In anderen Tumormodellen wurde bereits gezeigt, dass der HGF/c-Met-Signalweg eine immunologische und metabolische Wirkung auf das Tumormikromilieu hat. Eine Signal-Aktivierung führte zu einer Zunahme des Immun-Checkpoint-Proteins PD-L1 auf der Tumorzelloberfläche. PD-L1 bewirkt wiederum eine Hemmung des Immunsystems, indem es die T-Zell-Aktivierung im Mikromilieu verhindert und somit die Tumorzellen nicht vom Immunsystem erkannt und beseitigt werden können. Außerdem wurde gezeigt, dass HGF/c-Met eine Glykolyse-steigernde Wirkung auf Tumorzellen hat und durch die Energiezufuhr indirekt zu einer hohen Proliferationsrate beiträgt. Ein Nebeneffekt ist hier, dass das durch die hochregulierte Glykolyse anfallende Laktat im Tumormikromilieu akkumuliert und dadurch die T-Zellen der Immunabwehr zusätzlich schädigt. Um auch den Einfluss von HGF/c-Met auf das Tumormikromilieu von Kopf-Hals-Karzinomen zu prüfen, wurden zwei etablierte Zelllinien (Detroit562 und FaDu), aus humanen Plattenepithelkarzinomen der Kopf-Hals-Region, für die Versuchsreihen in der vorliegenden Arbeit herangezogen. Die Durchflusszytometrie ergab, dass nach HGF-Stimulation die Menge an PD-L1 auf der Zelloberfläche beider Tumorzelllinien im Vergleich zur unbehandelten Probe zunahm. Bei Detroit562 war die Zunahme signifikant. Als Kontrolle wurde zusätzlich mit zwei verschiedenen Hemmprinzipien (PHA-665752 und c-Met-siRNA) das HGF-Signal unterbunden. Zusammen konnte damit bestätigt werden, dass die Zunahme von PD-L1 durch die Zugabe von HGF ausgelöst wurde. Mit Hilfe eines Verfahrens zur Messung des Glykolyse-bedingten Protonenausstroms, konnte festgestellt werden, dass eine Behandlung mit HGF in Detroit562 und FaDu zu einer gesteigerten Glykolyse führt. Auffällig war, dass sowohl beim durchflusszytometrischen Nachweis von PD-L1, als auch bei der Messung der Glykolyse, nach HGF-Stimulation bei Detroit562 im Vergleich zu FaDu ein deutlich größerer Effekt zu sehen war. Ein Zusammenhang könnte darin bestehen, dass die Detroit562-Tumorzellen aus Metastasen stammen. Aus anderen Vorarbeiten ist bekannt, dass Metastasen eine höhere Expression des HGF-Rezeptors c-Met zeigen. Eine im Vergleich zu FaDu höhere c-Met-Expression in Detroit562 kann zu einem stärkeren HGF-Signal und damit zu einem stärkeren Effekt auf nachfolgende Prozesse führen. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit erweitern unser Verständnis bezüglich des HGF/c-Met-Signalwegs und zeigen, dass eine simultane Hemmung der PD-1/PD-L1-Achse und des HGF/c-Met-Signalwegs synergistische Effekte haben könnte. / The HGF/c-Met signalling pathway has been discussed for many years as an essential factor in the tumorgenesis of head and neck cancer. However, the focus has so far only been on the tumor cells themselves. Recently, there is more knowledge about the surrounding tumor microenvironment and its important role in tumor progression. Other tumor models have already shown that the HGF/c-Met signalling pathway has an immunological and metabolic effect on the tumor micromilieu. Signal activation led to an increase in the immune checkpoint protein PD-L1 on the tumor cell surface. PD-L1 inhibits the immune system by preventing T-cell activation in the micromilieu and thus prevents tumor cells from being recognized and eliminated by the immune system. It has also been shown that HGF/c-Met has a glycolysis-increasing effect on tumor cells and indirectly contributes to a high rate of proliferation through the supply of energy. A side effect here is that the lactate produced by the highly regulated glycolysis accumulates in the tumor microenvironment and thus additionally damages the T-cells of the immune system. In order to examine the influence of HGF/c-Met on the tumor micromilieu of head and neck carcinomas, two established cell lines (Detroit562 and FaDu), from human squamous cell carcinomas of the head and neck region, were used for the test series in this paper. Flow cytometry showed that after HGF stimulation the amount of PD-L1 on the cell surface of both tumor cell lines compared to the untreated sample. Detroit562 showed a significant increase. As a control, two different inhibitors (PHA-665752 and c-Met-siRNA) were used to inhibit the HGF signal. Together they confirmed that the increase of PD-L1 was caused by the addition of HGF. Using a method to measure the glycolysis-related proton outflow, it was found that treatment with HGF in Detroit562 and FaDu leads to increased glycolysis. It was noticeable that both the flow cytometric detection of PD-L1 and glycolysis showed a greater effect after HGF stimulation in Detroit562 compared to FaDu. The reason could be that the Detroit562 tumor cells originate from metastases. From other preliminary work it is known that metastases show a higher expression of the HGF receptor c-Met. A higher c-Met expression in Detroit562 compared to FaDu can lead to a stronger HGF signal and thus to a stronger effect on subsequent processes. The results of the present work broaden our understanding of the HGF/c-Met signaling pathway and show that simultaneous inhibition of the PD-1/PD-L1 axis and the HGF/c-Met signaling pathway could have synergistic effects.

