Submitted by Biblioteca da Faculdade de Farmácia (bff@ndc.uff.br) on 2018-01-22T12:47:14Z No. of bitstreams: 1 PATRICIA VOLLÚ SILVA.PDF: 2575547 bytes, checksum: c2489f8abe58d46ea1c2ba8977ba02e1 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-01-22T12:47:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PATRICIA VOLLÚ SILVA.PDF: 2575547 bytes, checksum: c2489f8abe58d46ea1c2ba8977ba02e1 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A ilha de patogenicidade pks de 54 kb é responsável pela produção de colibactin, uma molécula genotóxica, que causa rupturas de fita dupla de DNA (DSB) das células hospedeiras, e que parece estar relacionada ao aumento do risco de desenvolvimento de câncer colorretal. Colibactin foi inicialmente descrita em Escherichia coli, mas também pode ser encontrada em outras enterobactérias, como Klebsiella pneumoniae. A biossíntese de colibactin requer a atividade enzimática da fosfopantoteinil transferase (PPTase) ClbA, que também pode contribuir para a produção dos sideróforos enterobactin e yersiniabactin em E. coli. O objetivo deste trabalho foi avaliar a virulência em amostras de E. coli e de K. pneumoniae, presença da ilha de patogenicidade pks e determinar o papel de colibactin e do sideróforo enterobactin em infecções por K. pneumoniae. Para tal, uma coleção de 218 amostras de E. coli isoladas de pacientes com infecção do trato urinário atendidas no Instituto Nacional do Câncer, Brasil e 258 amostras de K. pneumoniae isoladas de sangue de pacientes internados no Centre Hospitalier Universitaire de Toulouse, França foram avaliadas. A tipificação filogenética e a presença do gene de virulência fyuA em E. coli e do gene clbN em ambas bactérias foram avaliadas por PCR. O fenótipo hipermucoviscoso (HMV) de K. pneumoniae foi determinado pelo teste string. Foi ainda investigado o papel de colibactin e enterobactin em um modelo de pneumonia em camundongos C57BL/6JRJ e em infecções de células HeLa, utilizando a cepa K. pneumoniae SB 4496 e mutantes isogênicos deficientes em clbA, clbN ou entD. Os resultados demonstraram que entre as amostras de E. coli pesquisadas, o grupo filogenético B2 foi o mais prevalente (44,9%), seguido pelos grupos filogenéticos A (13,8%), B1 (22,0%) e D (19,3%). O gene fyuA, relacionado a produção do sideróforo yersiniabactin, foi detectado em todos os grupos filogenéticos, no entanto, a detecção do referido gene foi mais frequente no grupo B2 (P = 0,0228), sendo detectado em 74,5% das amostras deste grupo. O gene clbN, relacionado a produção de colibactin, foi detectado em 14,7% das amostras de E. coli. Vale ressaltar que todas as amostras clbN positivas pertenciam ao grupo filogenético B2, as quais também portavam o gene fyuA. Adicionalmente, três amostras de E. coli apresentaram efeito citopático em células HeLa, independente da produção de colibactin e da presença dos genes hlyC/A, hlyF, cdt e cnf1. O gene clbN foi detectado em 5,8% das amostras de K. pneumoniae. Também foi observado que a detecção de clbN foi estatisticamente significantemente (P < 0,0001) entre as amostras caracterizadas como HMV, este gene foi observado em 35% das amostras HMV analisadas. Além disso, a síntese de colibactin não pôde ser mantida pela PPTase EntD e a produção de sideróforos pela K. pneumoniae SB 4496 foi continuada por outro sistema independente de PPTases EntD e ClbA. Os resultados obtidos neste trabalho parecem indicar que a produção de colibactin não afeta a sobrevivência de K. pneumoniae hipervirulenta (hvKP) nos tecidos pulmonares de camundongos C57BL/6JRJ, nas condições estudadas. No entanto, é importante salientar que a toxina colibactin produzida por hvKP é capaz de induzir genotoxicidade em células HeLa. Ambos os genes clbA e clbN foram necessários para a manutenção da megalocitose e DBS induzida por colibactin em K. pneumoniae / The 54-kb pks pathogenicity island produces a genotoxic molecule named colibactin, which causes double-strand DNA breaks (DSB) in the host cells and enhanced colorectal cancer development. Colibactin was initially described in Escherichia coli, but can be found in other enterobacteria, including Klebsiella pneumoniaE. colibactin biosynthesis requires the enzymatic activity of phosphopantetheinyl transferase (PPTase) ClbA, which may also support the enterobactin and yersiniabactin siderophores synthesis in E. coli. The goal of this work was to evaluate the virulence of E. coli and K. pneumoniae isolates, presence of pks pathogenicity island and to determine the role of colibactin and enterobactin siderophore in K. pneumoniae infections. For this purpose, it was evaluated a collection of 218 E. coli isolates obtained from patients with urinary tract infection assisted at Instituto Nacional do Câncer, Brazil, and 258 K. pneumoniae isolates collected from blood samples from patients admitted to the Centre Hospitalier Universitaire in Toulouse, France. Phylogenetic typing and the detection of fyuA virulence gene in E. coli and clbN gene in both bacteria were assessed by PCR. K. pneumoniae hypermucoviscous (HMV) phenotype was determined by the string test. The role of colibactin and enterobactin in a C57BL/6JRJ mice pneumonia model and in HeLa cells infection was investigated using K. pneumoniae SB 4496 strain and isogenic mutants deficient in clbA, clbN or entD. Among the E. coli isolates, the phylogenetic group B2 was more prevalent (44.9%) followed by phylogroups A (13.8%), B1 (22.0%) and D (19.3%). The fyuA gene, involved in the yersiniabactin production, was detected in all phylogenetic groups studied; however, its presence was more frequently detected among the phylogroup B2 (P = 0.0228), with a high percentage of 74.5%. The clbN gene, associated to colibactin production, was detected in 14.7% of E. coli isolates. It is noteworthy that all clbN positive isolates belong to the phylogroup B2 and carry the fyuA gene. In addition, three E. coli isolates studied showed cytopathic effect in HeLa cells independently of colibactin production and the presence of hlyC/A, hlyF, cdt and cnf1 genes. Regarding K. pneumoniae, clbN gene was detected in 5.8% of the isolates. It was also observed that this detection was statistically significant (P < 0.0001) among the isolates of the HMV phenotype group, being this gene observed in 35% of the HMV isolates analyzed. In addition, it was observed that colibactin synthesis could not be maintained by the PPTase EntD. Indeed, siderophores production by K. pneumoniae SB 4496 was successful continued by another system that does not require the activity of PPTases EntD and ClbA. Results obtained in this work seem to indicate that production of colibactin does not affect the survival of hypervirulent K. pneumoniae (hvKP) in C57BL/6JRJ lung mice. Despite that, it is interesting that colibactin produced by hvKP is capable of inducing genotoxicity in HeLa cells. Both clbA and clbN genes were required for the maintenance of megalocytosis and DBS induced by colibactin in K. pneumoniae