Marburg, Univ., Diss., 2001.

Duisburg, Essen, Univ. Diss., 2003. / Computerdatei im Fernzugriff.

Duisburg, Essen, Univ. Diss., 2003. / Computerdatei im Fernzugriff.

Duisburg, Essen, Universiẗat Diss., 2003.

Regulated progression through the cell cycle is essential for ordered cell proliferation. One of the best characterized tumor suppressors is the retinoblastoma protein pRB, which together with the E2F transcription factors regulates cell cycle progression. In the model organisms Drosophila melanogaster and Caenorhabditis elegans, RB/E2F containing multiprotein complexes have been described as transcriptional regulators of gene expression. This work first describes a homologous complex in human cells named LINC (for LIN complex). It consists of a stable core complex containing LIN-9, LIN-37, LIN-52, LIN-54 and RbAp48. This core complex interacts cell cycle-dependently with different pocket proteins and transcription factors. In quiescent cells, LINC associates with p130 and E2F4. In S-phase cells these interactions are lost and LINC binds to B-MYB and p107. The transient knock-down of LIN-54 in primary fibroblasts, as the depletion of LIN-9, leads to cell cycle defects. The cells are delayed before the entry into mitosis. This effect is due to the fact that the knock-down of LINC components leads to the downregulation of cell cycle genes responsible for the entry into and exit from mitosis as well as for checkpoints during mitosis. These LINC target genes are known E2F G2/M target genes, which are expressed later than the classical G1/S E2F target genes. The transcriptional regulation by LINC is a direct effect as LINC binds to the promoters of its target genes throughout the cell cycle. LINC contains three DNA-binding proteins. E2F4 and B-MYB, which cell cycle-dependently bind to LINC, are known DNA-binding transcription factors. Additionally, it is show here that the LINC core complex member LIN-54 also directly binds to the promoter of a LINC target gene. Although the exact molecular mechanism of LINC function needs to be analyzed further, data in this work provide a model for the delayed activation of G2/M target genes. B-MYB, a G1/S E2F target gene, binds to LINC upon its expression in S-phase. Then only LINC is a transcriptional activator that induces the expression of the G2/M genes. This provides an explanation for the delayed expression of these E2F G2/M target genes. / Die Regulation des Zellzyklus ist unerlässlich für die fehlerfreie Zellteilung. Einer der am Besten charakterisierten Tumorsuppressoren ist das Retinoblastom-Protein pRB, welches zusammen mit den E2F Transkriptionsfaktoren den Zellzyklus reguliert. In den Modellorganismen Drosophila melanogaster und Caenorhabditis elegans wurden Multiproteinkomplexe beschrieben, die pRB und E2F Homologe enthalten und transkriptionell die Expression von Zielgenen regulieren. Diese Arbeit beschreibt erstmals LINC, einen homologen Komplex in humanen Zellen. Der LIN-Kernkomplex besteht aus LIN-9, LIN-37, LIN-52, LIN-54 and RbAp48 und assoziiert zellzyklus-abhängig mit Pocket Proteinen und Transkriptionsfaktoren. In ruhenden Zellen (G0) assoziiert LINC mit p130 und E2F4. In der S-Phase verlassen p130 und E2F4 den Komplex und B-MYB und p107 interagieren mit LINC. Die transiente Depletion von LIN-54, ebenso wie die Depletion von LIN-9, führt zu Defekten im Zellzyklus. Die „knock-down“-Zellen treten verzögert in die Mitose ein. Dies konnte darauf zurückgeführt werden, dass die Depletion von LINC Mitgliedern Gene herunterreguliert, die für den Eintritt in und den Austritt aus der Mitose, sowie für Regulationsprozesse während der Mitose verantwortlich sind. Diese LINC Zielgene wurden bisher als G2/M E2F Zielgene beschrieben, welche verglichen mit klassischen E2F Zielgenen verzögert exprimiert werden. Die transkriptionelle Regulation durch LINC ist ein direkter Effekt, da LINC in G0 und in der S-Phase an die Promotoren seiner Zielgene bindet. LINC enthält drei DNA-bindende Proteine. Die zellzyklus-abhängigen Komponenten von LINC E2F4 und BMYB sind bekannte DNA-bindende Transkriptionsfaktoren. Zusätzlich konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass das LINC Kernprotein LIN-54 direkt an den Promoter eines LINC Zielgens, cdc2, bindet. Obwohl der genaue molekulare Mechanismus für die Funktion von LINC noch genauer untersucht werden muss, liefern Daten in dieser Arbeit ein Modell für die verzögerte Expression von G2/M Genen. B-MYB ist selbst ein E2F Zielgen und bindet an LINC sobald es exprimiert wird. Erst die Assoziation von B-MYB an LINC in der S-Phase macht LINC zu einem transkriptionellen Aktivator G2/M-spezifischer Gene. Dies erklärt die verzögerte Expression dieser E2F G2/M Zielgene.