Die Aktivierung des HGF/c-Met-Signalweges wird unter anderem seit längerer Zeit als verantwortlicher Mechanismus für die Entwicklung von Resistenzen gegen den EGF-Rezeptor gerichteter Medikamente diskutiert. In verschiedenen Studien konnte die klinische Bedeutung des HGF/c-Met-Signalwegs belegt werden. In der jüngeren Vergangenheit konzentriert sich die Forschung immer mehr auf das Tumormikromilieu und dessen Einfluss auf die Tumorprogression. So konnte gezeigt werden, dass erhöhte Laktatwerte, resultierend aus einer gesteigerten Glykolyse, zytotoxische T-Zellen inhibieren. Es wurden vier etablierte Zelllinien des oralen Plattenepithelkarzinoms sowie eine Zelllinie eines Mukoepidermoidkarzinom verwendet, um den Einfluss von HGF und des Tyrosinkinaseinhibitors Foretinib auf den Glukosemetabolismus zu prüfen. Bei allen Zelllinien konnte der c-Met-Rezeptor nachgewiesen werden. Ebenso konnte in einem ELISA belegt werden, dass die Zelllinien selbst kein HFG produzieren. Es wurden proliferationsfördernde Effekte für HGF sowie zytotoxische Effekte durch Foretinib aufgezeigt. Ferner konnte der proliferationsfördernde Effekt durch HGF durch die Behandlung mit Foretinib aufgehoben werden. Im RT-PCR-Verfahren wurden die Auswirkungen auf die Transkription verschiedener Gene, die für wichtige Enzyme des Glukosemetabolismus kodieren, nach der Stimulation mit HGF sowie der Inhibition mit Foretinib untersucht. Es konnten substanzielle Veränderungen in der Expression einzelner Gene nachgewiesen werden. Zelllinienübergreifend konnte allerdings keine verstärkte bzw. verminderte Transkription durch die Behandlung mit HGF bzw. Foretinib nachgewiesen werden. Die Ergebnisse lassen auf die Komplexität der Regulierung des Glukosemetabolismus schließen. In der Durchflusszytometrie konnte gezeigt werden, dass eine Behandlung mit HGF nicht zu einer Zunahme des GLUT1 in der Zellmembran führt, wohingegen eine Behandlung mit Foretinib mit einer gesteigerten Menge von GLUT1 einhergeht. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit belegen einen Einfluss des HGF/c-Met-Signalwegs auf den Glukosemetabolismus bei Zelllinien des oralen Plattenepithelkarzinoms. / The activation of the HGF/c-Met signaling pathway has been discussed for a long time as one possible mechanism for resistance to EGF receptor-directed therapy in head and neck cancer. The significance of the HGF/c-Met signaling pathway has been demonstrated in various studies. In the recent past, research has increasingly focused on the tumor microenvironment and its influence on tumor progression. For example, it has been shown that increased lactate levels resulting from increased glycolysis inhibit cytotoxic T cells. Four established cell lines of oral squamous cell carcinoma and one cell line of mucoepidermoid carcinoma were used to test the influence of HGF and the tyrosine kinase inhibitor foretinib on glucose metabolism. The c-Met receptor was detected in all cell lines. In the Detroit 562 this was most significant. An ELISA also showed that the cell lines themselves do not produce HFG. Proliferation promoting effects for HGF as well as cytotoxic effects of foretinib were shown. Furthermore, the proliferation-promoting effect of HGF could be reversed by treatment with foretinib. The RT-PCR method was used to investigate the effects on the transcription of various genes coding for important enzymes of the glucose metabolism after stimulation with HGF and inhibition with foretinib. Substantial changes in the expression of individual genes were detected. However, no increased or decreased transcription across cell lines could be detected by treatment with HGF or foretinib. The results indicate the complexity of the regulation of glucose metabolism. The FACS analysis of GLUT1showed that treatment with HGF does not lead to an increase of GLUT1 in the cell membrane, whereas treatment with foretinib is associated with an increased amount of GLUT1. The results of the present study demonstrate an influence of the HGF/c-Met pathway on glucose metabolism in cell lines of oral squamous cell carcinoma.

Univ., Diss., 2009--Marburg.

Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) is a modulator and mediator of structural and functional plasticity at synapses in the central nervous system. Despite our profound knowledge about the synaptic function of BDNF at synapses, it is still controversially discussed whether synaptic BDNF acts primarily from pre- or postsynaptic sites. In the central nervous system, several studies show that mossy fiber (MF) projections formed by hippocampal granule neurons store the highest amount of BDNF. However, immunofluorescence and RNA labelling studies suggest that MF BDNF is primarily produced by granule neurons. Multiple other studies prefer the view that BDNF is primarily produced by postsynaptic neurons such as CA3 pyramidal neurons. Here, we question whether the BDNF, which is stored in the mossy fiber synapse, is primarily produced by granule neurons or whether by other cells in the MF-CA3 microcircuit. After standardization of immunolabelling of BDNF, confocal imaging confirmed the localization of BDNF in presynaptic MF terminals. This anterograde location of synaptic BDNF was also found in distinct regions of the fear and anxiety circuit, namely in the oval nucleus of the bed nucleus stria terminals (ovBNST) and in the central amygdala. To find out whether the presynaptic BDNF location is due to protein translation in the corresponding presynaptic dentate gyrus (DG) granule neuron, we developed and characterized a mouse model that exhibits BDNF deletion specifically from adult DG granule neurons. In this mouse model, loss of presynaptic BDNF immunoreactivity correlated with the specific Creactivity in granule neurons, thus confirming that MF BDNF is principally released by granule neurons. After BDNF deletion from granule neurons, we observed more immature neurons with widely arborized dendritic trees. This indicated that local BDNF deletion also affects the local adult neurogenesis, albeit Cre-mediated BDNF deletion only occur in adult granule neurons. Since BDNF is a master regulator of structural synaptic plasticity, it was questioned whether it is possible to visualize presynaptic, synapse-specific, structural plasticity in mossy fiber synapses. It was established that a combination of Cre-techniques together with targeting of GFP to membranes with the help of palmitoylation / myristoylation anchors was able to distinctly outline the synaptic structure of the BDNF-containing MF synapse. In summary, the mouse model characterized in here is suited to investigate the synaptic signalling function of presynaptic BDNF at the mossy fiber terminal, a model synapse to investigate microcircuit information processing from molecule to behaviour. / Der neurotrophe Wachstumsfaktor BDNF (brain-derived neurotrophic factor) ist ein Regulator und Vermittler von struktureller und funktionaler Plastizität in Synapsen des zentralen Nervensystems. Trotz des umfassenden Wissens über die synaptische Funktion von BDNF an Synapsen wird immer noch kontrovers diskutiert, ob synaptisches BDNF vorrangig von der prä- oder von der postsynaptischen Seite her agiert. Zahlreiche Studien zeigen, dass die größten BDNF Mengen des Zentralnervensystems in den Projektionen der hippocampalen Körnerzellen, den sogenannten Moosfasern (MF), enthalten sind. Während manche Studien basierend auf der Markierung von RNA und Immunofloureszenz nahelegen, dass MF BDNF in erster Linie von Körnerzellen produziert wird, bevorzugen zahlreiche andere Studien wiederum die Sicht, dass BDNF primär von postsynaptischen Neuronen wie beispielsweise den CA3 Pyramidenneuronen gebildet wird. In dieser Arbeit wurde die Fragestellung untersucht, ob das BDNF, welches in den Moosfasersynapsen enthalten ist, in erster Linie von Körnerzellen hergestellt wird, oder ob es hauptsächlich von anderen Zellen aus dem MF-CA3 Mikronetzwerk gebildet wird. Nachdem eine Standardisierung der Immunfluoreszenzmarkierung von BDNF etabliert wurde, konnte anhand von konfokaler Bildgebung die Lokalisierung von BDNF in den präsynaptischen MF Terminalen bestätiget werden. Diese anterograde Lokalisierung synaptischen BDNFs konnte außerdem in zwei weiteren Regionen des Furcht- und Angstnetzwerkes, genauer gesagt im ovalen Kern des bed nucleus stria terminalis (ovBNST) und in der zentralen Amygdala, nachgewiesen werden. Um Herauszufinden, ob die präsynaptische Lokalisation von BDNF von der Proteintranslation in den zugehörigen präsynaptischen Körnerzellen des Gyrus Dentatus abhängig ist, entwickelten und charakterisierten wir ein Mausmodel , welches die spezifische Deletion von BDNF aus den ausgereiften Körnerzellen des Gyrus Dentatus ermöglicht. In diesem Mausmodell korrelierte der Verlust präsynaptischer BDNF Immunreaktivität mit der spezifischen Cre-Aktivität in Körnerzellen, was bestätigt, dass MF BDNF hauptsächlich von den Körnerzellen ausgeschüttet wird. Nach BDNF Deletion aus den Körnerzellen konnten mehr unreife Neurone mit sich weit verzweigenden, dendritischen Strukturen beobachtet werden. Dies weist darauf hin, dass die lokale Deletion von BDNF auch die lokale adulte Neurogenese beeinflusst, obwohl die Crevermittelte BDNF Deletion nur in adulten Körnerzellen stattfindet. Da BDNF ein Hauptregulator von struktureller synaptischer Plastizität ist, kam die Frage auf, ob es möglich ist, diese präsynaptische, synapsenspezifische strukturelle Plastizität in Moosfasersynapsen zu visualisieren. Es wurde festgestellt, dass eine Kombination aus der Cre- Technik zusammen mit der gezielten Verankerung von GFP in der Zellmembran durch Palmitoylierungs-/Myristoylierungsmotive in der Lage ist, die synaptische Struktur von BDNF enthaltenden MF Synapsen darzustellen. Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass das hier entwickelte und charakterisierte Mausmodell dafür geeignet ist, die synaptische Signalfunktion präsynaptischen BDNFs in der Moosfaserterminale, einer Modellsynapse für die Erforschung der Informationsverarbeitung in Mikronetzwerken vom Molekül bis hin zum Verhalten, zu untersuchen.

