Leila Kupfer Einflüsse der Aminosäuresequenz und erregerspezifischer Eigenschaften auf die Konvertierbarkeit chimärer Prion-Proteine in vitro Institut für Tierhygiene und Öffentliches Veterinärwesen, Veterinärmedizinische Fakultät, Universität Leipzig und Institut für Neue und Neuartige Tierseuchenerreger des Friedrich-Loeffler-Institutes, Bundesforschungsinstitut für Tiergesundheit, Insel Riems Eingereicht im Februar 2007 127 Seiten, 40 Abbildungen, 4 Tabellen, 230 Literaturangaben, 13 Seiten Anhang Schlüsselwörter: zellfreie Konversion, chimäres Prion-Protein, Aminosäuresequenz, stammspezifische Eigenschaften Die genauen molekularen Mechanismen bei der Entstehung der transmissiblen spongiformen Enzephalopathien (TSE) sind immer noch nicht eindeutig geklärt. Es wird vermutet, dass das auslösende Ereignis, die irreversible Umfaltung oder Konversion eines körpereigenen Membranproteins, des zellulären Prion-Proteins PrPC in seine krankheitsassoziierte, Proteinase K (PK) resistente Isoform PrPSc, eine ‚autokatalytische’ Konversionsreaktion initiiert. In verschiedenen Studien wurde gezeigt, dass dabei die Aminosäuresequenzen des PrPC und PrPSc die Effizienz dieser Konversionsreaktion sowohl bei Übertragungen innerhalb derselben Spezies als auch über Speziesgrenzen hinweg beeinflussen. Am Friedrich-Loeffler-Institut wurden in vergangenen Arbeiten zwei transgene Inzucht-Mauslinien etabliert, die auf der Basis von amino- und carboxyterminalen murinen Anteilen ein chimäres PrPC mit zentralen ovinen (Tgmushp XIX) oder bovinen (Tgmubo XIII) Sequenzen exprimieren. Erstaunlicherweise erwiesen sich die Tgmubo XIII-Mäuse als nahezu resistent gegen verschiedene TSE-Erreger aus Schaf, Rind und Maus, während die Tiere der Linie Tgmushp XIX ausgesprochen gut infizierbar waren. Da sich die PrP-Sequenz dieser beiden Mauslinien um lediglich vier Aminosäurereste unterscheidet, war es Ziel dieser Studie zu ermitteln, welcher Aminosäure-Austausch die verminderte Infizierbarkeit der Tgmubo XIII bedingt. Um kostenspielige und zeitaufwenige Tierversuche zu vermeiden, wurde hierzu ein zellfreier Konversionsansatz gewählt. Dieser birgt den Vorteil, dass die molekularen Einflüsse auf die Konversion in einem stark vereinfachten System innerhalb weniger Tage festgestellt werden können. Insgesamt wurden 19 verschiedene PrPC-Mutanten kloniert, in E. coli rekombinant exprimiert, affinitätschromatographisch aufgereinigt und im zellfreien Konversionsassay mit Zusammenfassung 85 ebenfalls hochaufgereinigtem PrPSc aus Gehirnextrakten final BSE- oder Scrapie-infizierter (drei unterschiedliche Erregerstämme: Me7, 22A, 87V) Mäuse für bis zu drei Tage inkubiert. Die stattgefundene Konversion der Mutanten wurde anschließend mittels PK-Verdau festgestellt. Die im Tierversuch ermittelten Ergebnisse für Tgmubo XIII und Tgmushp XIX konnten so in vitro für PrP-mubo und PrP-mushp bestätigt werden, d.h. nur letzteres wurde in ein PK-resistentes PrPres-Fragment konvertiert. Ausgehend von PrP-mushp wurden die vier unterschiedlichen Positionen gegen die jeweils entsprechende Aminosäure aus PrP-mubo mutiert. Dabei zeigte der Austausch von Asparagin gegen Serin auf Position 142 der chimären Sequenz den stärksten Effekt: PrP-mushpN142S ließ sich nur durch Koinkubation mit BSE-, aber nicht mehr durch Scrapie-PrPSc konvertieren. Substitutionen durch Alanin oder Glutamin führten zu einer weiteren Minderung der Konversionsrate. Auch beim Austausch mehrerer Aminosäuren in Kombination mit Serin an Position 142 wurde der hemmende Effekt dieser Substitution deutlich. Einen ähnlichen, wenn auch nicht ganz so starken Einfluss hatten Aminosäureaustausche auf Position 185. Wurde dort anstelle von Glutamin Glutamat eingefügt, konnte das so entstandene Konstrukt PrP-mushpQ185E nicht mehr durch Me7 aber noch durch 22A, 87V und BSE konvertiert werden. Wurde Glutamin durch Alanin oder Asparagin ersetzt, verminderte sich die Konversionsrate für 22A, 87V und BSE. Diese Effekte traten nur bei chimärem PrPC auf. Der singuläre Austausch der entsprechenden Aminosäuren 146 und 189 der ovinen Sequenz gegen die des bovinen PrPC zeigten keine derartige Hemmung der Konvertierbarkeit. Genauso wenig hatte die Deletion des Aminoterminus der chimären Prion-Proteine einen hemmenden Effekt. Lediglich nach Inkubation mit mauspassagierter BSE stellte sich das PrPres-Fragment des PrP-mushpΔ94 als Doppelbande im Immunoblot dar, deren Bedeutung jedoch unbekannt ist. Durch den zellfreien Konversionsassay konnten die im Tierversuch ermittelten Ergebnisse bezüglich der Empfänglichkeit der transgenen, chimäres Prion-Protein exprimierenden Mauslinien bestätigt werden. Die Erkenntnis, dass zwei Aminosäuren der chimären Sequenz für die Inkonvertibilität verantwortlich sind, zeigt, dass ein direkter Zusammenhang zwischen der Primärstruktur des Prion-Proteins und dessen Überführbarkeit in seine pathologische Isoform besteht. Zusätzlich konnten stammspezifische Effekte auf die zellfreie Konversion ermittelt werden, die zum einen ebenfalls von der Aminosäuresequenz des rekombinanten PrPC, zum anderen aber auch von den Eigenschaften des jeweiligen eingesetzten Stammes abhängen. Die in der vorgestellten Arbeit ermittelten Ergebnisse untermauern die Prionhypothese, wonach einzelne Aminosäuren des Prion-Proteins die Erregervermehrung maßgeblich beeinflussen können. Allerdings werfen die beobachteten stammspezifischen Effekte auch bisher ungelöste Fragen zu den dabei zugrunde liegenden Mechanismen auf

