Frankfurt (Main), Univ., Diss., 2004. / Computerdatei im Fernzugriff.

Frankfurt (Main), University, Diss., 2004.

Frankfurt (Main), University, Diss., 2004.

Peroxisomes are indispensable organelles that perform many essential metabolic activities. Thus, eukaryotic cells have evolved molecular mechanisms to ensure the inheritance of peroxisomes from mother cell to daughter cell at cell division. In the budding yeast Saccharomyces cerevisiae, the class V myosin motor, Myo2p, interacts with its peroxisomal receptor, Inp2p, to move peroxisomes along actin from mother cell to bud, while the peroxisomal membrane protein Inp1p functions to tether peroxisomes to the cell cortex. In this thesis, I report the results of investigations of peroxisome inheritance using the dimorphic yeast Yarrowia lipolytica as a model system. We showed that peroxisome mobility and inheritance are dependent on actin in Y. lipolytica. Interrogation of the Y. lipolytica genome revealed one class V myosin. This myosin V is involved in transporting peroxisomes from mother cell to bud. We characterized YlInp1p, the othologue of S. cerevisiae Inp1p, as the first peroxisomal protein required for peroxisome inheritance in Y. lipolytica. We demonstrated that YlInp1p functions to anchor peroxisomes in both mother cell and bud. YlInp1p has an additional role in the dimorphic transition from the yeast form to the hyphal form in Y. lipolytica. We identified Pex3Bp, a paralogue of Pex3p, as the peroxisome-specific receptor for myosin V in Y. lipolytica. Pex3Bp interacts directly with the globular tail of myosin V. Pex3Bp also interacts with itself and with Pex3p. In cells lacking Pex3Bp, peroxisomes are preferentially retained in the mother cell, while the majority of peroxisomes gather and are transferred to the bud in cells overproducing Pex3Bp. Overexpression of PEX3 can partially complement the phenotype of pex3B cells, while overexpression of PEX3B cannot complement the phenotype of pex3 cells. Interestingly, Pex3p, which has been shown previously to function in the de novo formation of peroxisomes from the ER, also interacts directly with the globular tail of myosin V. Therefore, Pex3p is involved in peroxisome inheritance. In addition, cells lacking Pex3Bp contain hyperelongated, tubulo-reticular peroxisomes, indicating that Pex3Bp has a role in peroxisome morphology. Our findings suggest that both Pex3Bp and Pex3p are multifunctional proteins that are involved in different steps of the peroxisome biogenic cascade.

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Thèse--Sc. phys.--Nancy, 1979. / Bibliogr. p. 141-147.

The primary goal of the research presented in this thesis has been to establish the yeast Yarrowia lipolytica as a model genetic system for the study of peroxisome biogenesis. To facilitate this, three steps were necessary. First, mutant strains of Y. lipolytica that manifested peroxisomal defects were generated; second, a genomic DNA library was created to rescue the mutants and, hence, clone the gene(s) involved; and third, the parameters governing high efficiency DNA transformation of Y. lipolytica were defined to make complementation of mutants with the genomic library feasible. This work culminated in the cloning, sequencing and characterization of a gene, dubbed PAY 4, that is required for peroxisomal assembly in Y. lipolytica. Two of the mutant strains of Y. lipolytica isolated, ole 2 and ole 4, were identified as peroxisome assembly mutants as they; (i) grew in acetate medium but failed to grow on oleic acid medium, and thus were peroxisomal as opposed to mitochondrial mutants; (ii) lacked recognizable peroxisomal structures when observed by immunofluorescence using a polyclonal serum that recognized a number of peroxisomal proteins and; (iii) had several peroxisomal enzyme activities localized to the cytosol, i.e. they manifested mistargeting of otherwise lumenal peroxisomal proteins. These were complemented with a genomic library, which represented at least 19 000 independent recombinants (insert size ~5-7 kilobases) cloned into a vector (piNA445) capable of autonomous replication in Y. lipolytica. Estimations of the size of the Y. lipolytica genome indicate that probability of this library containing a given portion of the genome is .999. To utilize the library effectively, an electro-poration protocol was developed that could transform Y. lipolytica at high efficiency (>5·10^4 transformants·μg-^1 of DNA). Using these resources, the gene complementing the ole 4 mutation was cloned and sequenced. It encodes Pay4p, a protein of ~112 kDa, containing two putative ATPase modules. Preliminary studies indicate that expression of Pay4p is induced slightly by growth on oleic acid. / Thesis / Master of Science (MSc)