Das Plattenepithelkarzinom im Kopf-Hals-Bereich (HNSCC) ist eine häufig auftretende Erkrankung mit einer hohen Rezidivrate. Mit Fokus auf das Tumormikromilieu, welches die Tumorzellen umgibt und von großer Bedeutung für die Tumorgenese ist, werden heutzutage neue Therapiekonzepte, neben der bekannten kurativen Behandlung mit chirurgischer und adjuvanter Therapie, erforscht. Diese sollen spezifischer den Tumormetabolismus betreffen und eine Unterwanderung des Immunsystems verhindern sollen. Ziel der vorgestellten Studie war es den Prozess von Tumorzellen genauer zu verstehen und mögliche Mechanismen zur Immunevasion und der geringen Reaktion auf Immuncheckpoint-Inhibitoren (ICIs) zu finden. Aus Vorarbeiten ist bekannt, dass die Stimulation mit Hepatocyte Growth Factor (HGF) zu einer Induktion des Glukose-Stoffwechsels führt. Wir haben daher untersucht, ob die Stimulation mit HGF in etablierten Modellen von HNSCC-Zellen auch zu Veränderungen im Glutamin-Stoffwechsel führt. Wir konnten zeigen, dass die ausgewählten Tumorzellen eine verringerte relative Zellzahl unter Inhibierung der Glutaminase zeigten und eine schnellere Wundheilung in Glutaminase-1 (GLS-1) exprimierenden Zellen zu beobachten ist. Darüber hinaus konnte eine erhöhte Expression insbesondere des Proteins GLS-1 nach HGF-Stimulation der Tumorzellen mittels Western Blot und PCR nachgewiesen werden. Unterstützend dazu zeigte auch eine GLS-1 Immunfluoreszenz-Färbung eine erhöhte Glutaminase Aktivität in den mit HGF stimulierten Zellen im Vergleich zur Kontrollgruppe und den mit Foretinib behandelten Zellen. Abschließend wurde die zelluläre Sauerstoffrate unter Induktion von oxidativem Stress bei HGF-stimulierten Zellen einer Kontrollgruppe im Vergleich zu GLS-1-spezifischen siRNA transfizierten Zellen analysiert. Auch hier zeigte sich eine gesteigerte Basal- wie auch Maximalatmung der HGF-stimulierten Zellen. Die Ergebnisse liefern erste Ansätze für eine zielgerichtete Therapie in den etablierten, adhärenten Zelllinien und sollten in weiteren Untersuchungen und Studien in 3D Zellkulturen wie Spheroiden oder auch Organoiden evaluiert werden. / The Head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) is a common disease with a high recurrence rate. Focused on the tumor microenvironment that surrounds the tumor cells, new therapies are now being researched in addition to the well-known curative treatment with surgical and adjuvant therapy. These concepts should affect the tumor metabolism more specifically and prevent infiltration of the immune system. The aim of this study was to understand the process of tumor cells in more detail and to find possible mechanisms for immune evasion and the poor response to immune checkpoint inhibitors (ICIs). It is known from previous work that stimulation with hepatocyte growth factor (HGF) leads to an induction of glucose metabolism. We therefore investigated whether stimulation with HGF in established models of HNSCC cells also leads to changes in glutamine metabolism. We were able to show that the selected tumor cells showed a reduced relative cell number when glutaminase was inhibited and that faster wound healing was observed in cells expressing glutaminase-1 (GLS-1). In addition, an increased expression of the protein GLS-1 in particular was detected after HGF stimulation of the tumor cells using Western blot and PCR. In support of this, GLS-1 immunofluorescence staining also showed increased glutaminase activity in the cells stimulated with HGF compared to the control group and the cells treated with foretinib. Finally, the cellular oxygen rate was analyzed under induction of oxidative stress in HGF-stimulated cells of a control group compared to GLS-1-specific siRNA transfected cells. The results provide initial approaches for targeted therapy in the established, adherent cell lines and should be evaluated in further investigations and studies in 3D cell cultures such as spheroids or organoids.

Fish of the genus Xiphophorus belong to the oldest animal models in cancer research. The oncogene responsible for the generation of spontaneous aggressive melanoma encodes for a mutated epidermal growth factor receptor (Egfr) and is called xmrk for Xiphophorus melanoma receptor kinase. Xmrk constitutive activation mechanisms and subsequent signaling pathways have already been investigated and charaterized but it is still unknown if Egfr ligands may also play a role in Xmrk-driven melanoma formation. To investigate the potential role of Egfr ligands in Xmrk-driven melanoma, I firstly analyzed the evolution of teleost and tetrapod Egfr/Egfr ligand systems. I especially focused on the analysis on the medaka fish, a closely related species to Xiphophorus, for which the whole genome has been sequenced. I could identify all seven Egfr ligands in medaka and could show that the two teleost-specific Egfr copies of medaka display dissimilar expression patterns in adult tissues together with differential expression of Egfr ligand subsets, arguing for subfunctionalization of receptor functions in this fish. Our phylogenetic and synteny analyses supported the hypothesis that only one gene in the chordate ancestor gave rise to the diversity of Egfr ligands found in vertebrate genomes today. I also could show that the Egfr extracellular subdomains implicated in ligand binding are not evolutionary conserved between tetrapods and teleosts, making the use of heterologous ligands in experiments with fish cells debatable. Despite its well understood and straight-forward process, Xmrk-driven melanomagenesis in Xiphophorus is problematic to further investigate in vivo. Our laboratory recently established a new melanoma animal model by generating transgenic mitf::xmrk medaka fishes, a Xiphophorus closely related species offering many more advantages. These fishes express xmrk under the control of the pigment-cell specific Mitf promoter. During my PhD thesis, I participated in the molecular analysis of the stably transgenic medaka and could show that the Xmrk-induced signaling pathways are similar when comparing Xiphophorus with transgenic mitf::xmrk medaka. These data together with additional RNA expression, protein, and histology analyses showed that Xmrk expression under the control of a pigment cell-specific promoter is sufficient to induce melanoma in the transgenic medaka, which develop very stereotyped tumors, including uveal and extracutaneous melanoma, with early onset during larval stages. To further investigate the potential role of Egfr ligands in Xmrk-driven melanoma, I