Es wird postuliert, dass es einen positiven Zusammenhang zwischen cfDNA und Insulinresistenz gibt, bei dem über cfDNA Verbindungen zwischen Adipositas, einer Subinflammation im (Fett-) Gewebe und Insulinresistenz besteht. Durch die pathologische Dauerstimulation der Insulinrezeptoren entsteht eine Insulinresistenz, weshalb u.a. die Zellen des Fettgewebes einen relativen Mangel an dem Schlüsselhormon des Glukosestoffwechsels, dem Insulin, erleiden und in eine metabolische Mangelsituation geraten. Dieser intrinsiche Stress, ausgelöst durch Sauerstoff- und Glukosemangel, führt zu Apoptose. Dadurch wird cfDNA freigesetzt, die über eine Aktivierung von Makrophagen eine Subinflammation begünstigt. Ziel meiner Studie war es, die cfDNA-Freisetzung im Zusammenhang mit Adipositas und Insulinresistenz zu untersuchen und Korrelationen mit klinischen und metabolischen Parametern rund um die Insulinresistenz und T2D zu testen.

Leila Kupfer Einflüsse der Aminosäuresequenz und erregerspezifischer Eigenschaften auf die Konvertierbarkeit chimärer Prion-Proteine in vitro Institut für Tierhygiene und Öffentliches Veterinärwesen, Veterinärmedizinische Fakultät, Universität Leipzig und Institut für Neue und Neuartige Tierseuchenerreger des Friedrich-Loeffler-Institutes, Bundesforschungsinstitut für Tiergesundheit, Insel Riems Eingereicht im Februar 2007 127 Seiten, 40 Abbildungen, 4 Tabellen, 230 Literaturangaben, 13 Seiten Anhang Schlüsselwörter: zellfreie Konversion, chimäres Prion-Protein, Aminosäuresequenz, stammspezifische Eigenschaften Die genauen molekularen Mechanismen bei der Entstehung der transmissiblen spongiformen Enzephalopathien (TSE) sind immer noch nicht eindeutig geklärt. Es wird vermutet, dass das auslösende Ereignis, die irreversible Umfaltung oder Konversion eines körpereigenen Membranproteins, des zellulären Prion-Proteins PrPC in seine krankheitsassoziierte, Proteinase K (PK) resistente Isoform PrPSc, eine ‚autokatalytische’ Konversionsreaktion initiiert. In verschiedenen Studien wurde gezeigt, dass dabei die Aminosäuresequenzen des PrPC und PrPSc die Effizienz dieser Konversionsreaktion sowohl bei Übertragungen innerhalb derselben Spezies als auch über Speziesgrenzen hinweg beeinflussen. Am Friedrich-Loeffler-Institut wurden in vergangenen Arbeiten zwei transgene Inzucht-Mauslinien etabliert, die auf der Basis von amino- und carboxyterminalen murinen Anteilen ein chimäres PrPC mit zentralen ovinen (Tgmushp XIX) oder bovinen (Tgmubo XIII) Sequenzen exprimieren. Erstaunlicherweise erwiesen sich die Tgmubo XIII-Mäuse als nahezu resistent gegen verschiedene TSE-Erreger aus Schaf, Rind und Maus, während die Tiere der Linie Tgmushp XIX ausgesprochen gut infizierbar waren. Da sich die PrP-Sequenz dieser beiden Mauslinien um lediglich vier Aminosäurereste unterscheidet, war es Ziel dieser Studie zu ermitteln, welcher Aminosäure-Austausch die verminderte Infizierbarkeit der Tgmubo XIII bedingt. Um kostenspielige und zeitaufwenige Tierversuche zu vermeiden, wurde hierzu ein zellfreier Konversionsansatz gewählt. Dieser birgt den Vorteil, dass die molekularen Einflüsse auf die Konversion in einem stark vereinfachten System innerhalb weniger Tage festgestellt werden können. Insgesamt wurden 19 verschiedene PrPC-Mutanten kloniert, in E. coli rekombinant exprimiert, affinitätschromatographisch aufgereinigt und im zellfreien Konversionsassay mit Zusammenfassung 85 ebenfalls hochaufgereinigtem PrPSc aus Gehirnextrakten final BSE- oder Scrapie-infizierter (drei unterschiedliche Erregerstämme: Me7, 22A, 87V) Mäuse für bis zu drei Tage inkubiert. Die stattgefundene Konversion der Mutanten wurde anschließend mittels PK-Verdau festgestellt. Die im Tierversuch ermittelten Ergebnisse für Tgmubo XIII und Tgmushp XIX konnten so in vitro für PrP-mubo und PrP-mushp bestätigt werden, d.h. nur letzteres wurde in ein PK-resistentes PrPres-Fragment konvertiert. Ausgehend von PrP-mushp wurden die vier unterschiedlichen Positionen gegen die jeweils entsprechende Aminosäure aus PrP-mubo mutiert. Dabei zeigte der Austausch von Asparagin gegen Serin auf Position 142 der chimären Sequenz den stärksten