Die angeborene Zwerchfellhernie (CDH) ist eine Fehlbildung der Lungen und des Zwerchfells die weltweit 1:2500 Neugeborene betrifft. Die Morbidität (100%) und Mortalität (ca. 30%) der CDH sind weiterhin hoch und Neugeborene werden direkt nach der Geburt intubiert und intensivmedizinisch behandelt. Insbesondere die Unterentwicklung der Lungen (pulmonale Hypoplasie) und das Remodelling der Pulmonalarterien (pulmonale Hypertension) ist für die hohe Sterblichkeit verantwortlich. Während der Zwerchfelldefekt sicher und minimalinvasiv verschlossen werden kann, gibt es aktuell keine medikamentöse pränatale Therapie zur Verbesserung des Lungenwachstums. Zur Entwicklung neuer therapeutischer Ansätze ist ein besseres Verständnis der zugrundeliegenden Pathophysiologie essentiell. Allerdings konnte bislang nicht etabliert werden, welche molekularen Signalwege in CDH-Lungen verändert sind, um diese als therapeutische Targets zu modulieren. In der vorliegenden Arbeit konnten wir mithilfe eines etablierten Tiermodels und humanen Stammzellen, welche aus Trachealaspiraten isoliert wurden, zeigen, dass in CDH-Lungen pro-inflammatorische Signalwege angereichert sind. Zudem waren Proteinprofile in CDH-Lungen im anerkannten „Nitrofen-Ratten“ Modell für CDH pro-inflammatorisch verändert. Im Epithel der Luftwege war vor allem STAT3 deutlich erhöht, und die Inhibition von STAT3 in fötalen hypoplastischen Lungen führte zu einer Korrektur des abnormalen Wachstums in vitro. Vergleichbare pro-inflammatorischen Veränderungen wurden auch in epithelialen Vorläuferzellen aus Trachealaspiraten von humanen CDH-Patienten nachgewiesen. Bei der transkriptionellen und epigenetischen Analyse dieser epithelialen Vorläuferzellen, welche die Luftwege auskleiden und in funktionelles Epithel differenzieren, wurden Anreicherungen im Interferon- und NF-kB-Signalweg beobachtet. Dieses pro-inflammatorische Programm der Vorläuferzellen war assoziiert mit einer defekten Differenzierung in spezialisierte Zellen des Bronchialepithels. Die Modulation dieser Signalwege führte zur Normalisierung der CDH charakteristischen epithelialen Defekte. Diese Epitheldefekte, welche bei der Differenzierung der Vorläuferzellen in vitro beobachtet wurde, konnten wir auch in histologischen Präparaten von verstorbenen CDH-Föten nachweisen und damit die Validität unserer Assays bestärken. Zusammenfassend konnten wir einen neuen und therapeutisch relevanten Signalweg der Lungenhypoplasie bei CDH aufzeigen.:1. Einleitung 2 1.1 Angeborene Zwerchfellhernie 2 1.2 Nitrofen-CDH-Modell 3 1.3 Pränatale Intervention 4 1.4 Proteomics-Analyse von CDH-Lungen 4 1.5 Tracheal-Aspirate basierte neonatale Lungenforschung 5 1.6 Tracheal-Aspirate basierte CDH-Forschung 6 1.7 Ziele der Arbeit 7 2. Publikationsmanuskripte 2.1 Arbeit 1: “Proteomic Profiling of Hypoplastic Lungs Suggests an Underlying 8 Inflammatory Response in the Pathogenesis of Abnormal Lung Development in Congenital Diaphragmatic Hernia.” Wagner et al., Annals of Surgery, 2022. Impact Factor: 13.9 2.2 Arbeit 2: “A tracheal aspirate-derived airway basal cell model reveals a 20 proinflammatory epithelial defect in congenital diaphragmatic hernia.” Wagner et al., American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine, 2023. Impact Factor: 30.6 3. Zusammenfassung 34 4. Literaturverzeichnis 43 5. Anlagen 45 5.1 Erklärung über den wissenschaftlichen Beitrag des Promovenden zur Arbeit 45 5.2 Erklärung über die eigenständige Anfertigung der Arbeit 46 5.3 Lebenslauf 47 5.4 Danksagung 57