made use of two model systems. One of them was the above mentioned mitf::xmrk medaka, the other was an in-vitro cell culture system, where the EGF-inducible Xmrk chimera HERmrk is stably expressed in murine melanocytes. Here I could show that HERmrk activation strongly induced expression of amphiregulin (Areg) and heparin-binding EGF-like growth factor (Hbegf) in melanocytes. This regulation was dependent on the MAPK and SRC signaling pathways. Moreover, upregulation of Adam10 and Adam17, the two major sheddases of Egfr ligands, was observed. I also could demonstrate the functionality of the growth factors by invitro analyses. Using the mitf::xmrk medaka model I could also show the upregulation of a subset of ligand genes, namely egf, areg, betacellulin (btc) and epigen (epgn) as well as upregulation of medaka egfrb in tumors from fish with metastatic melanoma. All these results converge to support an Xmrk-induced autocrine Egfr ligand loop. Interestingly, my in-vitro experiments with conditioned supernatant from medaka Egf- and Hbegf-producing cells revealed that not only Xiphophorus Egfrb, but also the pre-activated Xmrk could be further stimulated by the ligands. Altogether, I could show with in-vitro and in-vivo experiments that Xmrk is capable of inducing a functional autocrine Egfr ligand loop. These data confirm the importance of autocrine loops in receptor tyrosine kinase (RTK)-dependent cancer development and show the possibility for a constitutively active RTK to strengthen its oncogenic signaling by ligand binding. / Fische der Gattung Xiphophorus gehören zu den ältesten Tiermodellen für die Krebsforschung. Das im Xiphophorus-System für die Melanomentstehung verantwortliche Onkogen codiert für eine mutierte Version des epidermalen Wachstumsfaktorrezeptors (Egfr) und wird xmrk (für “Xiphophorus melanoma receptor kinase”) genannt. Die konstitutiven Aktivierungsmechanismen dieses Rezeptors und die daraus resultierenden aktivierten Signalwege sind bereits gut untersucht und charakterisiert. Dennoch war bisher unbekannt, ob Egfr-Liganden auch eine Rolle bei der Xmrk-vermittelten Melanomentstehung spielen. Um eine potenzielle Rolle dieser Egfr-Liganden im Xmrk-induzierten Melanom zu erforschen, habe ich zunächst die Evolution des Egfr/Egfr-Liganden-Systems in Teleostiern und Tetrapoden untersucht. Hierfür fokussierte ich mich im besonderen auf den Medaka- Fisch, der zum einen eine nahe evolutionäre Verwandtschaft zu Xiphophorus aufweist und zum anderen – im Gegensatz zu Xiphophorus - ein komplett sequenziertes und gut annotiertes Genom besitzt. Ich konnte alle sieben Egfr-Liganden in Medaka identifizieren und konnte weiterhin zeigen, dass die zwei Teleost-spezifischen Egfr-Kopien dieses Fisches ein unterschiedliches Expressionsmuster in adulten Geweben aufweisen, welches außerdem mit unterschiedlicher Egfr-Liganden-Expression einherging. Diese Daten sprechen für eine Subfunktionalisierung der Egfr-Funktionen in Medaka. Unsere phylogenetischen und Syntenie-Analysen unterstützen die Hypothese, dass nur ein einziges Egfr-Liganden-Gen des Chordaten-Vorfahren der genetische Ursprung für die zahlreichen Egfr-Liganden-Gene, die in heutigen Vertrebraten zu finden sind, darstellt. Ich konnte weiterhin zeigen, dass die an der Ligandenbindung beteiligten Domänen des Egfr nicht zwischen Tetrapoden und Teleostiern konserviert sind. Diese Daten sprechen somit gegen die Verwendung heterologer Liganden in Zellkulturexperimenten mit Fischzellen. Trotz der gut verstandenen Konsequenzen einer Xmrk-Expression auf die Pigmentzelle lässt sich die Xmrk-vermittelte Melanomentstehung in Xiphophorus relativ schwer in vivo untersuchen. In unserem Labor wurde daher kürzlich ein neues Tiermodell für Melanome entwickelt. Dabei handelt es sich um einen mitf::xmrk-transgenen Medaka. Diese Fische exprimieren xmrk unter der Kontrolle des Pigmentzell-spezifischen Mitf-Promoters. Während meiner Doktorarbeit trug ich zur molekularen Analyse der stabil transgenen Tiere bei und konnte zeigen, dass die Xmrk-vermittelte Signalgebung in mitf::xmrk-Medakas der von Xmrk-exprimierenden Xiphophorus-Fischen gleicht. Diese Daten, zusammen mit weiteren RNA-Expressions-, Protein- und histologischen Analysen, zeigten, dass die Expression von xmrk unter der Kontrolle eines Pigmentzellspezifischen Promoters ausreichend für die Melanomentstehung in Medaka ist. Eine Besonderheit dieses Melanommodelles ist die auffallend stereotype Tumorentstehung. Der Beginn der Hyperpigmentierung wird bereits in frühen Larvenstadien sichtbar und führt – je nach Fischlinie – anschließend zuverlässig zu extrakutanen Pigmentzelltumoren oder invasiven bzw. uvealen Melanomen. Um eine potenzielle Funktion der Egfr-Liganden für Xmrk-induzierte Melanome zu untersuchen, machte ich mir zwei Modellsysteme zunutze. Eines der beiden Modelle war der bereits oben erwähnte mitf::xmrk-transgene Medaka, das andere war ein in-vitro- Zellkultursystem, bei dem die EGF-induzierbare Xmrk-Chimäre HERmrk stabil in murinen Melanozyten exprimiert wird. Hier konnte ich zeigen, dass HERmrk-Aktivierung zu einer starken Genexpression der EGFR-Liganden Amphiregulin (Areg) und Heparin-binding EGFlike growth factor (Hbegf) in Melanozyten führte. Diese Regulierung war abhängig von den MAPK- und SRC-Signalwegen. Weiterhin wurde eine Induktion von Adam10 und Adam17, den zwei bedeutsamsten Proteasen zur Freisetzung von EGFR-Liganden (“Sheddasen”), festgestellt. Ich konnte die Funktionalität der so sezernierten Liganden durch in-vitro- Experimente nachweisen. Anhand des mitf::xmrk Medaka-Modelles konnte ich ebenfalls zeigen, dass sowohl mehrere Egfr-Ligandengene, nämlich egf, areg, betacellulin (btc) und epigen (epgn), als auch egfrb in Tumoren von Medaka-Fischen mit metastatischen Melanomen heraufreguliert wurden. All diese Daten lassen auf einen durch Xmrk induzierten autokrinen EGFR-Liganden-Loop schließen. Interessanterweise zeigte sich durch in-vitro- Experimente mit konditioniertem Überstand von Medaka Egf- und Hbegf-produzierenden Zellen, dass nicht nur Xiphophorus Egfrb, sondern auch das bereits aktivierte Xmrk durch beide Liganden weiter stimuliert werden konnte. Zusammengefasst zeigen meine in-vitro- und in-vivo-Daten, dass Xmrk in der Lage ist, einen funktionalen autokrinen Egfr-Liganden-Loop zu induzieren. Dieses Ergebnis unterstreicht die Bedeutung autokriner Loops in Rezeptortyrosinkinasen (RTK)-abhängiger Tumorentstehung und zeigt auf, dass selbst die onkogene Signalgebung prädimerisierter RTKs durch Ligandenbindung verstärkt werden kann.