Effekt: PrP-mushpN142S ließ sich nur durch Koinkubation mit BSE-, aber nicht mehr durch Scrapie-PrPSc konvertieren. Substitutionen durch Alanin oder Glutamin führten zu einer weiteren Minderung der Konversionsrate. Auch beim Austausch mehrerer Aminosäuren in Kombination mit Serin an Position 142 wurde der hemmende Effekt dieser Substitution deutlich. Einen ähnlichen, wenn auch nicht ganz so starken Einfluss hatten Aminosäureaustausche auf Position 185. Wurde dort anstelle von Glutamin Glutamat eingefügt, konnte das so entstandene Konstrukt PrP-mushpQ185E nicht mehr durch Me7 aber noch durch 22A, 87V und BSE konvertiert werden. Wurde Glutamin durch Alanin oder Asparagin ersetzt, verminderte sich die Konversionsrate für 22A, 87V und BSE. Diese Effekte traten nur bei chimärem PrPC auf. Der singuläre Austausch der entsprechenden Aminosäuren 146 und 189 der ovinen Sequenz gegen die des bovinen PrPC zeigten keine derartige Hemmung der Konvertierbarkeit. Genauso wenig hatte die Deletion des Aminoterminus der chimären Prion-Proteine einen hemmenden Effekt. Lediglich nach Inkubation mit mauspassagierter BSE stellte sich das PrPres-Fragment des PrP-mushpΔ94 als Doppelbande im Immunoblot dar, deren Bedeutung jedoch unbekannt ist. Durch den zellfreien Konversionsassay konnten die im Tierversuch ermittelten Ergebnisse bezüglich der Empfänglichkeit der transgenen, chimäres Prion-Protein exprimierenden Mauslinien bestätigt werden. Die Erkenntnis, dass zwei Aminosäuren der chimären Sequenz für die Inkonvertibilität verantwortlich sind, zeigt, dass ein direkter Zusammenhang zwischen der Primärstruktur des Prion-Proteins und dessen Überführbarkeit in seine pathologische Isoform besteht. Zusätzlich konnten stammspezifische Effekte auf die zellfreie Konversion ermittelt werden, die zum einen ebenfalls von der Aminosäuresequenz des rekombinanten PrPC, zum anderen aber auch von den Eigenschaften des jeweiligen eingesetzten Stammes abhängen. Die in der vorgestellten Arbeit ermittelten Ergebnisse untermauern die Prionhypothese, wonach einzelne Aminosäuren des Prion-Proteins die Erregervermehrung maßgeblich beeinflussen können. Allerdings werfen die beobachteten stammspezifischen Effekte auch bisher ungelöste Fragen zu den dabei zugrunde liegenden Mechanismen auf

Meine Untersuchungen zeigen, dass es sich bei der zellfreien DNA (cfDNA, engl. cell-free DNA) des Spenderorgans (GcfDNA, engl. graft-derived cell-free DNA) um einen klinisch vielversprechenden Biomarker zur direkten Ermittlung der Organschädigung im Sinne einer „flüssigen Biopsie“ handelt. Alles was dafür notwendig ist, ist eine Blutprobe des Empfängerpatienten. Im Gegensatz zu konventionellen Markern wird die Organschädigung unmittelbar, direkt und hochspezifisch angezeigt. Durch neue Entwicklungen in der Labordiagnostik lässt sich dieser Marker im routinemäßigen Einsatz mittels digital droplet PCR (ddPCR) bestimmen. Die Analyseergebnisse können bei verhältnismäßig niedrigen Kosten innerhalb eines Arbeitstages erstellt werden. Unmittelbar nach Transplantation ist bei allen Patienten eine sehr hohe Konzentration der GcfDNA messbar. Innerhalb von wenigen Tagen fallen die Werte schnell ab und erreichen die Größenordnung stabiler Transplantatempfänger, die in der Lebertransplantation unter 10% liegen. Dabei besteht keine signifikante Korrelation der initialen GcfDNA-Freisetzung mit der Ischämieschädigung des Spenderorgans, ermittelt durch die Dauer der kalten Ischämiezeit (WIZ). Bei unzureichender Immunsuppression ist eine erhöhte GcfDNA-Freisetzung zu beobachten. Mithilfe der GcfDNA als Marker der Organintegrität lässt sich auch der gemeinsame Effekt verschiedener Immunsuppressiva ermitteln. Die GcfDNA verhält sich dabei umgekehrt proportional zur immunsuppressiven Therapie. Patienten mit akuten Abstoßungen haben im Mittel GcfDNA-Werte oberhalb von 50%. Die GcfDNA-Werte sind bereits mehrere Tage vor einer klinisch manifestierten akuten Abstoßung erhöht. Auch eine virusassoziierte Transplantatschädigung durch Hepatitis C manifestiert sich in vergleichsweise höheren GcfDNA-Werten. Cholestasen gehen hingegen nicht mit erhöhten GcfDNA-Werten einher. Die immunsuppressive Therapie könnte sich durch den routinemäßigen Einsatz der GcfDNA sicherer, einfacher, zuverlässiger und individueller gestalten lassen. Unter-Immunsuppressionen und daraus resultierende Abstoßungen würden sich bereits in der subklinischen Phase erkennen lassen und die Therapie von der bloßen Reaktion auf klinische Ereignisse hin zur Prävention verschieben. Um das Ziel einer personalisierten Medizin zu erreichen, könnte die Immunsuppression für jeden Patienten auf das absolut notwendige und damit gegenüber der bisherigen Praxis optimale Maß festgelegt werden. Geringere Nebenwirkungen und eine Reduktion der Kosten für das Gesundheitswesen wären die Konsequenz. Dieser Marker könnte dazu beitragen, das finale Ziel, nämlich eine Verbesserung des Langzeiterfolges nach Organtransplantationen, zu erreichen. Multizentrische Studien zur Validierung dieses Markers vor dem routinemäßigen Einsatz laufen bereits.

