Die Fähigkeit, mit anderen Zellen zu kommunizieren, ist eine grundlegende Eigenschaft aller lebenden Zellen und essentiell für die normale Funktionsweise vielzelliger Organismen. Die Speicheldrüsen der Schmeißfliege Calliphora vicina bilden ein ausgezeichnetes physiologisches Modellsystem um zelluläre Signaltransduktionsprozesse an einem intakten Organ zu untersuchen. Die Speichelsekretion wird dabei hormonell durch das biogene Amin Serotonin (5-Hydroxytryptamin; 5-HT) reguliert. 5-HT aktiviert in den sekretorischen Zellen der Drüsen über die Bindung an mindestens zwei membranständige G-Protein gekoppelte Rezeptoren (GPCR) zwei separate Signalwege, den IP3/Ca2+- und den cAMP-Signalweg. Zur Identifizierung und Charakterisierung der 5-HT-Rezeptoren in den Speicheldrüsen von Calliphora wurden unter Anwendung verschiedener Klonierungsstrategien zwei cDNAs (Cv5-ht2α und Cv5-ht7) isoliert, die große Ähnlichkeit zu 5-HT2- und 5-HT7-Rezeptoren aus Säugetieren aufweisen. Die Hydropathieprofile der abgeleiteten Aminosäuresequenzen postulieren die für GPCRs charakteristische heptahelikale Architektur. Alle Aminosäuremotive, die für die Ligandenbindung, die Rezeptoraktivierung und die Kopplung an G-Proteine essentiell sind, liegen konserviert vor. Interessanterweise wurde für den Cv5-HT7-Rezeptor eine zusätzliche hydrophobe Domäne im N Terminus vorhergesagt. Die Cv5-HT2α-mRNA liegt in zwei alternativ gespleißten Varianten vor. Mittels RT-PCR-Experimenten konnte die Expression beider Rezeptoren in Gehirn und Speicheldrüsen adulter Fliegen nachgewiesen werden. Ein Antiserum gegen den Cv5-HT7 Rezeptor markiert in den Speicheldrüsen die basolaterale Plasmamembran. Die Expression der Rezeptoren in einem heterologen System (HEK 293-Zellen) bestätigte diese als funktionelle 5-HT Rezeptoren. So führte die Stimulation mit Serotonin für den Cv5-HT2α zu einer dosis-abhängigen Erhöhung der intrazellulären Ca2+ Konzentration ([Ca2+]i, EC50 = 24 nM). In Cv5-HT7-exprimierenden Zellen löste 5-HT dosisabhängig (EC50 = 4,1 nM) einen Anstieg der intrazellulären cAMP Konzentration ([cAMP]i) aus. Für beide heterolog exprimierten Rezeptoren wurden pharmakologische Profile erstellt. Liganden, die eine Rezeptorsubtyp-spezifische Wirkung vermuten ließen, wurden daraufhin auf ihre Wirkung auf das transepitheliale Potential (TEP) intakter Speicheldrüsenpräparate getestet. Drei 5-HT-Rezeptoragonisten: AS 19, R-(+)-Lisurid und 5-Carboxamidotryptamin führten zu einer cAMP-abhängigen Positivierung des TEP durch eine selektive Aktivierung der 5 HT7-Rezeptoren. Eine selektive Aktivierung des Ca2+-Signalweges durch den Cv5-HT2 Rezeptor ist mit Hilfe von 5-Methoxytryptamin möglich. Dagegen konnte Clozapin im TEP als selektiver Cv5-HT7-Rezeptorantagonist bestätigt werden. Die Kombination eines molekularen Ansatzes mit physiologischen Messungen ermöglichte somit die Identifikation selektiver Liganden für 5-HT2- bzw. 5-HT7-Rezeptoren aus Calliphora vicina. Dies ermöglicht zukünftig eine separate Aktivierung der 5-HT-gesteuerten Signalwege und erleichtert dadurch die weitere Erforschung der intrazellulären Signalwege und ihrer Wechselwirkungen. / Cellular communication is a fundamental property of living cells and essential for normal functioning of multicellular organisms. The salivary glands of the blowfly Calliphora vicina are a well established physiological model system to study cellular signaling in an intact organ. Fluid secretion in this gland is hormonally regulated by the biogenic amine serotonin (5-hydroxytryptamine, 5-HT). In the secretory cells, 5-HT causes a parallel activation of the InsP3/Ca2+- and the cAMP-signaling pathways through binding and stimulation of at least two G protein coupled receptors (GPCR). In order to characterize the respective 5-HT receptors on the secretory cells, we have cloned two cDNAs (Cv5-ht2α, Cv5-ht7) that share high similarity with mammalian 5-HT2 and 5-HT7 receptor classes. Analysis of the deduced amino acid sequences postulates the typical heptahelical architecture of GPCRs for both receptors. Sequence motifs that are essential for ligand binding, receptor activation and coupling to G-proteins are well conserved. Interestingly, a computer-based structural analysis of Cv5-HT7 predicts an additional eighth hydrophobic region in the N-terminus of the receptor. We also found an alternative splice variant of the Cv5-HT2α mRNA. Using RT-PCR experiments, transcripts of both receptor mRNAs could be detected in brain and salivary gland tissue. An antiserum raised against the Cv5 HT7 receptor stained the basolateral region of the salivary glands. Heterologous receptor expression in HEK 293 cells leads to a dose-dependent increase in the intracellular Ca2+-concentration ([Ca2+]i) for Cv5-HT2α (EC50 = 24 nM) and cAMP-concentration for Cv5-HT7 (EC50 = 4,1 nM) upon application of 5-HT. A pharmacological profile was established for both receptors. Ligands that appeared to act as specific ligands of either Cv5-HT2α or Cv5-HT7 in this approach, were then tested for their effect on the transepithelial potential (TEP) of intact blowfly salivary gland preparations. Three 5-HT receptor agonists: AS 19, R-(+)-lisuride and 5-carboxamidotryptamine showed a cAMP dependent positivation of the TEP, caused by a selective activation of the Cv5-HT7 receptor. 5-methoxytryptamine exclusively activates the Ca2+ pathway via Cv5-HT2α. Clozapine antagonizes the effects of 5-HT in blowfly salivary glands and was confirmed as a Cv5-HT7 antagonist. The combination of a molecular approach with physiological measurements enabled us to identify selective ligands for 5-HT2 and 5-HT7 receptors of Calliphora vicina. These results facilitate a selective activation of the intracellular signaling pathways activated by 5-HT and will facilitate future research on different aspects of intracellular signaling and crosstalk mechanisms.