The vertebrate spinal cord is composed of billions of neurons and glia cells, which are formed in a highly coordinated manner during early neurogenesis. Specification of these cells at distinct positions along the dorsoventral (DV) axis of the developing spinal cord is controlled by a ventrally located signaling center, the medial floor plate (MFP). Currently, the origin and time frame of specification of this important organizer are not clear. During my PhD thesis, I have analyzed the function of the novel secreted growth factor Midkine-a (Mdka) in zebrafish. In higher vertebrates, mdk and the related factor pleiotrophin (ptn) are widely expressed during embryogenesis and are implicated in a variety of processes. The in-vivo function of both factors, however, is unclear, as knock-out mice show no embryonic phenotype. We have isolated two mdk co-orthologs, mdka and mdkb, and one single ptn gene in zebrafish. Molecular phylogenetic analyses have shown that these genes evolved after two large gene block duplications. In contrast to higher vertebrates, zebrafish mdk and ptn genes have undergone functional divergence, resulting in mostly non-redundant expression patterns and functions. I have shown by overexpression and knock-down analyses that Mdka is required for MFP formation during zebrafish neurulation. Unlike the previously known MFP inducing factors, mdka is not expressed within the embryonic shield or tailbud but is dynamically expressed in the paraxial mesoderm. I used epistatic and mutant analyses to show that Mdka acts independently from these factors. This indicates a novel mechanism of Mdka dependent MFP formation during zebrafish neurulation. To get insight into the signaling properties of zebrafish Mdka, the function of both Mdk proteins and the candidate receptor Anaplastic lymphoma kinase (Alk) have been compared. Knock-down of mdka and mdkb resulted in the same reduction of iridophores as in mutants deficient for Alk. This indicates that Alk could be a putative receptor of Mdks during zebrafish embryogenesis. In most vertebrate species a lateral floor plate (LFP) domain adjacent to the MFP has been defined. In higher vertebrates it has been shown that the LFP is located within the p3 domain, which forms V3 interneurons. It is unclear, how different cell types in this domain are organized during early embryogenesis. I have analyzed a novel homeobox gene in zebrafish, nkx2.2b, which is exclusively expressed in the LFP. Overexpression, mutant and inhibitor analyses showed that nkx2.2b is activated by Sonic hedgehog (Shh), but repressed by retinoids and the motoneuron-inducing factor Islet-1 (Isl1). I could show that in zebrafish LFP and p3 neuronal cells are located at the same level along the DV axis, but alternate along the anteroposterior (AP) axis. Moreover, these two different cell populations require different levels of HH signaling and nkx2.2 activities. This provides new insights into the structure of the vertebrate spinal cord and suggests a novel mechanism of neural patterning. / Das Rückenmark von Vertebraten besteht aus Milliarden von Neuronen und Gliazellen, die in einem sehr komplexen Muster während der frühen Neurogenese gebildet werden. Die Spezifizierung dieser Zellen an spezifischen Positionen entlang der dorsoventralen (DV) Achse des Rückenmarks wird durch ein ventrales Organisationszentrum, die mediale Bodenplatte (MFP), kontrolliert. Die Herkunft und der Zeitraum der Spezifizierung dieses wichtigen Organisationszentrums sind zurzeit nicht klar. In meiner Doktorarbeit habe ich die Funktionen des neuen Wachstumsfaktors Midkine-a (Mdka) im Zebrafisch charakterisiert. Mdka und der verwandte Faktor pleiotrophin (ptn) zeigen ein breites Expressionsmuster während der Embryogenese von höheren Vertebraten und sind offenbar an einer Vielzahl von Prozessen beteiligt. Die exakten in-vivo Funktionen sind jedoch nicht bekannt, da knock-out Mäuse keinen embryonalen Phänotyp zeigen. Im Zebrafisch haben wir zwei co-orthologe mdk Gene, mdka und mdkb, sowie ein ptn Gen-Ortholog isoliert. Molekulare phylogenetische Analysen ergaben, dass diese Gene durch zwei unabhängige Duplikationen eines Gen-Blocks entstanden sind. Im Gegensatz zu höheren Vertebraten haben mdk und ptn Gene divergente Funktionen entwickelt, was zu weitestgehend nicht redundanten Funktionen und Expressionsmustern geführt hat. Mittels Überexpressions- und knock-down Analysen konnte ich zeigen, dass Mdka für die Bildung der MFP im Zebrafisch benötigt wird. Anders als bisher bekannte MFP induzierende Faktoren ist Mdka nicht im embryonalen Gastrula-Organisator, dem ‚Shield’ oder der Schwanzknospe exprimiert, sondern dynamisch im paraxialen Mesoderm. Durch epistatische Analysen und Mutanten-Experimente