Das Interesse an biotechnologisch hergestellter Bernsteinsäure als ein potenzielles intermediäres Ausgangsmaterial und als Alternative zu petrochemischen Produktionsprozessen in der Industrie steigt stetig. Für industrielle Zwecke wird Succinat derzeit noch hauptsächlich petrochemisch aus Maleinsäureanhydrid ausgehend von Butan gewonnen. Aufgrund ihrer Struktur als lineare, gesättigte Dicarbonsäure hat Bernsteinsäure allerdings das Potenzial als sogenannte Building-Block-Chemikalie zu fungieren und das als Ausgangssubstanz für viele Prozesse dienende Maleinsäureanhydrid zu verdrängen. Wichtige Vorstufen für die chemische Synthese, Polyesterproduktion und andere Prozesse können aus Succinat gewonnen werden, eine preiswerte und zu Maleinsäureanhydrid günstigere Bereitstellung von Succinat vorausgesetzt. Aufgrund der zahlreichen Anwendungsmöglichkeiten und der mit der petrochemischen Herstellung verbundenen Nachteile, wie z. B. hohe Kosten und der Einsatz umweltschädlicher Substanzen, ist die Forschung an succinatproduzierenden Organismen durch den voraussichtlichen ökologischen Nutzen und der besseren Kosteneffizienz einer biobasierten Succinatproduktion motiviert. Bernsteinsäure wird natürlicherweise durch viele Mikroorganismen, Pflanzen und Tiere als Intermediat im zentralen Stoffwechsel oder als Stoffwechselendprodukt gebildet. Die Mehrheit der natürlichen und optimierten Produzenten stellen Bakterienstämme dar, die Succinat unter anaeroben Bedingungen akkumulieren. In den letzten Jahren rückten auch Hefen immer stärker in den Fokus der Untersuchungen zur Entwicklung von biotechnologischen Verfahren zur Succinatproduktion. Neben der konventionellen Hefe Saccharomyces cerevisiae, mit der bisher trotz gentechnischer Veränderungen nur maximal 6,3 g Succinat je Liter produziert werden konnte, ist besonders die als Säureproduzent bekannte Hefe Yarrowia lipolytica von Bedeutung. Yarrowia lipolytica ist einzigartig in ihrer Fähigkeit zur Produktion und Sekretion von großen Mengen verschiedener organischer Säuren, wie Citrat, Isocitrat, α-Ketoglutarat und Pyruvat. Aufgrund dieser hohen Sekretionskapazität für Metabolite und Proteine und einer effizienten Verwertung eines breiten Substratspektrums, aber auch wegen ihrer Apathogenität und der guten molekularbiologischen und verfahrenstechnischen Handhabbarkeit ist diese Hefe schon seit einigen Jahren von hohem industriellen Interesse. Neben den bereits genannten organischen Säuren ist Yarrowia lipolytica unter geeigneten Bedingungen auch zur Produktion und Sekretion von Succinat fähig. In der vorliegenden Arbeit sollte das Potenzial dieser Hefe als Succinatproduzent untersucht werden. Der Fokus der Untersuchungen lag dabei vor allem auf dem succinat-metabolisierenden Enzym Succinatdehydrogenase, das im Tricarbonsäurezyklus die Oxidation von Succinat zu Fumarat katalysiert. Zu Beginn der Arbeiten wurden die Auswirkungen einer Reduktion der Aktivität der Succinatdehydrogenase durch das Antibiotikum Carboxin untersucht. Carboxin bewirkt in verschiedenen Organismen eine Hemmung der Succinatdehydrogenase. Dabei bindet Carboxin wahrscheinlich an die Ubichinon-Bindestelle der Succinatdehydrogenase und verhindert so eine Reduktion von Ubichinon. Die Wirkung von Carboxin auf die Succinatdehydrogenase und die Succinatproduktion der Hefe Yarrowia lipolytica wurde bisher allerdings nicht untersucht. Im Rahmen dieser Arbeit wurde jedoch nachgewiesen, dass Carboxin nicht nur auf das Wachstum des Wildtypstamms Yarrowia lipolytica H222, sondern auch auf die spezifische Aktivität der Succinatdehydrogenase hemmend wirkte. Es wurde außerdem gezeigt, dass eine Reduktion der Succinatdehydrogenaseaktivität zu einer deutlichen Steigerung der maximalen Succinatmengen und der Produktbildungsraten führte. So wurden mit 150 μg L-1 Carboxin maximale Succinatmengen von 31,6 ± 5,4 g L-1 mit durchschnittlichen Produktivitäten von 65,5 ± 7,6 mg L-1 h-1 und 4,3 ± 1,7 μg OD-1 h-1 im Vergleich zur Kultivierung ohne Carboxin mit 2,0 ± 0,7 g L-1, 4,3 ± 0,9 mg L-1 h-1 und 0,2 ± 0,1 μg OD-1 h-1 nachgewiesen. Um auf das für großtechnische