Aurora B ist eine mitotische Kinase, die entscheidende Funktionen in der Zellteilung ausübt. Aurora B ist außerdem in einer Vielzahl von Krebsarten mutiert oder überexprimiert. Daher ist die Aurora B Kinase ein attraktives Ziel für die Tumortherapie. Gegenwärtig werden Aurora B-Inhibitoren zur Behandlung von soliden Tumoren und Leukämien in verschiedenen klinischen Studien getestet. Es fehlen jedoch Informationen, welche molekularen Mechanismen den beschriebenen Phänotypen wie Zellzyklusarrest, Aktivierung des Tumorsuppressors p53 und seines Zielgens p21 nach Aurora B-Hemmung zugrunde liegen. Hauptziel dieser Arbeit war es die Mechanismen der p21-Induktion nach Hemmung von Aurora B zu untersuchen. Es konnte gezeigt werden, dass nach Hemmung von Aurora B die p38 MAPK phosphoryliert und somit aktiviert wird. Experimente mit p38-Inhbitoren belegen, dass p38 für die Induktion von p21 und den Zellzyklusarrest benötigt wird. Die Stabilisierung von p53 nach Aurora B-Inhibition und die Rekrutierung von p53 an den p21-Genpromotor erfolgen jedoch unabhängig vom p38-Signalweg. Stattdessen ist p38 für die Anreicherung der elongierenden RNA-Polymerase II in der kodierenden Region des p21-Gens und für die Bildung des p21 mRNA Transkripts notwendig. Diese Daten zeigen, dass p38 transkriptionelle Elongation des p21-Gens nach Aurora B Hemmung fördert. In weiteren Untersuchungen konnte ich zeigen, dass die Aurora B-Hemmung zu einer Dephosphorylierung des Retinoblastoma-Proteins führt und dadurch eine Abnahme der E2F-abhängigen Transkription bewirkt. Dies löst indirekt einen Zellzyklusarrest aus. Weiterhin konnte mit Hilfe von synchronisierten Zellen gezeigt werden, dass p21 nach Durchlaufen einer abnormalen Mitose induziert wird, jedoch nicht nach Aurora B-Hemmung in der Interphase. Interessanterweise werden p38, p53 und p21 schon bei partieller Inhibition von Aurora B aktiviert. Die partielle Inhibition von Aurora B führt zu chromosomaler Instabilität aber nicht zum Versagen der Zytokinese und zur Bildung polyploider Zellen. Damit korreliert die Aktivierung des p38-p53-p21-Signalweges nicht mit Tetraploidie sondern mit vermehrter Aneuploidie. Die partielle Hemmung von Aurora B führt außerdem zur vermehrten Entstehung von reaktive Sauerstoffspezies (ROS), welche für die Aktivierung von p38, p21 und für den Zellzyklusarrest benötigt werden. Basierend auf diesen Beobachtungen kann folgendes Modell postuliert werden: Die Hemmung von Aurora B führt zu Fehlern in der Chromosomenverteilung in der Mitose und damit zu Aneuploidie. Dies führt zu vermehrter Produktion von ROS, möglicherweise durch proteotoxischer Stress, hervorgerufen durch die Imbalanz der Proteinbiosynthese in aneuploiden Zellen. ROS bewirkt eine Aktivierung der p38 MAPK und trägt damit zur Induktion von p21 und dem resultierenden Zellzyklusarrest bei. Aneuploidie, proteotoxischer und oxidativer Stress stellen Schlüsselmerkmale von Tumorkrankungen dar. Anhand der Ergebnisse dieser Arbeit könnte die Kombination von Aurora B-Hemmstoffen mit Medikamenten, die gezielt aneuploide Zellen angreifen, in Tumorerkrankungen therapeutisch wirksam sein. / Aurora B is a mitotic kinase that is essential for cell division. Because it is mutated or overexpressed in a range of cancer types, it has been suggested as a novel therapeutic target. Currently chemical inhibitors against Aurora B are in various phases of clinical trials for treatment of solid tumors and leukemia. Information regarding the molecular requirements for the reported phenotypes of Aurora B inhibition such as cell cycle arrest, activation of the tumor suppressor p53 and its target p21 are not well understood. In this study, I investigated the requirements for p21 induction after Aurora B inhibition. I found that p38 is phosphorylated and activated when Aurora B is inhibited. Experiments with chemical inhibitors against p38 indicate that p38 is required for p21 induction and cell cycle arrest in response to Aurora B inhibition. p53 induction after impairment of Aurora B function and the recruitment of p53 to its binding site in the p21 gene promoter occur independently of p38 signaling. Instead, I found that p38 is required for the enrichment of the elongating RNA Polymerase II in the coding region of the p21 gene. Furthermore, p38 is required for formation of the full-length p21 mRNA transcript. These data indicate that p38 promotes the transcriptional elongation of p21 gene in response to Aurora B inhibition. In further experiments I could show that the p21 causes cell cycle arrest due to a decrease in E2F-dependent transcription by promoting the dephosphorylation of the retinoblastoma protein. Using synchronized cells I could show that the induction of p21 in response to Aurora B inhibition requires transition through an aberrant mitosis and does not occur in cells that are arrested in interphase. Interestingly, p38, p53 and p21 are already induced by partial inhibition of Aurora B, which results in aneuploidy but not in cytokinesis failure and in tetraploidy. This supports the notion that activation of p38-p53-p21 signaling correlates with aneuploidy but not with tetraploidy or binucleation. Partial inhibition of Aurora B also leads to increased generation of reactive oxygen species (ROS), which are required for the activation of p38, p21 and cell cycle arrest. Based on these observations I propose the following model: Inhibition of Aurora B leads to chromosome missegregation resulting in aneuploidy. This results in increased generation of ROS (reactive oxygen species) possibly through proteotoxic stress caused by an imbalance of protein synthesis in aneuploid cells. ROS triggers the activation of p38, which then stimulates the transcriptional elongation of p21 resulting in cell cycle arrest. Aneuploidy, proteotoxic stress and oxidative stress are hallmarks of cancer cells. Based on my results reported in this study, I suggest that the combination of Aurora B inhibitors with drugs that specifically target aneuploid cells might be a novel strategy for cancer therapy, as this is a lethal combination for proliferation of cancer cells.

Marburg, Univ., Diss., 2001

Stuttgart, Univ., Diss., 2002.

Würzburg, Univ., Diss., 2008. / Zsfassung in dt. Sprache.

Würzburg, Univ., Diss., 2008. / Zsfassung in dt. Sprache.