The detection of plasma cell–free tumor DNA (ctDNA) is prognostic in colorectal cancer (CRC) and has potential for early prediction of disease recurrence. In clinical routine, ctDNA-based diagnostics are limited by the low concentration of ctDNA and error rates of standard next-generation sequencing (NGS) approaches. We evaluated the potential to increase the stability and yield of plasma cell–free DNA (cfDNA) for routine diagnostic purposes using different blood collection tubes and various manual or automated cfDNA extraction protocols. Sensitivity for low-level ctDNA was measured in KRAS-mutant cfDNA using an error-reduced NGS procedure. To test the applicability of rapid evaluation of ctDNA persistence in clinical routine, we prospectively analyzed postoperative samples of 67 CRC (stage II) patients. ctDNA detection was linear between 0.0045 and 45%, with high sensitivity (94%) and specificity (100%) for mutations at 0.1% VAF. The stability and yield of cfDNA were superior when using Streck BCT tubes and a protocol by Zymo Research. Sensitivity for ctDNA increased 1.5-fold by the integration of variant reads from triplicate PCRs and with PCR template concentration. In clinical samples, ctDNA persistence was found in ∼9% of samples, drawn 2 weeks after surgery. Moreover, in a retrospective analysis of 14 CRC patients with relapse during adjuvant therapy, we successfully detected ctDNA (median 0.38% VAF; range 0.18–5.04% VAF) in 92.85% of patients significantly prior (median 112 days) to imaging-based surveillance. Using optimized pre-analytical conditions, the detection of postoperative ctDNA is feasible with excellent sensitivity and allows the prediction of CRC recurrence in routine oncology testing.

Biological cell populations, such as in tissues or microbial communities, are constantly subject to different sources of noise and variability. Despite this, multicellular systems are still able to function properly because cells coordinate with each other by communication. Using biological model systems to study this multiscalar process can be challenging because of their innate complexity. In this thesis, we address this challenge by building a synthetic multicellular system using bottom-up in vitro assembly approaches. Using this platform, we aim to study the effect of cell-to-cell communication to population variability in a minimal and simplified context. To achieve this, we require a synthetic cell population with (i) quantifiable gene expression dynamics, (ii) customizable population variability, and (iii) intercellular communication. Having these characteristics will allow us to test different initial configurations of population variability and monitor population gene expression dynamics with and without cell-to-cell communication. To generate these synthetic cell populations, reconstituted cell-free expression systems (CFES) are encapsulated into monodisperse-sized liposomes using double-emulsion microfluidics. Both transcription and translation levels are simultaneously monitored and quantified to develop models of cell-free gene expression dynamics and differentiate between bulk and encapsulated formats. Population variability was then incorporated by combining different batches of cells to create distinct subpopulations or by using a two-inlet double-emulsion microfluidic device to generate single populations with a large dispersion of encapsulated DNA template. Lastly, genetic circuits based on the quorum sensing system of Vibrio fischeri are used to implement diffusion-mediated intercellular signalling. Quorum sensing gene circuits in Escherichia coli extract-based CFES were tested in bulk and phase transfer-generated synthetic cells. Together with these experimental systems, corresponding models of synthetic cell populations that can account for population variability and secrete-and-sensing communication are developed using mixed-effects models and moment dynamics. Overall, this work leverages CFES and microfluidic technologies to reproducibly generate a simplified in vitro model of multicellular systems that can be easily monitored spatiotemporally to study multi-scalar processes.:Preface Chapter 1 Bottom-up multicellular systems Chapter 2 Building blocks: cell-free expression and liposomes Chapter 3 Gene expression dynamics in synthetic cell populations Chapter 4 Variability and communication in synthetic cell populations Chapter 5 Modeling variability & communication in synthetic cell populations Summary and outlook Appendices Bibliography / Biologische Zellpopulationen, z.B. in Geweben oder mikrobiellen Gemeinschaften, sind ständig verschiedenen Quellen von Rauschen und Variabilität ausgesetzt. Trotzdem sind multizelluläre Systeme in der Lage, ordnungsgemäß zu funktionieren, weil sich die Zellen durch Kommunikation miteinander abstimmen. Die Verwendung biologischer Modellsysteme zur Untersuchung dieses multiskalaren Prozesses kann aufgrund ihrer angeborenen Komplexität eine Herausforderung darstellen. In dieser Arbeit gehen wir diese Herausforderung an, indem wir ein synthetisches multizelluläres System mit Hilfe von Bottom-up-in vitro-Assembly-Ansätzen aufbauen. Mit Hilfe dieser Plattform wollen wir die Auswirkungen der Kommunikation von Zelle zu Zelle auf die Populationsvariabilität in einem minimalen und vereinfachten Kontext untersuchen. Um dies zu erreichen, benötigen wir eine synthetische Zellpopulation mit (i) quantifizierbarer Genexpressionsdynamik, (ii) anpassbarer Populationsvariabilität und (iii) interzellulärer Kommunikation. Mit diesen Eigenschaften können wir verschiedene Ausgangskonfigurationen der Populationsvariabilität testen und die Genexpressionsdynamik der Population mit und ohne Zell-zu-Zell-Kommunikation beobachten. Um diese synthetischen Zellpopulationen zu erzeugen, werden rekonstituierte zellfreie Expressionssysteme (CFES) mit Hilfe der Doppelemulsions-Mikrofluidik in monodisperse Liposomen eingekapselt. Sowohl die Transkriptions- als auch die Translationsraten werden gleichzeitig überwacht und quantifiziert, um Modelle für die Dynamik der zellfreien Genexpression zu entwickeln und zwischen Bulk- und verkapselten Formaten zu unterscheiden. Die Variabilität der Populationen wurde dann durch die Kombination verschiedener Zellchargen zur Bildung unterschiedlicher Subpopulationen oder durch die Verwendung einer mikrofluidischen Doppelemulsionsvorrichtung mit zwei Einlässen zur Erzeugung einzelner Populationen mit einer großen Streuung der eingekapselten DNA-Vorlage einbezogen. Schließlich werden genetische Schaltkreise auf der Grundlage des Quorum-Sensing-Systems von Vibrio fischeri verwendet, um diffusionsvermittelte interzelluläre Signalübertragung zu implementieren. Quorum-Sensing-Genkreisläufe in CFES auf der Basis von Escherichia coli-Extrakten wurden in synthetischen Zellen getestet, die durch Bulk- und Phasentransfer erzeugt wurden. Zusammen mit diesen experimentellen Systemen wurden entsprechende Modelle synthetischer Zellpopulationen entwickelt, die die Populationsvariabilität und die Sekretions- und Sensing-Kommunikation mit Hilfe von Mixed-Effects-Modellen und Momentendynamik berücksichtigen können. Insgesamt nutzt diese Arbeit CFES- und Mikrofluidik-Technologien, um reproduzierbar ein vereinfachtes in vitro-Modell multizellulärer Systeme zu erzeugen, das leicht raum-zeitlich überwacht werden kann, um multiskalare Prozesse zu untersuchen.:Preface Chapter 1 Bottom-up multicellular systems Chapter 2 Building blocks: cell-free expression and liposomes Chapter 3 Gene expression dynamics in synthetic cell populations Chapter 4 Variability and communication in synthetic cell populations Chapter 5 Modeling variability & communication in synthetic cell populations Summary and outlook Appendices Bibliography

Überstände von Cyanobakterien sind ein vielversprechendes Produkt zur Förderung des Pflanzenwachstums, da sie alle Vorteile der freigesetzten bioaktiven Verbindungen, wie z. B. Phytohormone, enthalten, ohne die Zwänge der mikrobiellen Inokulationen. Es ist jedoch nur wenig darüber bekannt, wie Cyanobakterien die Reaktion der Pflanzen auf molekularer Ebene modulieren könnten. In dieser Studie wurde das in Chile heimische Gras Polypogon australis als Modell verwendet, um die Wirkung von Überständen aus Kulturen von sieben autochthonen Bodencyanobakterien zu untersuchen. Von diesen zeigten die Überstände der Kulturen von Trichormus sp. die beste wachstumsfördernde Wirkung auf P. australis. Die ICP-MS-Analyse ergab, dass die Überstände von Trichormus sp. eine ähnliche Nährstoffzusammensetzung aufwiesen wie das für das Wachstum der Cyanobakterien verwendete Medium BG-11, mit Ausnahme der Elemente P und Mn, die in der späten exponentiellen Phase der Kulturen verarmt waren. Dann wurden Überstände von Trichormus sp.