Verfahren ungeeignete Antibiotikum Carboxin zu verzichten, sollte die Aktivität der Succinatdehydrogenase anschließend durch gezielte gentechnische Veränderungen reduziert werden. Um dies zu erreichen, wurde das Gen SDH2, das für die Eisen-Schwefel-Untereinheit der Succinatdehydrogenase kodiert, unter die Kontrolle ausgewählter Promotoren (des Isocitratlyasegens ICL1 oder des 3-Oxo-Acyl-Thiolasegens POT1) gesetzt, die unter bestimmten Bedingungen, z. B. bei Einsatz von Glycerol als Kohlenstoffquelle nur schwach expremiert werden. Die spezifische Aktivität der Succinatdehydrogenase konnte dadurch um 40 (pICL1-SDH2) bzw. 64 % (pPOT1-SDH2) herabgesetzt werden. Die so konstruierten Yarrowia lipolytica Stämme H222-AZ1 (pICL1-SDH2) und H222-AZ2 (pPOT1-SDH2) produzierten maximal 15,3 ± 0,5 g L-1 bzw. 30,0 ± 3,7 g L-1 Succinat. Die Untersuchungen mit Carboxin und gentechnisch bedingter verringerter Expression zeigten, dass es offenbar einen Zusammenhang zwischen Reduktion der Aktivität der Succinatdehydrogenase und Steigerung der Succinatproduktion gibt. Weiterhin waren die Produktbildungsraten bei beiden Stämmen im Vergleich zum Wildtyp signifikant erhöht. Eine Reduktion der Aktivität der Succinatdehydrogenase – sei es durch Carboxin oder Promotoraustausch – bewirkte außerdem eine Reduktion der Malat- und Fumaratbildung und eine Erhöhung der detektierbaren α-Ketoglutaratgehalte. Auf Basis dieser Ergebnisse wurde geschlussfolgert, dass die Succinatdehydrogenase das Schlüsselenzym zur Beeinflussung der Succinatproduktion zu sein scheint. Diese Schlussfolgerung wurde außerdem durch die Arbeiten von Yuzbashev et al. (2010) unterstützt. Parallel zu diesen Arbeiten wurden außerdem die Effekte der Überexpression der α-Ketoglutaratdehydrogenase, der Isocitratlyase und der Pyruvatcarboxylase untersucht. Trotz einer signifikanten Steigerung der spezifischen Aktivitäten hatten weder eine Überexpression der α-Ketoglutaratdehydrogenase noch der Isocitratlyase eine Steigerung der Succinatproduktion zur Folge. Nur die erhöhte Kopienzahl des Pyruvatcarboxylase kodierenden Gens und eine damit einhergehende Steigerung der Aktivität resultierte in einer geringen Erhöhung der gebildeten Succinatgehalte im Vergleich zum Wildtyp. Bei gleichzeitiger Reduktion der Succinatdehydrogenaseaktivität durch Carboxin wurde diese Tendenz eindeutig bestätigt. Aufgrund dieses Befunds wurde ausgehend von H222-AZ2 ein Stamm konstruiert, in dem zusätzlich zum Austausch des DH2-Promotors mehrere Kopien des Pyruvatcarboxylase-kodierenden Gens PYC1 eingeführt wurden. Die Überexpression von PYC1 resultierte nicht nur in einer gesteigerten Aktivität der Pyruvatcarboxylase, sondern auch in einer weiteren Steigerung der Succinatproduktion im Vergleich zu H222-AZ2. So wurden maximale Succinatmengen von 43,9 ± 7,9 g L-1 mit durchschnittlichen Produktivitäten von 129,4 ± 13,0 mg L-1 h-1 und 8,2 ± 1,5 μg OD-1 h-1 nachgewiesen. Im Vergleich zum Wildtyp entspricht dies einer Steigerung der detektierbaren Succinatmengen um das 34fache. Die in der vorliegenden Arbeit erzielten Ergebnisse verdeutlichen das große Potenzial der Hefe Yarrowia lipolytica für die biotechnologische Herstellung von Succinat. Es wurde gezeigt, dass eine Reduktion der Succinatdehydrogenaseaktivität allein oder kombiniert mit der gesteigerten Pyruvatcarboxylaseaktivität zu einer drastischen Steigerung der Succinatproduktion sowie zu einer Reduktion der Nebenprodukte Fumarat und Malat führte. Es wird davon ausgegangen, dass eine weitere Steigerung durch eine Optimierung der Kultivierungsbedingungen bzw. durch zusätzliche gentechnische Veränderungen möglich ist. So sollte durch nachfolgende gentechnische Veränderungen, z. B. eine erhöhte Expression der Gene der am Glyoxylatzyklus beteiligten Enzyme Malatsynthase und Isocitratlyase, vor allem die weitere Reduktion der Nebenprodukte, besonders eine Reduktion der α-Ketoglutaratgehalte angestrebt werden. Des Weiteren sollten auch die Transportprozesse der organischen Säuren, insbesondere durch die Membranen, untersucht und gegebenenfalls zugunsten der Succinatproduktion manipuliert werden.