konnte ich weiterhin zeigen, dass Mdka unabhängig von diesen Faktoren wirkt. Dies deutet auf einen neuen Mdka abhängigen Mechanismus der MFP- Bildung während der Neurogenese im Zebrafisch hin. Um Einblick in den Signalweg von Mdka im Zebrafisch zu erhalten, wurde die Funktion der midkine Gene mit der des potentiellen Rezeptors, der Anaplastischen Lymphom-Kinase (Alk), verglichen. Ein ‚Knock-down’ beider Mdk Proteine führte zu einer vergleichbaren Reduktion von Iridophoren wie bei Alk defizienten Mutanten. Demnach könnte Alk ein Rezeptor beider Mdk Proteine während der Zebrafisch-Embryogenese sein. In vielen Vertebratenspezies wurde neben der MFP eine laterale Bodenplatten (LFP) Domäne definiert. In höheren Vertebraten wurde gezeigt, dass LFP Zellen innerhalb der p3 neuronalen Domäne lokalisiert sind, welche V3 Interneuronen bilden. Es ist zurzeit nicht klar, wie diese Zelltypen angeordnet sind und wie sie während der Embryogenese gebildet werden. Ich habe ein neues Homeobox Gen nkx2.2b im Zebrafisch analysiert, welches ausschließlich in der LFP exprimiert ist. Überexpressions-, Mutanten- und Inhibitorenanalysen haben gezeigt, dass nkx2.2b durch Sonic Hedgehog (Shh) aktiviert, durch Retinolsäure und den Motoneuronen induzierenden Faktor Islet-1 (Isl1) aber reprimiert wird. Ich konnte weiterhin zeigen, dass im Zebrafisch LFP und p3 neuronale Zellen auf der gleichen Ebene entlang der DV Achse lokalisiert sind und entlang der anteroposterioren (AP) Achse alternieren. Diese zwei Zellpopulationen benötigen verschiedene Aktivitäten von Hedgehog und nkx2.2b. Dies stellt einen neuen Aspekt für den Aufbau des Rückenmarks von Vertebraten dar und deutet auf einen bisher unbekannten Mechanismus der neuronalen Musterbildung hin.

Ziel dieser Arbeit war es zu untersuchen, ob mittels IHH-Gentransfer aus Hüftköpfen gewonnene hMSCs chondrogen im Pelletkultursystem differenziert werden können und ob zugleich durch IHH eine Modulation der hypertrophen Enddifferenzierung der hMSCs in diesem System möglich ist. IHH bestimmt in der Wachstumsfuge zusammen mit PTHrP während der endochondralen Ossifikation die Chondrozytenreifung und -differenzierung entscheidend mit und ist daher ein interessanter Kandidat zur Induktion von hyalinem oder zumindest hyalin-ähnlichem Knorpelgewebe in der stammzellbasierten Gentherapie. Nach Gewinnung und Kultivierung der hMSCs wurden diese mit Ad.GFP, Ad.IHH, Ad.IHH+TGF-β1, Ad.IHH+SOX-9 oder Ad.IHH+BMP-2 transduziert bzw. ein Teil für die Negativkontrolle nicht transduziert und im Anschluss alle Gruppen zu Pellets weiterverarbeitet. Histologische, biochemische sowie molekularbiologische Untersuchungen wurden an verschiedenen Zeitpunkten zur Evaluierung des chondrogenen Differenzierungsgrades sowie der hypertrophiespezifischen Merkmale der kultivierten Pellets durchgeführt. Es konnte durch diese Arbeit sowohl auf Proteinebene als auch auf Genexpressionsebene reproduzierbar gezeigt werden, dass primäre hMSCs im Pelletkultursystem sowohl durch den adenoviralen Gentransfer von IHH allein als auch durch die Co-Transduktionsgruppen IHH+TGF-β1, IHH+SOX-9 und IHH+BMP-2 chondrogen differenziert werden können. Dabei zeigten alle IHH-modifizierten Pellets Col II- und CS-4-positive immunhistochemische Anfärbungen, eine gesteigerte Synthese von Glykosaminoglykanen im biochemischen GAG-Assay sowie eine Hochregulation von mit der Chondrogenese assoziierten Genen. Das Auftreten hypertropher Merkmale bei den chondrogen differenzierten MSCs konnte durch IHH-Gentransfer nach 3 Wochen in vitro-Kultivierung nicht vollkommen unterdrückt werden, war jedoch besonders stark ausgeprägt, wenn BMP-2 co-exprimiert wurde und war etwas weniger evident in der IHH+SOX-9-Gruppe. Dabei zeigte die Ad.IHH+BMP-2-Gruppe sowohl in der ALP-Färbung als auch in dem ALP-Assay und der quantitativen RT-PCR die stärkste Hochregulierung des hypertrophen Markers ALP. Möglicherweise brachte die Überexpression von IHH das fein aufeinander abgestimmte Regulationssystem zwischen IHH und PTHrP aus dem Gleichgewicht und könnte als ein Grund dafür angeführt werden, warum die Hypertrophie im Pelletkultursystem nicht vollkommen supprimiert werden konnte. Es bleibt abzuwarten, ob IHH in vivo die Chondrogenese induzieren und dabei zugleich das Phänomen der chondrogenen Hypertrophie regulieren kann. In der Zukunft würde dies letztlich der stammzellbasierten Knorpelregeneration in vivo zu Gute kommen. / Introduction: The issue of final end-stage chondrogenic hypertrophy has been identified in previous studies on MSC-mediated chondrogenesis using several bone morphogenetic proteins (BMPs) following adenoviral gene transfer as one hurdle in the efforts of creating stable cartilage repair tissue. Therefore, in this in vitro study