-Kulturen, die in der späten exponentiellen Phase gesammelt wurden und die eine Menge von 32,7 pmol trans-Zeatin pro mg Chl-a enthielten, zur Bewertung der Reaktion von P. australis auf transkriptioneller Ebene verwendet. Ein BG-11-Medium, das frei von P und Mn war, wurde als Kontrolle verwendet. Ganzes Pflanzengewebe wurde 3 Stunden nach der Behandlung entnommen und für eine RNA-seq-Analyse verwendet. Die Ergebnisse zeigten, dass die Überstände von Trichormus sp. die Pflanzenreaktion hauptsächlich über die N- und Phytohormonwege modulierten, die in engem Zusammenhang mit dem C- und Lipidstoffwechsel stehen. Die behandelten Pflanzen wiesen 4 und 8 Tage nach der Anwendung größere Triebe auf als die Kontrollpflanzen, aber es wurden keine Unterschiede bei der Wurzellänge festgestellt. Dieser Phänotyp lässt sich durch die Induktion von Genen für die Gibberellin-Biosynthese in P. australis erklären, die durch andere Hormone wie Auxine, Brassinosteroide und Ethylen unterstützt wird. Andererseits wurde in mit P. australis behandelten Pflanzen eine induzierte systemische Resistenzreaktion beobachtet, die hauptsächlich durch einen Ethylen-Jasmonat-Crosstalk vermittelt wurde. Diese Arbeit unterstützt die Verwendung von Überständen als eine gute Option zur Förderung des Pflanzenwachstums.:Table of content Preliminary Page Resumen i Abstract ii Übersetzung iii DECLARATION ix 1. Introduction 1 1.1. Plant-growth promoting microorganisms 1 1.2. Soil cyanobacteria 2 1.3. Physiology of soil cyanobacteria 2 1.4. Cyanobacterial plant growth-promoting molecules 4 1.5. Plant response to bioactive compounds 6 1.6. Cyanobacterial supernatants 9 1.7. Polypogon australis as a plant study model 11 2. Methodology 13 2.1. Obtention of the cyanobacterial cultures 13 2.2. Supernatant collection from the cyanobacterial cultures 14 2.3. Cyanobacterial biomass quantification 15 2.3.1. Chlorophyll-a content 15 2.3.2. Biomass dry weight 15 2.3.3. Determination of the growth phases 15 2.4. Chemical characterization of the supernatants 16 2.4.1. Nitrate content 16 2.4.2. Total element content 16 2.4.3. Zeatin content 16 2.5. Preparation of the modified BG-11 medium (BG-11M medium) 17 2.6. Bioassays with cyanobacterial supernatants 18 2.6.1. Effect of supernatants of the 25 mL cultures on P. australis germination 18 2.6.2. Effect of supernatants of the 25 mL cultures on P. australis plants 18 2.6.3. Effect of supernatants of the 2,400 mL cultures on P. australis plants 19 2.7. Statistical analysis 19 2.8. Determination of transcriptional changes in P. australis. 20 2.8.1. Plant treatments and tissue collection 20 2.8.2. Total RNA extraction from plant tissue 20 2.8.3. DNA removal 20 2.8.4. mRNA sequencing, de novo assembly, and differential expression analysis 21 2.8.5. Contig annotation and functional classification 22 3. Results 24 3.1. Trichormus sp. cultures produce the highest biomass content 24 3.2. Trichormus sp. cultures have a low P content 25 3.3. Trichormus sp. supernatants have the best growth-promoting effect on the growth of P. australis 25 3.4. Supernatant nutrient content of Trichormus sp. cultures change through the growth phases 27 3.5. Supernatants used in the transcriptomic assay and BG-11M medium have a lower nutrient content than BG-11 medium 30 3.6. Trichormus sp. supernatants promote the growth of P. australis to a greater extent than the BG-11M medium 32 3.7. Trichormus sp. supernatants contain zeatin 33 3.8. Trichormus sp. supernatants modulated more P. australis genes than the BG-11M medium 34 3.9. Trichormus sp. supernatants regulate the gene expression of growth and defense responses in P. australis 37 4. Discussion 57 4.1. The plant-growth promoting effect of Thrichormus sp. supernatants 57 4.2. The role of P and Mn in the growth-promoting effect of Trichormus sp. supernatants 58 4.3. Modulation of P. australis N-metabolism by Trichormus sp. supernatants 59 4.4. P. australis nitrogen and carbon metabolism in response to Trichormus supernatants 63 4.5. P. australis phytohormone-metabolism modulated by Trichormus supernatants 64 4.6. The role of lipid metabolism in the response to Trichormus supernatants 67 4.7. P. australis defense response triggered by Trichormus supernatants 68 4.8. Phytohormone crosstalk and defense response in P. australis treated with Trichormus sp. supernatants 71 4.9. Perspectives and challenges for the biotechnological use of Trichormus sp. supernatants 73 5. Conclusion 76 Bibliographic references 77 Annexes 116 / Cyanobacterial supernatants are a promising plant growth-promoting product since they contain all the advantages of the released bioactive compounds, such as phytohormones, without the constraints of microbial inoculations. However, little is known about how cyanobacteria could modulate the plant response at a molecular level. In this research, the Chilean native grass, Polypogon australis, was used as a model for assaying the effect of supernatants obtained from cultures of seven autochthonous soil cyanobacteria. Of them, supernatants of Trichormus sp. cultures showed the best growth-promoting effects on P. australis. Analysis by ICP-MS showed that Trichormus sp. supernatants had a similar nutrient composition to the medium used for the cyanobacteria growth, BG-11, except for the elements P and Mn, which were depleted when the late