Techn. Universiẗat, Diss., 2003--Dresden.

Die Retrotransposonen sind ubiquitäre Komponenten des eukaryotischen Genoms. In der Hefe Yarrowia lipolytica existiert neben anderen Retrotransposonen das Retrotransposon Ylt1 (Yarrowia lipolytica retrotransposon). Dieses Retrotransposon besteht aus den flankierenden "Long Terminal Repeat" (LTR), zeta von jeweils 714 Nukleotiden und interner Region, eta von 8025 Nukleotiden. Deswegen baut die gesamte Sequenz von 9453 Nukleotiden. Der etwa Bereich enthält einen durchgängigen offenen Leserahm (ORF) (826 bis 8687 Nukleotiden, 2621 Aminosäure). Die LTR Sequenzen enthalten nicht nur TATA-Box, sondern auch ein mögliches Terminations-Signal der Transkription (TAGT) sowie ein Polyadenylierungssignal (AATAAA). Eine Primer Bindungsstelle und ein Polypurin-Bereich sind ebenfalls innerhalb der Ylt1 Sequenz enthalten. Dieses Retrotransposon enthält codierenden Bereiche für ein Gag-Strukturprotein (Gag), Protease (PR), Reverse Transkriptase (RT), RNase H (RH) und Integrase (IN). Das Retrotransposons Ylt1 kommt in verschiedenen Stämmen der Hefe Y. lipolytica vor. Die Transpositionsaktivität dieses Retrotransposon war nachweisbar. Die Aktivität des LTR-Promotors ist von der Kohlenstoffquellen abhängig. Acetat und Ethanol bewirken eine Erhöhung der Promotoraktivität auf das 4fache der basalen Aktivität. Nachdem der Ylt1-ORF unter Kontrolle des ICL1-Promotors exprimiert wurde, konnten jeweils etwa 140 kDa (mit dem Anti HA-Antikörper) bzw. ca. 74 kDa (mit Anti GFP-Antikörper) große Proteine aus den zwei DNA Konstrukte nachgewiesen werden. / The retrotransposons are ubiquitous components of eukaryotic genome. The retrotransposon Ylt1 (Yarrowia lipolytica retrotransposon) was detected in the genome of the dimorphic yeast Yarrowia lipolytica. This retrotransposon is 9453 nucleotides in length and contains two identical long terminal repeats (LTR), zeta of 714 nucleotides and internal region, eta of 8025 nucleotides. The LTR sequences contain not only TATA-Box but also predicted termination signal for transcription (TATG) and polyadenylation signal (AATAAA). The both putative primer binding site (PBS) and polypurine tract were found in the retrotransposon Ylt1 sequence. This retrotransposon contains a single open reading frame (ORF) (826 - 8687 nucleotides, 2621 amino acids), which encodes Gag protein (Gag), protease (PR), reverse transcriptase (RT), RNase H (RH) and integrase (IN). The distribution of retrotransposon Ylt1 among Y. lipolytica strains indicated that the full length elements as well as solo LTR are abundant in several strains. The transposition activity of retrotransposon Ylt1 on acetate as a carbon source was also observed. The promoter activity of the LTR sequence depends on the carbon source. Acetate and ethanol activated 4 fold from the basal activity of the LTR promoter. After expression of Ylt1-ORF under the strong inducible ICL1 promoter from two DNA constructs, which contain HA or GFP epitope, a protein about 140 kDa (with anti HA-antibody) or 75 kDa (with anti GFP-antibody) were detected.