Die angeborene Zwerchfellhernie (congenital diaphragmatic hernia, CDH) ist eine Erkrankung von Neugeborenen, welche mit signifikanten Störungen der Lungenentwicklung einhergeht. Insbesondere die assoziierte pulmonale Hypoplasie und pulmonal arterielle Hypertension stellen die Therapie noch immer vor enorme Herausforderungen. Trotz langjähriger Forschung ist der Pathomechanismus der angeborenen Zwerchfellhernie nicht ausreichend verstanden. Mithilfe des international anerkannten Nitrofen Ratten Modells konnten wir in der vorliegenden Arbeit neue Erkenntnisse der pathobiologischen Vorgänge der Lungenentwicklung bei angeborener Zwerchfellhernie generieren. Im Gegensatz zu vorherigen Experimenten nutzen wir u.a. proteomanalytische Methoden, um eine Vielzahl krankhaft veränderter Signalwege zu detektieren. Dabei wurden fötale Lungen in späten pränatalen Stadien der Lungenentwicklung auf ihr Proteinexpressionsmuster untersucht. Insbesondere die Proteine Tenascin C, CREB-binding protein (CREBBP) sowie Signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) waren in CDH-Lungen signifikant verändert. Tenascin C war deutlich reduziert, wohingegen CREBBP und insbesondere STAT3 eine erhöhte Expression aufwiesen. Die Expressionsminderung von Tenascin C bei angeborener Zwerchfellhernie konnten wir in humanen CDH-Lungen bestätigen. Mithilfe von Immunfluoreszenzfärbungen konnte die Expressionssteigerung von STAT3 insbesondere in den bronchialen Epithelzellen dargestellt werden. Wir nutzten ein ex-vivo Modell hypoplastischer Lungen, um den zuvor identifizierten pathologisch veränderten STAT3 Signalweg näher zu untersuchen. Dazu erfolgte die Isolation und in-vitro Kultivierung fötaler Rattenlungen an Tag 15 der embryonalen Entwicklung. Die externe Applikation des Herbizids Nitrofen führte dabei erwartungsgemäß zur Induktion einer pulmonalen Hypoplasie, angezeigt durch eine Abnahme der peripheren Lungenverzweigungen, sowie zu einer Zunahme der peripheren Mesenchymstärke. Auf Proteinebene zeigte sich in den hypoplastischen Lungen eine Aktivierung des STAT3 Signalweges durch eine signifikante Zunahme von phosphoryliertem STAT3 (pSTAT3). Die Applikation des spezifischen STAT3-Inhibitors S3I-201 erzielte eine Korrektur des Lungenwachstums und eine Normalisierung der STAT3 Phosphorylierung. STAT3 und dessen Aktivität ist dieser Arbeit zufolge in CDH-Rattenlungen krankhaft erhöht und die spezifische Inhibition von STAT3 verbessert im ex-vivo hypoplastischen Lungen-Modell das Lungenwachstum signifikant.:Inhaltsverzeichnis BIBLIOGRAPHISCHE BEZEICHNUNG 1. Einführung 1 1.1. Krankheitsbild 1 1.2. Tiermodell 2 1.3. Physiologische Lungenentwicklung 3 1.3.1. Morphologische Entwicklung der Lunge 3 1.3.2. Molekularbiologische Ebene der Lungenentwicklung 4 1.4. Abnormale Lungenentwicklung bei CDH 7 1.5. „Lung explant“ Modell der Lungenhypoplasie 9 1.6. Ziele der Arbeit 10 2. Publikationsmanuskript 11 2.1. Abstract 11 2.2. Methods 12 2.3. Results 13 2.4. Discussion 17 2.5. References 20 2.6. Supplements 22 3. Zusammenfassung der Arbeit 23 4. Referenzen 28 5. Anlagen 33 5.1 Erklärung über den wissenschaftlichen Beitrag des Promovenden zur Publikation 33 5.2. Erklärung über die eigenständige Anfertigung der Arbeit 35 5.3. Curriculum Vitae 36 5.4 Danksagung 39

Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Anwendung der sonographischen Lungenbiometrie in der Pränataldiagnostik zur Erkennung einer Lungenhypoplasie. Im ersten Abschnitt wurden anhand definierter Messebenen Normwerte für verschiedene biometrische Parameter (Durchmesser, Länge) der fetalen Lunge erstellt. Im zweiten Abschnitt wurde diese Meßmethode mit Hilfe eines Hochrisikokollektivs (N=29) für die intrauterine Entwicklung einer Lungenhypoplasie hinsichtlich ihrer prognostischen Aussagekraft untersucht. Es konnte nur eine sehr geringe Sensitivität und Spezifität der verschiedenen Messebenen festgestellt werden. Die Vierkammerblickebene wies mit Werten für die Sensitivität von 57% und 44 % sowie für die Spezifität von 42 % und 50 % noch die höchste Validität auf. Eine Fehlbildung, die typischerweise mit der Ausbildung einer Lungenhypoplasie einhergeht, ist die kongenitale Zwerchfellhernie. Da die beschriebenen Messebenen bei dieser Fehlbildung nur schwer zu verwenden sind, wurde in der Literatur ein neuer Parameter, die Lung-to-Head-Ratio, in die pränatale Diagnostik eingeführt. In einem dritten Abschnitt wurde die Lung-to-Head-Ratio (LHR) prospektiv in ihrer prognostischen Aussagekraft bei 18 Feten mit isolierter Zwerchfellhernie untersucht. Neben dem Outcome (Überleben) wurden auch neonatale Ventilationsparameter sowie das Risiko der Entwicklung einer pulmonalen Hypertonie untersucht. Für die LHR konnte kein signifikanter Einfluß auf das Outcome gefunden werden. Es konnte kein signifikanter Zusammenhang zwischen der pränatal bestimmten Lungengröße und dem postnatalen Verlauf der Beatmungsparameter bzw. dem Risiko der Entwicklung einer pulmonalen Hypertonie gefunden werden. Die sonographische Erkennung einer Lungenhypoplasie ist möglich. Mit den derzeit vorhandenen Messebenen ist jedoch eine Einschätzung der Prognose einer Lungenhypoplasie pränatal nicht möglich. Die Ergebnisse unterstützen die Überlegungen, dass die kongenitale Zwerchfellhernie ein sehr komplexes Krankheitsbild ist, welches in seinem Schweregrad nicht nur durch einen Parameter (Lungengröße) eingeschätzt werden kann. / This study analysed the application of the sonographic lung biometry on the prenatal detection of pulmonary hypoplasia. The first chapter defined sonographic levels for the measurement of different biometric parameter (diameter, length) of the fetal lung. The second chapter analysed the application of this method regarding its predictive value in a group with high risk for developing pulmonary hypoplasia (N=29). The sensitivity and specificity of the various measurement levels was low. The level of the four chamber view had the highest validity with a sensitivity of 57 % and 44 % and with a specificity of 42 % and 50 %. The congenital diaphragmatic hernia is a malformation which typically develope pulmonary hypoplasia. The above described measurement levels are difficult to reproduce in congenital diaphragmatic hernia. Therefor a new biometric parameter has been introduced in the literature, the lung-to-Head-Ratio (LHR). In the third chapter the LHR was analysed concerning the evaluation of the prognosis in 18 fetuses with isolated diaphragmatic hernia. The following parameters were examined: outcome of the fetuses; neonatal ventilation parameters; occurance of pulmonary hypertension. There was no significant correlation between the LHR at time of diagnosis of the diaphragmatic hernia and these parameters. The prenatal detection of a pulmonary hypoplasia using the method of sonographic lung biometry is possible. But it is not possible to predict the severity of pulmonary hypoplasia in these cases. It would seem that the lung is a too complex organ for it to be prognostically judged only by measuring a single biometric parameter.