exponential phase of the cultures was reached. Then, supernatants of Trichormus sp. cultures collected in the late exponential phase, which contained an amount of 32.7 pmol of trans-zeatin per mg of Chl-a, were employed for evaluating the P. australis response at a transcriptional level. A BG-11 medium free of P and Mn was utilized as a control. Whole plant tissue was collected 3 h-post treatment and used for an RNA-seq analysis. Results showed that Trichormus sp. supernatants modulated the plant response mainly by the N and phytohormones pathways, in close relation with C and lipid metabolism. Treated plants showed larger shoots than control plants 4 and 8 days after application, but no differences were observed in root length. This phenotype can be explained by the induction in P. australis of gibberellin biosynthesis genes, supported by other hormones such as auxins, brassinosteroids, and ethylene. On the other hand, an induced systemic resistance response was observed in P. australis-treated plants, mostly mediated by an ethylene-jasmonate crosstalk. This work supports the use of supernatants as a good plant growth-promoting option.:Table of content Preliminary Page Resumen i Abstract ii Übersetzung iii DECLARATION ix 1. Introduction 1 1.1. Plant-growth promoting microorganisms 1 1.2. Soil cyanobacteria 2 1.3. Physiology of soil cyanobacteria 2 1.4. Cyanobacterial plant growth-promoting molecules 4 1.5. Plant response to bioactive compounds 6 1.6. Cyanobacterial supernatants 9 1.7. Polypogon australis as a plant study model 11 2. Methodology 13 2.1. Obtention of the cyanobacterial cultures 13 2.2. Supernatant collection from the cyanobacterial cultures 14 2.3. Cyanobacterial biomass quantification 15 2.3.1. Chlorophyll-a content 15 2.3.2. Biomass dry weight 15 2.3.3. Determination of the growth phases 15 2.4. Chemical characterization of the supernatants 16 2.4.1. Nitrate content 16 2.4.2. Total element content 16 2.4.3. Zeatin content 16 2.5. Preparation of the modified BG-11 medium (BG-11M medium) 17 2.6. Bioassays with cyanobacterial supernatants 18 2.6.1. Effect of supernatants of the 25 mL cultures on P. australis germination 18 2.6.2. Effect of supernatants of the 25 mL cultures on P. australis plants 18 2.6.3. Effect of supernatants of the 2,400 mL cultures on P. australis plants 19 2.7. Statistical analysis 19 2.8. Determination of transcriptional changes in P. australis. 20 2.8.1. Plant treatments and tissue collection 20 2.8.2. Total RNA extraction from plant tissue 20 2.8.3. DNA removal 20 2.8.4. mRNA sequencing, de novo assembly, and differential expression analysis 21 2.8.5. Contig annotation and functional classification 22 3. Results 24 3.1. Trichormus sp. cultures produce the highest biomass content 24 3.2. Trichormus sp. cultures have a low P content 25 3.3. Trichormus sp. supernatants have the best growth-promoting effect on the growth of P. australis 25 3.4. Supernatant nutrient content of Trichormus sp. cultures change through the growth phases 27 3.5. Supernatants used in the transcriptomic assay and BG-11M medium have a lower nutrient content than BG-11 medium 30 3.6. Trichormus sp. supernatants promote the growth of P. australis to a greater extent than the BG-11M medium 32 3.7. Trichormus sp. supernatants contain zeatin 33 3.8. Trichormus sp. supernatants modulated more P. australis genes than the BG-11M medium 34 3.9. Trichormus sp. supernatants regulate the gene expression of growth and defense responses in P. australis 37 4. Discussion 57 4.1. The plant-growth promoting effect of Thrichormus sp. supernatants 57 4.2. The role of P and Mn in the growth-promoting effect of Trichormus sp. supernatants 58 4.3. Modulation of P. australis N-metabolism by Trichormus sp. supernatants 59 4.4. P. australis nitrogen and carbon metabolism in response to Trichormus supernatants 63 4.5. P. australis phytohormone-metabolism modulated by Trichormus supernatants 64 4.6. The role of lipid metabolism in the response to Trichormus supernatants 67 4.7. P. australis defense response triggered by Trichormus supernatants 68 4.8. Phytohormone crosstalk and defense response in P. australis treated with Trichormus sp. supernatants 71 4.9. Perspectives and challenges for the biotechnological use of Trichormus sp. supernatants 73 5. Conclusion 76 Bibliographic references 77 Annexes 116 / Los sobrenadantes de cianobacterias son prometedores productos promotores del crecimiento vegetal, pues contienen todas las ventajas de los compuestos bioactivos liberados, como fitohormonas, sin las limitaciones de las inoculaciones microbianas. Lamentablemente, poco se sabe sobre cómo las cianobacterias modularían la respuesta de las plantas a nivel molecular. En esta investigación, se utilizó la gramínea nativa chilena Polypogon australis