we explore, whether the growth factor Indian hedgehog (IHH), alone or in combination with TGFb1, BMP-2 or SOX-9, is able to modulate the appearance of chondrogenic hypertrophy in pellet cultures in vitro, and if IHH induces chondrogenesis in human primary mesenchymal stem cells (MSCs) via its gene-delivery. Methods: First generation adenoviral vectors encoding the cDNA of the human IHH gene were created by cre-lox recombination and used alone or in combination with Ad.TGFb1, Ad.BMP-2 and Ad.SOX-9 to transduce human bone-marrow derived MSCs at 5 x 102 infectious particles/cell (50 MOI multiplicities of infection). Thereafter 3 x 105 cells were seeded into aggregates and cultured for three weeks in serum-free chondrogenic differentiation medium (ITS, Dexa, Asc) with untransduced or marker gene transduced cultures as controls. Transgene expressions were determined by ELISA, and aggregates were analyzed histologically, immunohistochemically, biochemically and by RT-PCR for chondrogenesis and hypertrophy after 10 days and 21 days of culture. Results: IHH alone or in combination with TGFb1, BMP-2 or SOX-9 were equipotent inducers of chondrogenesis in MSCs in pellet culture (strong staining for alcian blue and collagen type II, high levels of GAG synthesis, expression of mRNAs associated with chondrogenesis, controls were not chondrogenic). IHH-modified aggregates, alone as well as the Ihh co-transduced groups with TGFb1, BMP-2 or SOX-9, showed also a tendency to progress towards hypertrophy, as judged by expression of alkaline phosphatase and immunhistochemical staining for collagen type X, while the highest levels for both markers seen in the IHH+BMP-2-group after 21 days of culture. These results were confirmed by qRT-PCR analyses that showed comparable expression of cartilage specific marker genes (Col II, SOX-9) in the induced pellet cultures and a higher expression of hypertrophy associated marker genes (ALP, Col X) in the IHH+BMP2-group. Discussion: IHH gene transfer with adenoviral vectors alone or in combination with TGFb1, BMP-2 or SOX-9 efficiently induces chondrogenesis in MSCs, however, the appearance of hypertrophy could not be completely obviated, and was strongly present when BMP-2 was co-expressed. Thus, it remains to be seen in the ongoing in vivo studies, whether IHH can induce chondrogenesis while modulating chondrogenic hypertrophy in vivo.

In der vorliegenden Arbeit wurden mesenchymale Fettstammzellen aus humanem abdominalen Fettgewebe erwachsener weiblicher Spender (n = 4) isoliert und in vitro expandiert. Die isolierten mesenchymalen Fettstammzellen wurden auf stammzellspezifische Oberflächenmoleküle mit der Durchflusszytometrie und histologisch auf ihr Multidifferenzierungspotential untersucht. Weitere isolierte mesenchymale Fettstammzellen wurden in Fibringel resuspendiert und in einen Polyurethanschaum eingebracht. Diese Polyurethan-Fibrin-Konstrukte wurden über einen Zeitraum von 21 Tagen in einem chondrogenen Differenzierungsmedium unter der Zugabe der Wachstumsfaktoren TGF-β3 (50 ng/ml), BMP-6 (500 ng/ml) und IGF-I (100 ng/ml) kultiviert. Der Nachweis der chondrogenen Differenzierung und der Bildung einer knorpelähnlichen extrazellulären Matrix erfolgte molekularbiologisch durch die Untersuchung der Polyurethan-Fibrin-Konstrukte auf knorpelspezifische Marker-Gene mittels Real-Time-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) und durch biochemische Analyse des DNA-, Glykosaminoglykan- und Kollagen-Gehalts. Zudem erfolgten histologische Färbungen mit Alzianblau und Safranin O sowie eine chromogene Immunhistochemie zur Darstellung der Extrazellularmatrix und knorpelspezifischer Proteine wie SOX-9. Um die angestrebte Biokompatibilität, Einheilung und Defektdeckung dieser chondrogen differenzierten Polyurethan-Fibrin-Konstrukte zu untersuchen, erfolgte zusätzlich ein in vivo-Versuch an Kaninchen mit autologen mesenchymalen Kaninchen-Fettstammzellen. Mesenchymale Kanichen-Fettstammzellen wurden aus dem Nackenfett von New Zealand white rabbits (n = 6) isoliert und vermehrt. Nach einer 2-wöchigen chondrogenen Vordifferenzierung der mesenchymalen Fettstammzellen in Polyurethan-Fibrin-Konstrukten durch Zugabe der Wachstumsfaktoren TGF-β3 (50 ng/ml) und BMP-6 (500 ng/ml) erfolgte die Implantation dieser Konstrukte in gestanzte, 4 mm große Knorpelläsionen der Kaninchenohrmuschel. Nach 3 und 6 Wochen wurden die chondrogen differenzierten Polyurethan-Fibrin-Konstrukte zur makroskopischen und histologischen Untersuchung durch Alzianblau- und Safranin O-Färbungen entnommen. / Chondrogenic differentiation of adipose-derived stem cells (ASCs) in a polyurethane-fibrin scaffold using various growth factor combinations

Techn. Universiẗat, Diss., 2007--Darmstadt.