Darmkrebs ist ein weit verbreitetes Leiden, das durch erworbene, überwiegend sequenzielle Mutationen in einer kleinen Zahl Onkogene verursacht wird. Diese beeinflussen die zelluläre Signalübertragung. Um Auftreten und Progression kolorektaler Karzinome zu verstehen, müssen daher Transkriptome, Phosphoproteome und phänotypische Proteinmarker individueller Zellen berücksichtigt werden. Die Einzelzell-RNS-Sequenzierung bietet die erste dieser Fähigkeiten, während Techniken zur Messung von Proteinen auf Einzelzellebene noch wenig verbreitet sind. Hauptziel meiner Forschung war es, Massenzytometrie für Darmkrebsmodelle anzupassen und so Studien intrazellulärer Signalnetzwerke zu ermöglichen. Auf Basis etablierter Protokolle habe ich eine Methodologie entwickelt, mit der sich epitheliale Zellkulturen untersuchen lassen. Außerdem habe ich Best Practices für die Analyse von Massenzytometriedaten aufgestellt. So konnte ich zeigen, dass die Aktivierung des ERK-Signalwegs in KRAS-aktivierten Dünndarmorganoiden transgener Mäuse graduell unterschiedlich ist. Bei Aktivierung von BRAF, dem direkten Aktivierungsziel von KRAS, geht diese Eigenschaft verloren. Ich habe Statistik angewendet, um Zelltypeigenschaften aus dem Massenzytometrie-Datensatz zu extrahieren. So konnte ich zeigen, dass onkogenes KRAS zwar nicht den ERK-Signalweg signifikant aktiviert, aber die gesamte Zellpopulation in Richtung eines Stammzellphänotyps verschiebt. Mithilfe einer Serie von sequenziell CRISPR-mutierten humanen Kolonorganoiden untersuchte ich anschließend, wie sich Signalaktivität und Zellphänotypen in Abhängigkeit einzelner Onkogene der Darmkrebsentwicklung verändern. Auf Basis des intestinalen Kryptenmarkers EphB2 definierte ich dafür eine Pseudo-Differenzierungsachse. Meine Ergebnisse zeigen, dass sich die gesamte Zellpopulation während der Darmkrebsentstehung zwar in Richtung Stammzelligkeit verschiebt, diese Progression jedoch nicht durch jedes Onkogen gleichermaßen vorangetrieben wird. / Colorectal cancer (CRC) is a widespread disease caused by acquired, predominantly sequential, mutations in a limited set of oncogenes. They in turn influence cellular signalling and enable clonal advantages of tumour cells over their surrounding stroma. To understand the emergence and progression of CRC it is therefore crucial to assess transcriptomes, phospho-proteomes, and phenotype protein markers of individual cells. Single-cell RNA sequencing already enables the foremost of these capabilities while single-cell (phospho)-proteomic techniques are not yet widely established. Primary goal of my research was adapting mass cytometry (MC) for 2D and 3D CRC model systems and characterising cell signalling as well as phenotype changes in intestinal 3D organoids during CRC progression. Based on established MC protocols I devised a methodology suited for measuring epithelial cell cultures and also best practices for data analysis. With this set of tools I could show that ERK signalling is graded in KRAS-activated mouse small intestinal organoids, but not when KRAS downstream target BRAF is mutated active. I used principal component analysis (PCA) and k-means clustering to extract cell-type information from the MC dataset and could show that while oncogenic KRAS does not significantly change downstream ERK signalling, it globally shifts cells towards a crypt-like phenotype. Using a series of sequentially CRISPR-mutated human colon organoids I then investigated how signalling and cell phenotypes change in response to each newly acquired oncogene of the canonical CRC progression. Based on intestinal crypt-to-villus marker EphB2, I defined a pseudo-differentiation axis. My findings showed that, although cells generally shift towards a stem-like cell phenotype during CRC progression, this shift is not continuous.