como modelo para evaluar el efecto de sobrenadantes de cultivos de siete cianobacterias autóctonas de suelo. Los sobrenadantes de Trichormus sp. mostraron mejores efectos promotores del crecimiento de P. australis. Análisis mediante ICP-MS evidenciaron que estos sobrenadantes tenían un contenido nutricional similar al medio de crecimiento de las cianobacterias, BG-11, excepto por los elementos P y Mn, que se agotaron al alcanzarse la fase exponencial tardía de los cultivos. Para evaluar la respuesta de P. australis a nivel transcripcional, se emplearon sobrenadantes colectados en fase exponencial tardía de cultivos de Trichormus sp., que contenían una cantidad de 32,7 pmol de trans-zeatina por mg de Chl-a. Un medio BG-11 libre de P y Mn se utilizó como control. Tres horas después del tratamiento se recogió tejido de plantas completas y se le hizo un análisis de RNA-seq. Como resultado, los sobrenadantes principalmente modularon las vías de N y fitohormonas de la planta, en estrecha relación con los metabolismos de C y lípidos. Las plantas tratadas mostraron brotes más grandes que las plantas control, 4 y 8 días después de la aplicación, pero no se observaron diferencias en la longitud radicular. Este fenotipo puede explicarse por la inducción de biosíntesis de giberelina, apoyada por otras hormonas como auxinas, brasinoesteroides y etileno. Además, se observó una inducción de resistencia sistémica en las plantas tratadas, mediada por una interacción etileno-jasmonatos. Este trabajo corrobora el uso de sobrenadantes como una buena opción para promover el crecimiento de las plantas.:Table of content Preliminary Page Resumen i Abstract ii Übersetzung iii DECLARATION ix 1. Introduction 1 1.1. Plant-growth promoting microorganisms 1 1.2. Soil cyanobacteria 2 1.3. Physiology of soil cyanobacteria 2 1.4. Cyanobacterial plant growth-promoting molecules 4 1.5. Plant response to bioactive compounds 6 1.6. Cyanobacterial supernatants 9 1.7. Polypogon australis as a plant study model 11 2. Methodology 13 2.1. Obtention of the cyanobacterial cultures 13 2.2. Supernatant collection from the cyanobacterial cultures 14 2.3. Cyanobacterial biomass quantification 15 2.3.1. Chlorophyll-a content 15 2.3.2. Biomass dry weight 15 2.3.3. Determination of the growth phases 15 2.4. Chemical characterization of the supernatants 16 2.4.1. Nitrate content 16 2.4.2. Total element content 16 2.4.3. Zeatin content 16 2.5. Preparation of the modified BG-11 medium (BG-11M medium) 17 2.6. Bioassays with cyanobacterial supernatants 18 2.6.1. Effect of supernatants of the 25 mL cultures on P. australis germination 18 2.6.2. Effect of supernatants of the 25 mL cultures on P. australis plants 18 2.6.3. Effect of supernatants of the 2,400 mL cultures on P. australis plants 19 2.7. Statistical analysis 19 2.8. Determination of transcriptional changes in P. australis. 20 2.8.1. Plant treatments and tissue collection 20 2.8.2. Total RNA extraction from plant tissue 20 2.8.3. DNA removal 20 2.8.4. mRNA sequencing, de novo assembly, and differential expression analysis 21 2.8.5. Contig annotation and functional classification 22 3. Results 24 3.1. Trichormus sp. cultures produce the highest biomass content 24 3.2. Trichormus sp. cultures have a low P content 25 3.3. Trichormus sp. supernatants have the best growth-promoting effect on the growth of P. australis 25 3.4. Supernatant nutrient content of Trichormus sp. cultures change through the growth phases 27 3.5. Supernatants used in the transcriptomic assay and BG-11M medium have a lower nutrient content than BG-11 medium 30 3.6. Trichormus sp. supernatants promote the growth of P. australis to a greater extent than the BG-11M medium 32 3.7. Trichormus sp. supernatants contain zeatin 33 3.8. Trichormus sp. supernatants modulated more P. australis genes than the BG-11M medium 34 3.9. Trichormus sp. supernatants regulate the gene expression of growth and defense responses in P. australis 37 4. Discussion 57 4.1. The plant-growth promoting effect of Thrichormus sp. supernatants 57 4.2. The role of P and Mn in the growth-promoting effect of Trichormus sp. supernatants 58 4.3. Modulation of P. australis N-metabolism by Trichormus sp. supernatants 59 4.4. P. australis nitrogen and carbon metabolism in response to Trichormus supernatants 63 4.5. P. australis phytohormone-metabolism modulated by Trichormus supernatants 64 4.6. The role of lipid metabolism in the response to Trichormus supernatants 67 4.7. P. australis defense response triggered by Trichormus supernatants 68 4.8. Phytohormone crosstalk and defense response in P. australis treated with Trichormus sp. supernatants 71 4.9. Perspectives and challenges for the biotechnological use of Trichormus sp. supernatants 73 5. Conclusion 76 Bibliographic references 77 Annexes 116